초록 ▼

□ 연구 목표 및 내용
◼ 최종 목표
본 연구는 여태껏 많이 연구되지 않았던 리소좀 유전자의 전사 조절 기작을 4D 뉴클레옴 연구 방법을 통해 독창적으로 규명하고자 함. 스트레스 신호에서 염색질 3차 구조의 변화를 연구하여 신호 전후의 전사 네트워크의 능동적인 조절 기전을 규명하는 것을 연구 목표로 함. 또한, 규명한 리소좀 전사 네트워크의 4D 뉴클레옴 연구를 통해 리소좀 이상에 기인한 질환들(리소좀 축적질환, 암, 퇴행성 뇌 질환 등)의 새로운 치료 표적을 발굴하는기반을 제공할 것을 기대함

◼ 전체 내용<

□ 연구 목표 및 내용
◼ 최종 목표
본 연구는 여태껏 많이 연구되지 않았던 리소좀 유전자의 전사 조절 기작을 4D 뉴클레옴 연구 방법을 통해 독창적으로 규명하고자 함. 스트레스 신호에서 염색질 3차 구조의 변화를 연구하여 신호 전후의 전사 네트워크의 능동적인 조절 기전을 규명하는 것을 연구 목표로 함. 또한, 규명한 리소좀 전사 네트워크의 4D 뉴클레옴 연구를 통해 리소좀 이상에 기인한 질환들(리소좀 축적질환, 암, 퇴행성 뇌 질환 등)의 새로운 치료 표적을 발굴하는기반을 제공할 것을 기대함

◼ 전체 내용
스트레스 상황에서 리소좀 대표 전사인자 및 히스톤 후성 유전 정보 확립
◾ 신규 리소좀 전사인자 및 히스톤 후성 유전 정보 발굴
◾ 스트레스 상황에서 리소좀 유전자의 전사 조절에 영향을 주는 대표 전사 인자와 히스톤 후성 유전 정보를 선별
◾ 선별된 전사인자와 히스톤 후성 유전 정보가 염색질의 어느 위치에서 관찰되는지를 ChIP-sequencing을 통해 확인
◾ RNA-sequencing을 통해 얻은 전사체(transcriptome) 정보와 통합하여 해당 전사인자가 리소좀 유전자 조절 기작에 어떻게 관여하는지 확인
스트레스에 따른 염색질의 접근성 및 활성도 변화 확립
◾ 스트레스 상황에서 염색질의 접근성 변화 및 활성도를 확인하기 위해 ATAC-sequencing을 진행. 이를 통해 리소좀 유전자의 프로모터뿐만 아니라 근처 염색질 부분의 접근성 및 활성도의 변화도 관찰
◾ 전 년차에서 확보한 염색질 정보와 통합하여 각각의 전사인자 및 히스톤 후성 유전 정보에 따른 염색질의 접근성 및 활성도의 상관관계를 분석
◾ 통합된 정보를 통해 각각의 리소좀 유전자의 후보 인핸서 규명
◾ BHLH가 어떻게 H3K27 탈 아세틸화에 관여할 수 있는지 분자적 조절 기작 규명
스트레스에 따른 염색질-염색질 결합의 변화를 통해 염색질 3차 구조 규명
◾ 염색질-염색질 간의 결합을 관찰할 수 있는 Hi-C(High-throughput chromosome conformation capture)를 통해 염색질의 3차 구조를 규명 및 리소좀 유전자들의 프로모터-인핸서 결합(EPI)이 어떻게 변화하는지 확인
◾ BHLH 및 탈 아세틸화 효소의 염색질 내에서의 결합 여부 및 자세한 기작 규명
◾ BHLH 전사인자의 in vivo 역할 연구를 위한 BHLH KO 쥐 제작
◾ BHLH 전사 조절 네트워크 규명 및 치료 목적 질병 발굴
◾ 리소좀 전사인자 스크리닝을 통한 추가 전사인자 발굴
통합적인 리소좀 전사 조절 네트워크 규명
◾ 이전 단계에서 수집한 전사인자와 히스톤 마커 정보, 염색질 접근성 정보, 염색질-염색질 결합 정보를 통해 종합적인 리소좀 전사 조절 네트워크를 구축 및 중요 전사인자 및 히스톤 후성 유전 정보를 확립 BHLH과 MiT/TFE family 전사인자와의 관계성 규명
◾ 스트레스 상황에서의 BHLH 상위 조절 기작 규명
◾ 장기 특이적인 녹아웃을 위한 BHLH flox/flox 쥐 제작
◾ 리소좀 전사인자 스크리닝에서 발굴한 추가 전사인자들의 선별
리소좀에 의한 질병들의 전사 조절 네트워크 규명 및 치료 표적 제시
◾ 구축한 리소좀 전사 조절 네트워크를 바탕으로 리소좀 이상에 기인한 질환에서 문제가 되는 인핸서 및 전사인자와 히스톤의 후성 유전 정보를 파악
◾ 인핸서의 활성도를 조절할 수 있는 CRISPR-dCas9 기술을 이용하여 질환에 따른 염색질 조절을 통한 치료제 개발을 위한 기반 연구를 진행

◼ 1단계
❏ 연구 목표
스트레스 상황에서 리소좀을 조절하는 전사인자 및 히스톤 후성 유전 정보를 확립하며 염색질의 구조적 특징인 염색질의 접근성 및 활성도, 염색질-염색질 간의 결합 정보를 확보하여 전체적인 염색질 조절 네트워크를 구축하는 것을 목표로 함
❏ 연구 내용
스트레스 상황에서 리소좀 대표 전사인자 및 히스톤 후성 유전 정보 확립
◾ 본 연구는 리소좀의 전사 조절에 관여하는 전사인자 및 히스톤 후성 유전 정보를 발굴하기 위해 여러 후보 단백질의 녹아웃 연구를 통해 리소좀의 새로운 조절인자를 찾고자 함
◾ 여러 후보 단백질 중 BHLH 단백질을 녹아웃한 세포의 경우 리소좀의 개수 및 크기가 증가함
◾ BHLH 단백질이 없을 때 전사가 증가되는 유전자들의 경우 히스톤 활성마커인 H3K27 아세틸화가 증가함
◾ BHLH ChIP-sequencing 데이터 분석을 통해 대부분의 BHLH가 리소 좀 유전자의 프로모터 부분에 결합함
◾ 포도당이 결핍됨에따라 BHLH의 결합 정도가 감소함
◾ ChIP-sequencing 및 RNA-sequencing 결과에서 얻은 BHLH의 타겟 후보 유전자들은 오토파지 및 리소좀 유전자들이 가장 많이 존재하며, BHLH가 결손 시 발현이 증가함
스트레스에 따른 염색질의 접근성 및 활성도 변화 확립
◾ ATAC-sequencing을 통해 BHLH 전사인자가 없을 때 다수의 염색질의 접근성이 증가함
◾ BHLH ChIP-sequencing과 RNA-sequencing 결과와 통합하여 BHLH가 직접 결합하는 부위에서 염색질 접근성이 변하며, BHLH가 없을 때 더 접근성이 증가되고 유전자의 발현도 증가함
◾ 해당 염색질 위치에서 BHLH가 없을 때 H3K27Ac이 확연히 증가함
◾ BHLH 전사인자와 결합하는 단백질에 대한 protein-protein interaction(PPI) 분석을 통해 NURD 탈 아세틸화 복합체가 결합함
스트레스에 따른 염색질-염색질 결합의 변화를 통해 염색질 3차 구조 규명
◾ Hi-C 결과를 이용하여 리소좀 유전자의 전사시작부위(Transcription Start site; TSS)를 기점으로 프로모터-인핸서 결합(EPI)을 볼 수 있는 virtual 4C 데이터를 확보
◾ BHLH 및 NURD complex들의 ChIP-sequencing 분석을 통해 BHLH를 중심으로 NURD 탈 아세틸화 복합체들이 잘 결합함
◾ Individual ChIP 실험을 통해 BHLH가 없을 때 탈아세틸화 효소 HDAC1의 결합이 감소하는 것을 확인하였으며 H3K27 아세틸은 증가하는 것을 통해 BHLH와 탈 아세틸화 효소의 상관관계를 확인함
◾ BHLH의 KO 쥐를 제작하였으나 whole-body KO의 경우 정상적인 KO이 태어나지 않음을 확인함
◾ BHLH 쥐가 태어나지 않지만 태아기 13.5일까지는 생존함을 확인하였으며, 이때 몸 전체적으로 리소좀의 활성이 올라감
◾ 알파1-항트립신 결핍증의 치료 방법으로 BHLH를 억제가 효과있는지 확인하기 위해 GFP-ATZ가 발현되는 세포에서 BHLH 단백질을 억제하였을 때 ATZ aggregate가 감소함

◼ 2단계
❏ 연구 목표
전 단계에서 확보한 리소좀을 조절하는 전사인자 및 후성 유전 정보와 염색질의 구조적 특징을 통합하여 리소좀 전사 조절 네트워크를 규명하고자함. 구축한 리소좀 전사 조절 네트워크를 활용하여 리소좀 이상에 기인한 질환들 (리소좀 축적질환, 암, 퇴행성 뇌 질환 등)의 새로운 치료 표적을 제시하는 것을 최종 목표로 함
❏ 연구 내용
통합적인 리소좀 전사 조절 네트워크 규명
◾ BHLH 및 다른 전사인자와 히스톤 마커 정보, 염색질 접근성 정보, 염색질-염색질 결합 정보를 통해 종합적인 리소좀 전사 조절 네트워크를 구축하고자 함
◾ BHLH의 ChIP-sequencing을 이용하여 결합하는 DNA 서열을 분석하였을 때 리소좀 유전자의 CLEAR 모티프에 결합하는 것을 확인함. CLEAR 모티프의 경우 리소좀에서 매우 잘 알려진 전사인자인 TFEB, TFE3, MITF가 속한 MiT/TFE family 전사인자에 의해 활성화된다는 것이 알려짐. BHLH가 같은 DNA 서열에 결합하면서 억제하는 반대의 작용을 하므로 두 전사인자 간의 관계성 규명이 필요함. 같은 서열에 결합함으로써 경쟁적 관계를 보인다면 매우 흥미로운 결과로 예상함
◾ BHLH 조절을 통해 리소좀 전사 조절 네트워크를 조절하기 위해서는 스트레스 상황에서 BHLH의 결합이 감소하는 것에 대한 상위 조절 기작의 연구가 필요함
◾ BHLH KO 쥐는 태어나기 전에 죽기 때문에 추가적인 in vivo 연구를 위해서는 장기 특이적인 녹아웃을 제작해보는 것이 필요함. BHLH flox/flox 쥐를 제작을 진행 중이며 완성되는 대로 장기 특이적인 녹아웃 마우스를 확보하고자 함
◾ ENCODE ChIP-seq을 이용한 리소좀 전사인자 스크리닝을 통해서 발굴한 추가 전사인자들에 대하여 리소좀 유전자 발현에 영향을 주는지 확인하고자 함
리소좀에 의한 질병들의 전사 조절 네트워크 규명 및 치료 표적 제시
◾ 퇴행성 뇌 질환, 리소좀 축적 질환이나 알파1-항트립신 결핍증과 같은 리소좀 관련 질병에서의 BHLH 및 리소좀 전사 조절 네트워크와의 연관성을 보고자 함
◾ CRISPR-dCas9 기술을 이용한 유전자 발현 조절 기술을 이용하여 해당 염색질 접근성 조절을 통해 리소좀 유전자들의 발현 조절을 하고자 함
◾ BHLH 저해를 통해 알파1-항트립신 결핍증에 대한 치료 효과를 확인하고자 함
◾ BHLH 녹아웃 태아의 간에서 리소좀의 확연한 증가가 관찰되었기에 우선 간 특이적 BHLH 녹아웃 쥐를 제작하여 표현형을 보고자 함
◾ BHLH 저해를 질병 치료에 사용하기 위해서는 저해 약물 스크리닝이 필수적임. 전사인자인 만큼 DNA와의 결합을 방해할 수 있는 약물이나 탈아세틸화 복합체와의 결합을 막는 약물을 찾는 과정이 필요함

□ 연구성과
정성적 성과
1단계 연구를 통해 리소좀의 전사조절에 중요한 전사인자인 BHLH를 발굴하였으며, ChIP-sequencing, RNA-sequecing, ATAC-sequencing을 통해 스트레스 상황에서의 BHLH의 리소좀 전사 조절 기작 및 염색질 구조 변화에 대한 정보를 확보함. BHLH가 탈 아세틸화 복합체를 통해 히스톤 후성 유전 정보를 조절하여 염색질의 접근성을 조절할 수 있음을 여러 생화학적 실험을 통해 증명함. 1단계에 목표로 했던 연구 목표를 모두 달성할 수 있었음
2단계에서는 1단계에서 구축한 데이터를 이용하여 통합적인 리소좀 전사 조절 네트워크를 규명하고자 하며, 이를 활용하여 리소좀 이상에 기인한 질환들 (리소좀 축적질환, 퇴행성 뇌 질환, 알파1-항트립신 결핍증 등)의 새로운 치료 표적을 제시하는 것을 최종 목표로 함
정량적 성과
1단계동안 공부한 내용을 정리하여 스트레스 상황에서의 리소좀 및 오토파지의 후성 유전적 조절에 대해 정리한 리뷰 논문을 Cell Death & Differentiation 저널에 게재하였으며, 연구 결과를 2021년 Epicypher 학회 및 2023년 KSBMB 국제 학회에서 포스터 발표를 하였음. 2023년 KSBMB 국제학회에서는 Young Scientist Program에 선정되어 구두발표로 본 연구를 발표하였으며 우수발표상을 수상하였음
2단계에는 본 연구가 완성되는 시점에서 결과물은 정리하여 high-profile 저널에 투고할 계획임. 또한 중요한 발견물은 특허를 통해 지식재산권을 보호하고자 함

□ 연구성과의 활용 계획 및 기대 효과
염색질 3차 구조는 비교적 최근에 기술이 개발되고 있는 만큼 아직 유전자 전사 조절 기작을 설명하는 데 있어서 드물게 사용됨. 하지만 최신 연구들에 따르면 염색질 3차 구조를 통한 전사 조절 연구는 정확한 전사 조절 기작을 설명하는 데 있어 매우 중요한 역할을 할 것으로 생각하며 다양한 질병 기작을 이해하는데 도움이 될 것이라 함
특히 리소좀 분야에서는 인핸서를 통한 전사 조절 기작의 중요성이 최근 밝혀졌음. 스트레스 상황에서 염색질 3차 구조 규명을 한다면 지금까지 설명하지 못한 많은 현상을 설명할 수 있을 것이며, 더 나아가 축적된 많은 후성 유전체 데이터들과 통합을 통해 더 완벽한 리소좀 전사 조절 네트워크를 제시할 것으로 생각함
리소좀 신호 조절에 문제가 생겼을 때 암 발생 및 퇴행성 뇌 질환뿐 아니라 바이러스 감염과의 연관성이 보고되었으며 여러 질병의 새로운 치료제표적으로서 연구되고 있음. 하지만 대부분의 연구는 세포질에서 일어나는 리소좀 현상에만 집중하고 있으므로 근본적인 치료가 어려움. 리소좀에 의한 질병들의 전사 조절 네트워크를 규명하고 인핸서의 활성 조절을 통한 회복이 가능하다면 향후 새로운 치료제 개발을 위한 기반 연구가 될 것임
연구의 방향과 방법을 체계화하면 리소좀뿐만 아니라 여러 다른 현상들에서의 염색질 3차 구조 변화를 보는 프로토타입 적인 연구가 될 수 있음

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 7
• 1. 연구과제의 개요 ... 8
• 2. 연구과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 8
• 3. 연구과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 15
• 1) 연구수행 결과 ... 15
• 2) 목표 달성 수준 ... 17
• 4. 연구성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 17
• 5. 연구성과의 관리 및 활용 계획 ... 17
• 6. 다음 단계 연구계획 ... 18
• 1) 연구 목표 및 내용 ... 18
• 2) 연구 추진전략 ... 19
• 3) 연구 추진일정 및 기대성과 ... 19
• 4) 다음 단계 연구비 사용계획 ... 19
• 5) 연구 성과의 활용방안 및 기대효과 ... 19
• 끝페이지 ... 27