초록 ▼

※ 연구 목표 및 내용
□ 최종 목표
본 연구의 최종 목표는 비만시 유도되는 비알콜성 지방간(NAFLD)의 진행 과정에서 지방 축적 억제와 항염증반응을 매개하는 TBK1 작용 기전 및 기능을 규명함으로써 NAFLD 진단마커 및 치료제 개발의 핵심 기반 지식 확립하고자 함. 이를 위한 세부 연구목표는 다음과 같음.

(1) TBK1을 통한 ACSL1 유비퀴틴화 조절에 따른 간세포 지방대사 조절 기전 규명
(2) TBK1에 의한 간세포 내 mitophagy 조절능 및 이로 인한 염증반응 조절능 연구

※ 연구 목표 및 내용
□ 최종 목표
본 연구의 최종 목표는 비만시 유도되는 비알콜성 지방간(NAFLD)의 진행 과정에서 지방 축적 억제와 항염증반응을 매개하는 TBK1 작용 기전 및 기능을 규명함으로써 NAFLD 진단마커 및 치료제 개발의 핵심 기반 지식 확립하고자 함. 이를 위한 세부 연구목표는 다음과 같음.

(1) TBK1을 통한 ACSL1 유비퀴틴화 조절에 따른 간세포 지방대사 조절 기전 규명
(2) TBK1에 의한 간세포 내 mitophagy 조절능 및 이로 인한 염증반응 조절능 연구

□ 전체 내용
■ 연구의 필요성 및 연구목표

○ 본인의 선행연구를 통해 TBK1이 ACSL1의 미토콘드리아로의 이동을 촉진함으로써 지방산 산화를 매개하여 간조직 내 지방축적을 억제할 수 있음을 밝힘 (Cell Metabolism, 2020, 32(6):1012).

○ 하지만 ACSL1의 활성도 및 미토콘드리아로의 이동조절 기전에 대해 거의 알려진 바가 없으므로 이에 대한 심층적 연구가 필요.

○ 또한, 간세포 특이적 TBK1 결핍 (liver-specific TBK1 knock-out, LTKO) 생쥐의 간조직 내 미토콘드리아의 수적 증가에도 불구하고 지방산 산화능은 억제되었으며 이에 대한 기전 및 역할에 대해 밝혀진 바 없음.

○ 본 연구는 LTKO 생쥐 모델 또는 CRISPR-Cas9을 이용한 TBK1 결핍 간세포주를 이용하여 다음과 같은 두 세부 연구주제를 진행하고자 함.

(1) TBK1 의존적 ACSL1 유비퀴틴화를 통한 지방산 산화 촉진 기전
(2) TBK1에 의한 mitophagy를 통한 미토콘드리아의 수적 조절 기전 및 이로 인한 간조직 내 염증반응에 미치는 효과를 규명

○ 본 연구결과는 NAFLD 제어를 위한 새로운 치료전략 개발을 위한 핵심적 기반 지식을 제공하는데 기여하고자 함.

■ 세부 연구주제

(1) TBK1을 통한 ACSL1 유비퀴틴화 조절에 따른 간세포 지방대사 조절 기전 규명
● ACSL1의 유비퀴틴화 특성/역할/위치 규명 (1차년도)
● ACSL1 유비퀴틴화 매개 E3 ligase 발굴 및 조절능 연구 (4차년도)
● TBK1과 발굴한 E3 ligase 상호작용을 통한 ACSL1 기능 조절 및 지방간 발병 억제능 조사 (5차년도)

(2) TBK1에 의한 간세포 내 mitophagy 조절능 및 이로 인한 염증반응 조절능 연구
● TBK1이 간세포 내 mitophagy에 미치는 영향 연구 (2차년도)
● TBK1에 의한 mitophagy 조절 기전과 그로 인한 간세포 염증반응 조절능 연구 (3차년도)

□ 1단계
◎ 연구 목표
■ 1차년도 연구목표
세부연구주제 1. TBK1과 ACSL1 유비퀴틴화
< ACSL1의 유비퀴틴화 특성/역할/위치 규명 >
● ACSL1의 유비퀴틴화 특성(K48, K63-linked ubiquitination 포함) 규명
● ACSL1 유비퀴틴화의 역할 조사
● ACSL1에 의한 지방산 산화능을 조절하는 유비퀴틴화 위치 동정

■ 2차년도 연구목표
세부연구주제 2. TBK1에 의한 간세포 내 mitophagy 및 염증반응 조절
< TBK1이 간세포 내 mitophagy에 미치는 영향 연구 >
● 미토콘드리아 스트레스 모니터링 시스템 구축
● 미토콘드리아 스트레스에 의한 TBK1 활성 조절 조사
● TBK1 결핍 간세포주를 이용하여 mitophagy 활성 및 조절 기전 분석

■ 3차년도 연구목표
세부연구주제 2. TBK1에 의한 간세포 내 mitophagy 및 염증반응 조절

● TBK1 활성에 의한 adaptor protein 활성 조절 및 역할 규명
● TBK1에 의한 mitophagy와 세포사멸 및 염증반응 조절 조사
● NASH 동물 모델에서 TBK1을 통한 mitophagy 역할 검증

◎ 연구 내용
■ 1차년도 연구내용
세부연구주제 1. TBK1과 ACSL1 유비퀴틴화
< ACSL1의 유비퀴틴화 특성/역할/위치 규명 >
① K48R/K63R ubiquitin과 ACSL1을 과발현하여 K63-linked 유비퀴틴화가 ACSL1 기능 조절에 중요 역할을 할 수 있음을 발견.
② ACSL1 유비퀴틴화 후보 위치 mutant를 분석한 결과 ACSL1의 단백질 발현도를 조절할 수 있음을 관찰함.
③ 지방산 산화능 비교분석을 통해 ACSL1에 의한 지방산 산화에 중요한 유비퀴틴화 위치를 동정함.

■ 2차년도 연구내용
세부연구주제 2. TBK1에 의한 간세포 내 mitophagy 및 염증반응 조절
< TBK1이 간세포 내 mitophagy에 미치는 영향 연구 >
① 미토콘드리아 스트레스에 의한 depolarization 분석 시스템을 구축.
② 세포내 구획 분리를 통해 스트레스 자극에 따라 미토콘드리아에서 TBK1 활성이 증가할 수 있음을 규명함.
③ CRISPR-Cas9 system을 이용하여 TBK1 knockout 세포주를 제작하여 TBK1 결핍시 손상된 미토콘드리아가 축적될 수 있음을 발견함.
④ TBK1 결핍시 mitophagy의 감소는 lysosomal 활성 저해와 연관이 있음을 제안함.
⑤ TBK1 결핍시 p62 Ser403 인산화가 거의 보이지 않음을 발견하여 간세포 p62 S403 인산화에 TBK1이 주 매개자일 수 있음을 제안함.

■ 3차년도 연구내용
세부연구주제 2. TBK1에 의한 간세포 내 mitophagy 및 염증반응 조절

① p62 인산화 제어보다 lysosomal activity 조절이 TBK1에 의한 mitophagy 조절의 중요 기전으로 제시함.
② TBK1 결핍시 mitophagy의 감소는 세포사멸 증가를 매개할 수 있으며 염증반응 또한 증가시킬 수 있음을 제안함.
③ AAV8-TBK1을 이용하여 TBK1을 과발현 한 쥐에 NASH 유도시, NASH 증상 (fibrosis 포함) 이 유의미하게 개선됨을 규명함.

□ 2단계
◎ 연구 목표
■ 4차년도 연구목표
세부연구주제 1. TBK1과 ACSL1 유비퀴틴화

● ACSL1 지방산 산화 촉진 유비퀴틴화를 매개하는 E3 ligase 발굴
● TBK1에 의한 E3 ligase 활성도 조절 기전 조사

■ 5차년도 연구목표
세부연구주제 1. TBK1과 ACSL1 유비퀴틴화

● E3 ligase 결핍 또는 과발현된 간세포에서 ACSL1의 기능 변화 조사
● E3 ligase 결핍 또는 과발현된 생쥐에서 지방간 저해 효과 연구
● 생쥐에서 TBK1과 E3 ligase 상호작용에 의한 ACSL1 기능 조절 분석

◎ 연구 내용
■ 4차년도 연구내용
세부연구주제 1. TBK1과 ACSL1 유비퀴틴화


① ACSL1 지방산 산화 촉진 유비퀴틴화를 매개하는 E3 ligase 발굴
● 예비선행연구시 ACSL1 pull-down을 통해 3가지 E3 ligase가 탐색됨.
● 후보 E3 ligase 과발현/knockdown시 ACSL1 유비퀴틴화를 조사하여 ACSL1의 지방산 산화를 촉진하는 E3 ligase를 발굴하고자 함.
② TBK1에 의한 E3 ligase 활성도 조절 기전 조사
● TBK1의 kinase 활성을 통해 E3 ligase 기능 조절 여부와 그 기전을 조사하고자 함.

■ 5차년도 연구내용
세부연구주제 1. TBK1과 ACSL1 유비퀴틴화


① E3 ligase가 결핍/과발현된 간세포에서 ACSL1의 기능 조사
● 간세포에 발굴한 E3 ligase siRNA 또는 과발현을 통한 ACSL1 유비퀴틴화 조절시 ACSL1의 활성도, 미토콘드리아/ER에서의 발현양, 지방산 산화 및 re-esterification 활성도에 미치는 영향을 알아보고자 함.
② E3 ligase 결핍/과발현 생쥐 모델에서 NAFLD 발병 저해 효과 분석
● ASO 또는 AAV를 이용하여 생쥐에 E3 ligase의 양적 조절을 유도한 후 식이에 따른 지방간 발병도를 비교분석 하고자 함.
● TBK1과 E3 ligase 의 상호작용에 의한 ACSL1 기능 조절 조사: E3 ligase의 과발현에 의한 효과가 TBK1 결핍 간세포와 생쥐에서 저해되는지 조사분석함으로써 TBK1에 의한 ACSL1 유비퀴틴화 조절 기전의 생리학적 영향을 조사하고자 함.

※ 연구성과
■ 정성적 성과

< 세부연구주제 1. ACSL1 유비퀴틴화 특성 및 역할 규명 >
① ACSL1은 K63-linked 유비퀴틴화가 주로 관여함을 규명함.
② ACSL1의 유비퀴틴화가 ACSL1 단백질의 발현양을 조절함을 발견.
③ ACSL1에 의한 지방산 산화 촉진을 매개 관련 유비퀴틴화 위치 동정.

< 세부연구주제 2. TBK1에 의한 간세포 mitophagy 및 염증반응 조절 >
① 미토콘드리아 스트레스에 의한 TBK1 활성화 증가 규명
② CRISPR-Cas9 system을 이용하여 확립한 TBK1 결핍 간세포주에서 mitophagy flux 가 억제됨을 규명.
③ TBK1이 p62 인산화를 매개하는 핵심 인자임을 규명하고 TBK1-p62 인산화 축을 통한 mitophagy 조절능 규명
④ TBK1 결핍시 lysosomal activity 저해가 중요한 조절 인자임을 규명
⑤ TBK1의 미토콘드리아 스트레스에 의한 세포사멸 증가와 염증 반응 증가 조절 기능 발견.
⑥ NASH 마우스 모델에서 AAV8-TBK1 과발현을 아용하여 TBK1을 통한 mitophagy 활성 및 NASH 발병 감소 효과 검증

■ 정량적 성과

○ TBK1이 NAFLD 관련 review 논문을 제1저자로 출판하였음. 이를 포함하여 총 5건의 논문을 출판함.
○ 본 연구계획서 내용의 연구결과는 2단계 기간동안 우수 학술지에 최소 2건의 논문 출판을 계획함.
○ 2건의 국제학술대회 초청강연과 3건의 학술대회 포스터 발표를 포함한 학술교류를 통해 TBK1을 통한 NAFLD의 조절 기전에 대해 발표해옴.

※ 연구성과의 활용 계획 및 기대효과
■ 학문과 기술적 측면

○ 본 연구를 통해 TBK1-mitophagy 에 의한 기전 규명 뿐 아니라 in vivo 모델에서 NASH 개선 효과를 새롭게 규명하여 향후 국제 저명학술지에 게재하고자 하며 권위있는 학술대회에서 발표함으로써 관련 연구분야에서 국제적으로 선도적 역할을 할 수 있을 것임.

○ 본 연구실은 간에서 TBK1에 의한 에너지 대사 조절 기전에 관한 연구에서 국제적으로 선도적 위치에 있으며, TBK1에 의한 ACSL1의 기능적 조절 기전 또한 본 연구자에 의해 밝혀진 결과로서 후속연구에 필요한 충분한 선행연구결과와 연구재료를 보유하고 있기에 연구수행의 수월성을 확보하고 있음.

○ 앞으로도 본 연구 계획서상의 연구 수행을 통해 NAFLD의 병리학적 진행과정에서 지방대사와 염증반응의 조절 이상 과정에 대해 포괄적이고 심층적으로 이해하는데 기여할 것임.

■ 경제와 산업적 측면

○ 본 연구결과를 통해 TBK1을 매개로 한 비만성 지방간 및 지방간염을 체계적으로 이해하고 치료 및 예방법 개발을 위한 핵심 지식을 제공할 것임.
○ 뿐만 아니라 이를 바탕으로 지방간 및 지방간염의 진단마커 및 치료제 개발로 이어진다면 국내 바이오/제약 산업 발전에 기여할 것임.

(출처 : 요약문 2p)