[보고서]편도유래 줄기세포에서 근골격계 재생을 위한 세포 분화기술 확립 및 유효성 분석

정성철

보고서 정보

주관연구기관

이화여자대학교
Ewha Womans University

연구책임자

정성철

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-12

과제시작연도

2019

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202300013268

과제고유번호

1711082311

사업명

바이오.의료기술개발(R&D)

DB 구축일자

2023-10-25

키워드

편도유래줄기세포.분화.골세포.근육재생.골다공증.tonsil-derived stem cells.differentiation.osteocyte.muscle regeneration.osteoporosis.

표 편도에서 분리 및 확보된 세포의 MSC로써의 특성을 조사. A. MSC의 positive (CD73, CD90, CD105)와 negative (CD14, CD34, CD45) 발현 확인. B. TMSC의 골, 연골, 그리고 지방 분화로의 특징 확인.
표 편도줄기세포의 근육세포로의 분화과정.
표 분화된 근육세포의 conditioned medium (CM)을 모아 Cytokine Array로 분석 결과. T-MSC, tonsil-derived mesenchymal stem cell; GM, growth medium; MYOCYTE, T-MSC-derived myocyte; DM, differentiation medium; 1W, 1 weeks after myogenic differentiation; 2W, 2 weeks after myogenic differentiation.
표 편도줄기세포 유래 근육세포에서 분비가 증가된 cytokine의 세포내 유전자 발현. 그림의 caption 은 그림 8과 같음.
표 TMSC를 각각 100 ng/mL의 Activin A와 Shh로 PTH 분비세포로 7일 동안 분화시킨 후 (A) Immunofluorescence (GFP: PTH, Dappi: Nucleus) (B) 분화 후 High (1.5 mM), Normal (0.9 mM), or Low (0.5 mM)의 외부 칼슘농도를 가진 미분화 배양액에서 7일 그리고 14일 동안 연이어 배양한 후 Western blotting을 통한 PTH 단백질 발현양 측정 결과.
표 TMSC를 Activin A와 Shh의 농도를 달리하여, PTH 분비세포로 7일간 분화시킨 뒤 PTH 단백질 발현양 확인 결과.
표 PTH를 100 ng/mL (1), 50 ng/mL (1/2), 10 ng/mL (1/10), or 2 ng/mL (1/50)의 Activin A와 100 ng/mL의 Shh를 배양액에 첨가하 여 PTH 분비세포로 7일간 분화한 뒤 단백질 발현양 조사 결과. (A) PTH, (B) CHGA
표 TMSC를 각각 100 ng/mL의 Activin A와 Shh를 첨가한 조건이 외 다양한 배양조건에서의 PTH분비세포로 7일간 분화 후, 연이어 2주 더 배양 후의 단백질 발현양 측정 결과. (A) PTH, (B) CHGA, (C) CaSR.
표 TMSC를 High or Low Glucose가 함유된 DMEM에서 Activin A의 농도를 달리하여 7일 동안 분화시킨 뒤 PTH 단백질을 발현양 측정 결과.
표 Microarray를 통한 편도줄기세포 유래 부갑상선분비세포의 분화배양액 별 특성 탐색. A. D7 vs C7, B. D14 vs C14. 그림의 caption은 그림 12와 같음.
표 TMSC를 추천된 농도로 펩타이드를 처리하여 14일 동안 분화시킨 후 칼슘 침착도 결과
표 TMSC를 다양한 농도의 펩타이드를 처리하여 14일 동안 분화시킨 후, 칼슘 침착도를 대조군과 비교한 결과 (Error bar는 +/- standard error bar로 표기함).
표 (A) 펩타이드 4를 TMSC에 농도별 (10 uM~1 pM)처리하여, 골분화를 촉진시킨 후, 칼슘 침착도 를 대조군과 비교한 결과. (B) 100 pM의 펩타이드 4로 TMSC의 골분화를 14일 동안 촉진시킨 후 칼슘 침착도와 ALP activity를 대조군 비교한 결과.
표 TMSC를 사용하여, 펩타이드 4의 골분화에 대한 유도/촉진 효과 조사.
표 펩타이드 1과 4가 osteogenesis의 분화마커인, osteocalcin (OCN), osteopontin (OPN), Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), 그리고 alkaline phosphatase (ALP)의 단백질 발현양에 끼치 는 영향조사.
표 nanosurface 배양접시에서 분화된 TMSC-myocyte의 펩타이드 첨가 효과
표 분화기간 연장에 따른 T-MSC-myocyte의 세포융합비율의 증가
표 TMSC-myocyte의 기능성 골격근세포로의 분화능의 확인 (A) Real-time PCR을 이용한 AchR유 전자의 발현 증가를 확인 (B) Western blotting을 이용한 AchR와 GLUT4단백질의 발현 증가를 확인 (C) 면역형광염색을 통한 AchR단백질의 세포 내 발현 학인
표 분화기간 연장에 따른 TMSC-myocyte의 AchR와 GLUT4의 발현 증가. A. 웨스턴블랏팅을 통한 AchR와 GLUT4발현의 변화 확인: (1) TMSC, (2) TMSC-myoblast, (3) TMSC-myocyte 2w, (4) TMSC-myocyte 3w, (5) TMSC-myocyte 4w. B. 면역형광염색을 통한 AchR발현의 확인: Green (acetylcholine receptor, AchR); Blue (DAPI)
표 Insulin첨가에 따른 TMSC-myocyte에서의 GLUT4의 발현 증가. A-D. 웨스턴블랏팅을 통한 GLUT4와 관련 신호전달물질의 단백질 발현: None (무처리군); Insulin (인슐린 첨가군). E. 면역형광 염색을 통한 GLUT4 발현의 확인: Green (Glucose Transporter Type 4, GLUT4); Blue (DAPI); x200. F. Insulin signaling pathway leading to GLUT4 translocation in muscle.
표 PAX7의 발현을 통한 줄기세포의 근육세포로의 잠재성 확인 (A) TMSC: 미분화 세포에서 발현 하다가 분화 후 발현이 소멸 됨 (B) AdMSC: 분화 전/후 세포에서 모두 발현율이 매우 낮거나 비특 이적 발현을 나타냄.
표 편도유래줄기세포와 지방줄기세포의 골격근세포로의 분화능 비교. Dystrophin, MHC, α-SMA: 근육세포 마커. α-Actinin, Myogenin: 골격근세포 특이적 마커. 편도유래줄기세포유래 골격근세포, TMSC-myocyte; 지방줄기세포유래 골격근세포, AdMSC-myocyte; : Pax7, paired box protein 7; MHC, myosin heavy chain; α-smooth muscle actin, α-SMA
표 골지지체에 혼입하기전 편도 줄기세포의 배양조건에 따른 골형성 유전자 발현 분석결과
표 1×106의 TMSC를 HA:DMEM의 비율을 1:1 (total 200uL) 그리고 1:2 (total 300 uL)로 혼합 하여 (A) 세포와 HA의 혼합력을 현미경으로 관찰한 결과. (B) 섞은 혼합물을 쥐의 피하에 주사한 뒤, 다음날 쥐의 피하에 주사된 혼합물을 빼내어 형태와 보존도를 관찰한 결과.
표 A. 1×106의 PTH분화 그리고 미분화 TMSC를 Alginate-based scaffold에 enscapsulation 한뒤, 16G 니들로 주입한 후 확 인결과 B. 분화/미분화 TMSC의 alginate-based scaffold와 미분화/분화 scaffold-free spheroid 로 제작한 뒤, 7일동안 DMEM에 culture하여, live (calcein) & death (ethidium homodimer) 를 사용하여 확인한 결과. C. scaffold와 spheroid를 주사한 위치와 D. 각각의 지지체를 사용한 PTH분비 TMSC를 마우스에 이식한 뒤 12주 뒤 지지체의 남아있는 여부를 확인한 결 과.
표 마이크로어레이 분석 전, 엑소좀 추출에 사용된 세포들. 화살표: myotube형태, 다핵세포를 가리킴.
표 근육으로의 분화가 진행됨에 따라 발현이 증가하는 miRNA의 근육관련 카테고리 별 선별
표 대퇴부의 Micro-CT 촬영 결과.
표 분화된 편도줄기세포 유래 부갑상선분비세포 A. 유전자 및 B. 단백질 발현 분석결과. C7 D7 & D14, 7 and C14 days after differentiation with differentiation medium
표 편도줄기세포 유래 부갑상선분비세포의 유효성 평가. C7과 D7실험군의 세포를 저농도(L)와 고 농도(H)의 칼슘(Ca2+)에 노출시켜 부갑상선분비 조절이 가능한지 확인.
표 RNA-seq을 사용하여 분석된 골분화된 TMSC의 유전자들을 미분화군과 비교하여, 통계적으로 유의하게 증가/감소 된 유전자들을 여러 방법으로 분석함 (p < 0.05, n=2). A. 찾아낸 유전자들을 DEG analysis를 통하여, 각 functional category로 분류한 결과 B. DAVID 분석툴을 사용하여 찾아낸 유전자들의 functional annotation. C. 골로 분화된 TMSC의 up-regulated된 유전자들을 KEGG pathway analyses를 통하여 분석한 결과. D. 골로 분화된 TMSC의 up-regulated된 유전자들을 KEGG pathway analyses를 통하여 분석한 결과.
표 RNA-seq을 사용하여 분석된 Pep들에 의해 골분화가 촉진된 TMSC의 유전자들을 골분화대조 군과 비교하여, 통계적으로 유의하게 증가/감소 된 유전자들을 DEG analysis를 통하여, 각 functional category로 분류한 결과 (p < 0.05, n=2). A. Pep2/diff. B. Pep3/diff. C. Pep4/diff. D. Peptide에 대한 각각 category에 변화된 유전자들
표 RNA-seq을 사용하여 분석된 Pep들에 의해 골분화가 촉진된 TMSC의 유전자들을 골분화대조군 과 비교하여, 통계적으로 유의하게 증가/감소 된 공통 적인유전자들을 A. Venn Diagram을 사용하여 분석한 결과. B. Pep들에 의하여 공통적으로 확인된 유전자의 정보들 (red font – 공통적으로 확인된 유전자들중 분화에 관련된 유전자들) C. Pep4에 의해 골분화가 촉진된 TMSC의 유전자들을 골분화대 조군과 비교하여, 통계적으로 유의하게 증가/감소 된 유전자들.
표 이식용 TMSC-myocyte의 RFP 발현 확인. A. RFP가 tagging된 TMSC (TMSC-RFP) B. TMSC-RFP로부터 근육세포로 2주 분화 (TMSC-RFP-myocyte 2w) C-D. TMSC-RFPmyocyte 4w
표 이식용 TMSC-RFP-myocyte의 근육세포로의 분화 확인. A. TMSC-RFP-myocyte의 근육관련 유전자 발현: a, TMSC-RFP; b, TMSC-RFP-myocyte; c, hSKM B. 웨스턴블랏팅 기법을 통해 근육 세포로의 4주 분화 동안의 α-SMA의 발현을 RFP의 tagging 전 후 확인 C. B의 그림을 수치화함.
표 이식용 TMSC-RFP-myocyte의 근육세포로의 분화 확인: Blue (DAPI); Green (myosin heavy chain 8, MYH8); Red (RFP) x200.
표 TMSC-RFP-myocyte의 이식을 위한 준비. A. mdx 마우스의 확인 B. 이식 방법과 일정
표 TMSC-RFP-myocyte이식 받은 mdx마우스의 치료효과 확인 A. rotarod test B. foot printing test: wild type (W/T), sham (PBS만을 이식한 그룹), TMSC-RFP-myocyte (PBS와 세포를 이식한 그 룹)
표 TMSC-RFP-myocyte이식 받은 mdx마우스 근육조직의 골격근 관련 단백질의 발현 Blue (DAPI); Red (Dystrophin, Titin, MHC) x200.
표 TMSC-RFP-myocyte를 이식한 mdx마우스 근육조직의 H Left, 왼쪽 비복근
표 분화 그리고 미분화된 TMSC 주사를 경골 근위부로 직접 투여 받은 쥐군들의 첫 투 여 12주 후 혈청 OCN과 ALP농도. (n=10 for normal, no treatment, rhPTH groups; n=5 for TMSC groups.)
표 분화 그리고 미분화된 TMSC injection 를 경골 근위부로 직접 투여받은 쥐군들의 첫 투여 12주 후 혈청 칼슘과 인의 농도. (n=10 for normal, no treatment, rhPTH groups; n=5 for TMSC groups.)
표 양성대조군 그리고 T-MSC의 주사를 받은 실험군들의 대퇴골 Micro-CT결과 그리고 대퇴골의 BMD와 BV/TV의 결과.
표 분화 그리고 미분화된 TMSC 주사를 경골 근위부로 직접 투여 받은 쥐군들의 첫 투여 12주 후 혈청 OCN과 ALP농도. (n=10 for normal, no treatment, rhPTH groups; n=5 for TMSC groups.)
표 여러 Donor에서 온 TMSC를 Activin A 100ng/mL+Shh100ng/mL를 7일간 처리하여 분화시킨 뒤, Western blotting으로 PTH의 단백질 정량 결과. A. 기존에 사용하던 TMSC와 최근에 획득한 TMSC의 부갑상선호르몬 분비세포로 분화시켜 비교한 결과. B. 최근에 구한 2개의 TMSC를 부갑상성호르몬 분 비세포로 분화시켜 비교한 결과. C. B에서 한 같은 조건으로, Donor#1의 부갑상선 호르몬 분비세포로 의 분화시 PTH의 단백질을 다시 한번 확인해본 결과.
표 Donor#1의 TMSC를 1.2x10^6/concave plate (384wells)에 심어서 7일동안 분화 시켜, 3D spheroid를 제작한 결과. A. 7일간 미분화/분화 배지에 배양한 세포들의 형태. B. Western blotting을 사용한 PTH의 단백질 정량결과.
표 T-MSC-myocyte의 전기생리학적 특성 검증. (A) Action potential (B) Average resting membrane potential (RMP) of cells (C) Na+ current (D) Quantified Na+ current density shown as a box plot. (panel and lane a, hSKMCs; panel and lane b, TMSCs; panel and lane c, TMSC-myocyte2w; panel and lane d, TMSC-myocyte3w; panel and lane e, TMSC-myocyte4w)
표 TMSC-myocyte를 mdx mice에 이식한 후 체내 효능 검증. A. 이식 부위인 비복근의 재생을 확인하기 위하여 조직면역염색함. VEGF (red); NF-H (red); α-BTX (green). B. 이식된 TMSC-R-myocyte의 잔류기간과 분포를 확인. HM (green); RFP (red); DAPI (blue); merge (yellow); 배 율 x100. TP, T-MSC-myocyte를 이식한 실험군; Sham, PBS만 이식한 실험군; W/T, wild type (양성대 조군)
표 난소절제술 (ovariectomy; OVX)을 하여, 골다공증모델 제작의 유효성에 대해 검증함 (OVX = ovariectomized mice, Sham = 대조군). A. Weekly weight gain, B. plasma concentration of osteocalcin (OCN), C. MicroCT analyses of femur head; bone mineral density (BMD)　and bone volume (BV) /total volume (TV) percentage ratio
표 TMSC유래 미분화 그리고 PTH분비세포를 Alginate-based scaffold와 shperiod로 지지체 를 제작하여 마우스의 등에 이식한 뒤 12주 후에 이식된 부위를 관찰한 결과.
표 난소절제술(ovariectomy; OVX)을 통하여 제작된 골다공증 마우스 모델에 미분화/분화 TMSC를 제작된 세포운반체(alginate vs scaffold-free spheroid)를 통하여 피하에 이식하고 12주 뒤에, A. average daily gain (ADG), B. serum PTH, C. serum OCN, D. serum inorganic phosphate를 확인한 결 과. Sham (non-OVX), Estrodiol (100 ng/mL of E2/daily), rhPTH (recombinant PTH/daily), cTMSC (미분 화TMSC only), dTMSC (PTH분비 TMSC only), Alginate Only, Alg-cTMSC (cTMSC encapsulated in alginate scaffold), Alg-dTMSC (dTMSC encapsulated in alginate scaffold), sp-cTMSC (cTMSC spheroids), sp-dTMSC (dTMSC spheroid). n=3~5 for each group.
표 난소절제술(ovariectomy; OVX)을 통하여 제작된 골다공증 마우스 모델에 미분화/분화 TMSC를 제작된 세포운반체(alginate vs scaffold-free spheroid)를 통하여 피하에 이식하 고 12주 뒤에, microCT를 사용하여 A. bone mineral density (BMD)와 B. bone/total volume ratio를 확인한 결과. Sham (non-OVX), Estrodiol (100 ng/mL of E2/daily), rhPTH (recombinant PTH/daily), cTMSC (미분화TMSC only), dTMSC (PTH분비 TMSC only), Alginate Only, Alg-cTMSC (cTMSC encapsulated in alginate scaffold), Alg-dTMSC (dTMSC encapsulated in alginate scaffold), sp-cTMSC (cTMSC spheroids), sp-dTMSC (dTMSC spheroid). n=3~5 for each group.

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