초록 ▼

1. 연구개발 목표 및 내용
1) 최종목표 및 내용
▣ 차세대염기서열분석(NGS)을 이용한 중추 신경계 감염 다중 신속 진단법 개발
◾ 최종 목표
○ 뇌수막염 (Meningitis) 역학
- 세균성 수막염의 발병은 백신의 개발 및 보급으로 인해 선진국인 영국과 유럽에서 매년 인구 10만명당 1-2명으로 낮지만, 아프리카의 수막알균 뇌수막염 호발지역인 Sahel 지역에서는 인구 10만명당 1,000명의 높은 발병률을 보임.
- 바이러스성 수막염은 미국에서 매년 인구 10만명당 10명의 환자가 발생하고.

1. 연구개발 목표 및 내용
1) 최종목표 및 내용
▣ 차세대염기서열분석(NGS)을 이용한 중추 신경계 감염 다중 신속 진단법 개발
◾ 최종 목표
○ 뇌수막염 (Meningitis) 역학
- 세균성 수막염의 발병은 백신의 개발 및 보급으로 인해 선진국인 영국과 유럽에서 매년 인구 10만명당 1-2명으로 낮지만, 아프리카의 수막알균 뇌수막염 호발지역인 Sahel 지역에서는 인구 10만명당 1,000명의 높은 발병률을 보임.
- 바이러스성 수막염은 미국에서 매년 인구 10만명당 10명의 환자가 발생하고. 스웨덴의 4세 이하 소아에서는 10만명당 28명의 환자가 발생하여, 세균성 수막염에 비해 매우 흔하게 발생함.
○ 뇌수막염의 원인
- 뇌수막염의 원인은 세균, 바이러스, 진균, 항산균 및 기생충에 걸쳐서 매우 다양함.
- 또한 연령에 따라 호발하는 주요 병원체의 종류가 다름.
○ 뇌수막염 (Meningitis)의 임상 양상 및 예후
- 세균성 뇌수막염의 경우는 신속한 치료가 필요한 응급 질환으로 높은 사망률을 보이며, 사망률은 원인균이나 병원에 따라 다르며 일반적으로 10~30% 정도로 매우 위중한 질환임.
- 동반되는 흔한 합병증으로는 수두증, 경막하 삼출, 뇌실염, 시력 상실, 뇌농양, 뇌경색 등이 있음. 완치된 환자의 30~50%에서 인지 장애, 독서 장애, 미소 뇌장애 등의 후유증이 발생함.
- 국내의 보고에 따르면 1993-2006년에 발생한 세균성 수막염의 합병증 발생률은 38.3%로 매우 높음.
- 따라서 뇌수막염의 신속하고 정확한 진단은 사망률을 낮추고 합병증을 예방하는데 매우 중요함.
○ 뇌수막염 진단
- 뇌수막염은 세균, 진균, 바이러스, 기생충 등의 다양한 병원체에 의해 발생할 수 있으며, 증상에 다른 구분이 쉽지 않음
- 세균, 바이러스, 항산균, 진균 및 기생충의 모든 병원체가 수막염을 유발할 수 있어 매우 다양한 검사를 조합하여 사용하여야 진단이 가능한 경우가 많음.
- 통상적인 미생물 검사로 수막염을 진단하기는 매우 어려우며, 검체를 활용한 신속하고 정확한 새로운 검사 방법의 개발이 요구됨.
○ 분자진단기술을 이용한 다제내성균 진단 기술의 변화 및 한계성
- 감염성 질환의 진단 분야에서 가장 많이 사용되는 PCR 방법은 기존의 배양 및 생화학적 검사 방법이 가지는 단점, 즉, 검사 소요 시간, 민감도 및 특이도, 결과의 정확도, 검사실 감염 위험 등을 극복할 수 있는 검사 방법임.
- 현재 분자진단기술을 이용한 수막염 진단 제품이 몇몇 진단시약 제조사에서 출시되어 있음,
- 그러나 현재까지 개발된 제품들은 매우 다양한 수막염 병원체를 선별하기에는 부족하며, 특히 세균성 수막염의 경우는 치료에 도움이 되는 항균제 감수성을 평가할 수 있는 방법이 없음.
○ 차세대염기서열분석법 (NGS)를 활용한 새로운 검사법의 개발
- 본 연구에서는 최근 급격하게 발전하고 있는 차세대염기서열분석법 (NGS)를 활용한 다양한 수막염 병원체를 검출하는 기술을 개발하려고 함.
- 본 연구진이 보유한 기술은 동시에 100여개의 병원체를 검출할 수 있는 방법으로 이미 호흡기 병원체에 적용하여 선행 연구 결과를 도출한 바 있음.
- 동시에 100여개의 병원체를 선별할 수 있게 되면 수막염을 일으키는 대부분의 병원체가 선별 가능하게 되어 대부분의 환자에서 신속하고 정확한 진단을 통한 최적의 치료를 받을 수 있음
- 또한 S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae 경우는 주요 내성 유전자인 pbp2b, pbp2x, penA, pbp3 및 TEM-1 β-lactamase 등을 분석함으로써 항균제 감수성에 대한 선별이 가능함.
◾ 전체 내용
1차년도는 기술 개발을 위해 실질적으로 기술 개발에 적용할 수 있고, 개선해야하는 기술의 조사, 신속 분자진단 시스템의 세계적인 추세 및 시장 동향을 파악/조사 한다. 또한, 의료 환경에서 필요로 하는 요구 사항을 적용 기술 개발에 적용하도록 한다. 또한 개발된 키트 평가에 사용될 원인 병원체와 임상 검체를 수집한다.
(1세부과제) 연구개발 내용: 진단 키트 개발을 위한 기초 조사로서 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 기술 및 시장 동향 조사 시행, 검사 키트 spec 결정 및 primer design, 키트 평가를 위한 검체 수집 조건 결정 및 수집. 개발한 키트는 검증 및 분석적 성능평가를 시행하고 결과를 2세부에 피드백하여 검사키트 개선 유도.
● 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 기술 및 시장 동향 조사
● 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단을 위한 시장 요구도 조사
● 기초 및 임상 평가를 위한 대상 병원체와 검체 수집 조건 결정
● 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 primer 구성
● 개발된 진단 키트를 이용한 기초 평가 시행 (분석적 민감도, 특이도 평가, LOD 등)
(2세부과제) 연구개발 내용: 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 평가
2세부기관은 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단을 위해 1세부에서 개발 primer와 제품 요구사항을 참고하여 실제 검사 키트를 개발한다.
● 구성된 primer를 사용한 진단 키트 개발
● NGS 결과 해석을 위한 서버 및 DB 구축
(3세부과제) 연구개발 내용: 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 평가 검체 수집
● 뇌수막염 환자에서 분리된 병원체 수집
● 뇌수막염 환자의 양성 검체 수집
● 뇌수막염 환자의 수막염 의심 검사 음성 검체 수집
2차년도는 1차년도에 개발된 기술을 기반으로 생산된 검사 키트를 임상 검체를 사용하여 평가. 평가한 결과를 반영하여 검사 키트의 primer를 재구성하고 고도화. 임상 평가는 수집한 병원체 및 검체를 이용하여 국내외 인증을 위한 가이드라인에 준하는 기준으로 수행. 2세부 기관은 1세부기관에서 시행한 임상 결과를 반영하여 시제품 개선 시행. 3세부 기관은 임상 시험을 위한 병원체 및 검체 수집
(1세부과제) 연구개발 내용 : 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 임상 평가
● 뇌수막염 환자에서 분리된 병원체 평가
● 뇌수막염 환자에서 수집된 양성 검체 평가
● 뇌수막염 증상을 가지고 있으나 검사 음성인 환자의 검체 평가
(2세부과제) 연구개발 내용 : 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 임상 개발
● NGS 검사 해석을 위한 파이프 라인 구축 및 검토
● 분석적 성능 평가와 임상 평가 결과를 바탕으로 검사 키트 개선
(3세부과제) 연구개발 내용: 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 평가 검체 수집
● 뇌수막염 환자에서 분리된 병원체 수집
● 뇌수막염 환자의 양성 검체 수집
● 뇌수막염 환자의 수막염 의심 검사 음성 검체 수집

▣ (연구개발과제1) 차세대염기서열분석(NGS)을 이용한 중추 신경계 감염 다중 신속 진단법 개발
◾ 최종 목표
○ 뇌수막염 (Meningitis) 역학
- 세균성 수막염의 발병은 백신의 개발 및 보급으로 인해 선진국인 영국과 유럽에서 매년 인구 10만명당 1-2명으로 낮지만, 아프리카의 수막알균 뇌수막염 호발지역인 Sahel 지역에서는 인구 10만명당 1,000명의 높은 발병률을 보임.
- 바이러스성 수막염은 미국에서 매년 인구 10만명당 10명의 환자가 발생하고. 스웨덴의 4세 이하 소아에서는 10만명당 28명의 환자가 발생하여, 세균성 수막염에 비해 매우 흔하게 발생함.
○ 뇌수막염의 원인
- 뇌수막염의 원인은 세균, 바이러스, 진균, 항산균 및 기생충에 걸쳐서 매우 다양함.
- 또한 연령에 따라 호발하는 주요 병원체의 종류가 다름.
○ 뇌수막염 (Meningitis)의 임상 양상 및 예후
- 세균성 뇌수막염의 경우는 신속한 치료가 필요한 응급 질환으로 높은 사망률을 보이며, 사망률은 원인균이나 병원에 따라 다르며 일반적으로 10~30% 정도로 매우 위중한 질환임.
- 동반되는 흔한 합병증으로는 수두증, 경막하 삼출, 뇌실염, 시력 상실, 뇌농양, 뇌경색 등이 있음. 완치된 환자의 30~50%에서 인지 장애, 독서 장애, 미소 뇌장애 등의 후유증이 발생함.
- 국내의 보고에 따르면 1993-2006년에 발생한 세균성 수막염의 합병증 발생률은 38.3%로 매우 높음.
- 따라서 뇌수막염의 신속하고 정확한 진단은 사망률을 낮추고 합병증을 예방하는데 매우 중요함.
○ 뇌수막염 진단
- 뇌수막염은 세균, 진균, 바이러스, 기생충 등의 다양한 병원체에 의해 발생할 수 있으며, 증상에 다른 구분이 쉽지 않음
- 세균, 바이러스, 항산균, 진균 및 기생충의 모든 병원체가 수막염을 유발할 수 있어 매우 다양한 검사를 조합하여 사용하여야 진단이 가능한 경우가 많음.
- 통상적인 미생물 검사로 수막염을 진단하기는 매우 어려우며, 검체를 활용한 신속하고 정확한 새로운 검사 방법의 개발이 요구됨.
○ 분자진단기술을 이용한 다제내성균 진단 기술의 변화 및 한계성
- 감염성 질환의 진단 분야에서 가장 많이 사용되는 PCR 방법은 기존의 배양 및 생화학적 검사 방법이 가지는 단점, 즉, 검사 소요 시간, 민감도 및 특이도, 결과의 정확도, 검사실 감염 위험 등을 극복할 수 있는 검사 방법임.
- 현재 분자진단기술을 이용한 수막염 진단 제품이 몇몇 진단시약 제조사에서 출시되어 있음,
- 그러나 현재까지 개발된 제품들은 매우 다양한 수막염 병원체를 선별하기에는 부족하며, 특히 세균성 수막염의 경우는 치료에 도움이 되는 항균제 감수성을 평가할 수 있는 방법이 없음.
○ 차세대염기서열분석법 (NGS)를 활용한 새로운 검사법의 개발
- 본 연구에서는 최근 급격하게 발전하고 있는 차세대염기서열분석법 (NGS)를 활용한 다양한 수막염 병원체를 검출하는 기술을 개발하려고 함.
- 본 연구진이 보유한 기술은 동시에 100여개의 병원체를 검출할 수 있는 방법으로 이미 호흡기 병원체에 적용하여 선행 연구 결과를 도출한 바 있음.
- 동시에 100여개의 병원체를 선별할 수 있게 되면 수막염을 일으키는 대부분의 병원체가 선별 가능하게 되어 대부분의 환자에서 신속하고 정확한 진단을 통한 최적의 치료를 받을 수 있음
- 또한 S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae 경우는 주요 내성 유전자인 pbp2b, pbp2x, penA, pbp3 및 TEM-1 β-lactamase 등을 분석함으로써 항균제 감수성에 대한 선별이 가능함.
◾ 전체 내용
1차년도는 기술 개발을 위해 실질적으로 기술 개발에 적용할 수 있고, 개선해야하는 기술의 조사, 신속 분자진단 시스템의 세계적인 추세 및 시장 동향을 파악/조사 한다. 또한, 의료 환경에서 필요로 하는 요구 사항을 적용 기술 개발에 적용하도록 한다. 또한 개발된 키트 평가에 사용될 원인 병원체와 임상 검체를 수집한다.
(1세부과제) 연구개발 내용: 진단 키트 개발을 위한 기초 조사로서 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 기술 및 시장 동향 조사 시행, 검사 키트 spec 결정 및 primer design, 키트 평가를 위한 검체 수집 조건 결정 및 수집. 개발한 키트는 검증 및 분석적 성능평가를 시행하고 결과를 2세부에 피드백하여 검사키트 개선 유도.
● 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 기술 및 시장 동향 조사
● 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단을 위한 시장 요구도 조사
● 기초 및 임상 평가를 위한 대상 병원체와 검체 수집 조건 결정
● 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 primer 구성
● 개발된 진단 키트를 이용한 기초 평가 시행 (분석적 민감도, 특이도 평가, LOD 등)
(2세부과제) 연구개발 내용: 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 평가
2세부기관은 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단을 위해 1세부에서 개발 primer와 제품 요구 사항을 참고하여 실제 검사 키트를 개발한다.
● 구성된 primer를 사용한 진단 키트 개발
● NGS 결과 해석을 위한 서버 및 DB 구축
(3세부과제) 연구개발 내용: 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 평가 검체 수집
● 뇌수막염 환자에서 분리된 병원체 수집
● 뇌수막염 환자의 양성 검체 수집
● 뇌수막염 환자의 수막염 의심 검사 음성 검체 수집
2차년도는 1차년도에 개발된 기술을 기반으로 생산된 검사 키트를 임상 검체를 사용하여 평가. 평가한 결과를 반영하여 검사 키트의 primer를 재구성하고 고도화. 임상 평가는 수집한 병원체 및 검체를 이용하여 국내외 인증을 위한 가이드라인에 준하는 기준으로 수행. 2세부 기관은 1세부기관에서 시행한 임상 결과를 반영하여 시제품 개선 시행. 3세부 기관은 임상 시험을 위한 병원체 및 검체 수집
(1세부과제) 연구개발 내용 : 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 임상 평가
● 뇌수막염 환자에서 분리된 병원체 평가
● 뇌수막염 환자에서 수집된 양성 검체 평가
● 뇌수막염 증상을 가지고 있으나 검사 음성인 환자의 검체 평가
(2세부과제) 연구개발 내용 : 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 임상 개발
● NGS 검사 해석을 위한 파이프 라인 구축 및 검토
● 분석적 성능 평가와 임상 평가 결과를 바탕으로 검사 키트 개선
(3세부과제) 연구개발 내용: 차세대염기서열분석(NGS)를 이용한 중추신경계 감염 (뇌수막염) 진단 키트 평가 검체 수집
● 뇌수막염 환자에서 분리된 병원체 수집
● 뇌수막염 환자의 양성 검체 수집
● 뇌수막염 환자의 수막염 의심 검사 음성 검체 수집

▣ (연구개발과제2) 차세대염기서열분석(NGS)을 이용한 중추 신경계 감염 다중 신속 진단법 평가
◾ 최종 목표
중증 호흡기 감염 질환 관련 병원체에 대한 Real-time PCR Platform 기반 multiplex kit 개발을 위하여 아래 기재된 병원체(target)의 프라이머 디자인 및 밸리데이션 진행함. 해당 프라이머를 이용하여 NGS기반 진단 키트 개발의 가능성을 타진하기 위해 선행 연구를 진행함. 해당 선행 연구에서는 singleplex primer (단일 프라이머) 및 multiplex primer set (다중 프라이머 세트)를 이용하여 한번의 실험으로 다수의 박테리아 및 바이러스 검출이 가능한지 확인함.
◾ 전체 내용
- Primer 디자인 및 제작 : Singleplex 및 multiplex 실험에 사용될 프라이머 제작. 각 target에 특유적인 프라이머 (forward + reverse primer)를 디자인 및 제작. 총 20개의 병원체에 대한 프라이머 디자인 및 제가함. Singleplex의 경우 하나의 target에 대한 forward와 reverse primer만사용함. Multiplex의 경우 20개의 target에 대한 프라이머들을 섞어 multiplex primer set를 제작 후 사용함.
- Library kit : Dxome Library Preparation kit 사용. NGS 분석에 필요한 데이터를 확보하기 위해 Dxome Library Preparation Kit를 사용하여 증폭된 산물에 Illumina사의 시퀀서에 적합한 adapter를 부착 후 시퀀싱 진행 및 NGS 데이터 확보.
- NGS data analysis : 확보된 NGS 데이터를 blast를 이용하여 해당 target이 검출됐는지 확인

▣ (연구개발과제3) 차세대염기서열분석(NGS)을 이용한 중추 신경계 감염 다중 신속 진단법 평가 검체 수집
◾ 최종 목표
중추신경계감염(Central nervous system infections) 진단법 평가를 위한 검체수집 - 뇌수막염 진단을 위하여 분자 및 미생물 검사 의뢰된 검체 중 양성결과를 보인 검체와 음성 검체를 수집하여 연구 개발품 검증, 평가에 사용하도록 한다.
◾ 전체 내용
1. 중추신경계감염 검사법을 확인하고 대상 검사를 지정함
① 세균성 뇌수막염 다중 PCR
② 바이러스성 뇌수막염 다중 PCR
③ Human herpes virus 6 PCR
④ Enterovirus PCR
⑤ 뇌척수액 세균배양검사
⑥ Filmarray ME panel
2. 대상검체
- 뇌수막염(meningitis) 진단을 위해서 검사 의뢰된 뇌척수(CSF) 검체를 대상으로 함
- 대상검사에 양성인 CSF 검체
- 타 검사에서 감염 징후가 있으나 음성결과를 보인 CSF 검체
- 음성대조와 추가분석을 위해서 검사 음성검체도 함께 수집함
3. 검체수집 절차
- 대상검사 양성결과 확인하기 위한 전산프로그램 개발
- 매일 대상검체 리스트를 확인하여 CSF 검체를 1.8 mL cryotube에 옮겨 –70도에서 보관함
- 기존에 추출된 DNA 역시 cryotube로 옮겨 –70도에서 보관함
- 수집된 검체는 NGS 실험 전까지 Deepfreezer에서 보관함
- 음성인 검체도 향후 실험을 위해서 함께 수집하여 양성검체와 동일한 조건에서 보관함
- 보관된 검체에 대한 정보를 리스트에 기록함(성별, 연령, 검체종류, 접수일, 검사결과 등)
4. 검체운송
- 공인된 바이오물류 업체를 통해서 평가기관에 검체 전달
- 검체정보는 excel에 작성하여 전달

(출처 : 요약문 3p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 3
• 목차 ... 10
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 11
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 11
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 32
• 1) 연구수행 결과 ... 32
• 2) 목표 달성 수준 ... 40
• 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 41
• 5. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 41
• 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 42
• 7. 참고문헌 ... 42
• 끝페이지 ... 42