[보고서]프로피온산균 유래 chaperonin의 류마티스 관절염 개선 기능성 및 기전 규명

임영희

[국가R&D연구보고서] 프로피온산균 유래 chaperonin의 류마티스 관절염 개선 기능성 및 기전 규명
The functionality and mechanism of a propionic acid bacterium-derived chaperonin on the improvement of rheumatoid arthritis 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	고려대학교 Korea University
연구책임자	임영희
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2024-03
과제시작연도	2022
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
과제관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202400006694
과제고유번호	1711153573
사업명	개인기초연구(과기정통부)
DB 구축일자	2024-09-09
키워드	류마티스관절염.샤페로닌.달빛단백질.프로피온산균.단백질 도킹.rheumatoid arthritis.chaperonin.moonlighting protein.propionic bacteria.protein docking.

초록 ▼

□ 연구개요
류마티스 관절염은 난치성 자가면역질환으로 현재까지 류마티스 관절염을 완치시키는 약물은 없고 현재 사용중인 제제들은 항염증에 의한 면역반응의 정상화에 초점을 맞춘 약물들로 면역반응 조절만으로는 근본적인 치료 효과를 얻지 못하고 있으므로 근본적인 치료를 위한 새로운 표적 및 소재 발굴을 통해 효과적인 예방 및 치료법의 개발이 필요한 상태임. 본 연구의 목적은 파골세포(osteoclast) 분화억제를 류마티스 관절염 치료를 위한 신규 표적으로 활용하여 raw milk 유래 기능성 균주인 Propionibacterium freudenreichii 표면 단백질 중의 60 kDa chaperonin(Cpn60)이 RANKL (receptor activator of nuclear factor-κB ligand)의 receptor인 파골세포 표면의 RANK의 발현을 억제하는 새로운 moonlighting function을 확인하였으므로 Cpn60에 의해 파골 전구세포가 RANKL/RANK 신호전달 경로를 통해 파골세포로 분화되는 것을 억제하는 기전을 규명하고 류마티스 관절염을 개선하는 효과를 증명하여 류마티스 관절염 개선을 위한 기능성 소재 개발에 적용할 수 있는 결과 도출이 목표임.

□ 연구 목표대비 연구결과
1) Chaperonin 60의 파골세포 분화억제에 대한 in vitro 연구
가. P. freudenreichii의 Cpn60 유전자 정보에 의한 recombinant Cpn60 제조 및 특성 확인
나. Cpn60의 파골세포 분화 관련 유전자들의 발현량 감소로 파골세포 분화억제 효과를 확인
다. Cpn60 처리에 의해 파골세포의 분화 마커인 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 효소의 활성이 감소함
2) Chaperonin 60의 파골세포 분화 억제 기전 연구
가. Cpn60이 RANKL와 결합하여 RANK/RANKL complex 형성을 저해함을 확인
나. 단백질 도킹 분석을 통해 Cpn60이 RANKL와 결합하는 amino acid residues 확인함
다. 유전자 오믹스 분석을 통해 Cpn60이 파골세포 분화 관련 신호전달 인자 및 관련 전사인자들의 발현을 유의하게 감소시킴을 확인
라. 유전자 및 단백질 발현 분석을 통해 lipocalin 2가 Cpn60에 의한 파골세포 분화와 관련된 인자임을 확인
마. Cpn60이 RANK/RANKL complex 형성을 저해하여 하위의 신호인자 및 전사인자들의 발현을 억제함으로써 궁극적으로 파골세포 분화를 억제하는 기전을 규명함
3) Chaperonin 60에 의한 관절염 예방 효과 in vivo 효과 검증
가. Collagen-induced arthritis mouse (CIA) model에서 Cpn60 투여에 의해 관절염 질환 지수 감소 및 관절의 변형, 염증 완화 효과 확인
나. Cpn60 투여에 의해 콜라겐 항원 특이적 IgG, IgG1, IgG2 항체 농도 감소 확인
다. Cpn60 투여에 의해 항염증 효과 확인: 염증성 IL-6, TNF-α 발현 감소 및 항염증성 IL-10 발현 증가 확인
라. Cpn60 투여에 의해 CIA 관절에서의 파골세포 분화억제 효과 확인
4) 연구목표대비 연구 결과: 100% 달성

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
1) 연구개발과제의 활용방안
가. Cpn60의 새로운 moonlighting function 확인으로 달빛 단백질의 질병 개선 연구에 활용
나. 류마티스 관절염뿐만 아니라 파골세포와 관련된 골다공증 및 염증성 질환 예방 및 치료등 기능성 확장 연구에 활용
다. 식품용 프로피온산균을 이용한 류마티스 관절염 개선 제품 개발 시 유효성분 및 유효성분에 의한 개선 효과 기전 제시 근거 자료로 활용
라. 류마티스 관절염 개선에 대한 지식재산권 확보에 활용
마. 난치성 자가면역질환인 류마티스 관절염 환자의 치료비 증가에 대한 대책으로 활용
2) 연구개발과제의 기대효과
가. 부작용이 많은 anti-cytokine 의약품의 대체 효과 기대
나. 식·의약 소재로 개발하는데 필수적인 과학적 기전 확보로 인해 기능성 식품소재의 개발뿐만 아니라 기능성 미생물 유래 의약품 산업의 연구 확대로 파급 효과가 기대됨
다. 과학적 기전 규명으로 안전성이 확보된 기능성 균주 유래 단백질의 질병 개선 효과의 극대화 및 소재에 대한 신뢰도 상승이 기대됨
라. 지식재산권 확보로 산업화가 기대됨
3) 연구개발 결과의 중요성
본 연구 결과는 현재 고령화로 인해 증가 추세인 류마티스 관절염을 개선하기 위한 예방 및 치료제 개발에 적용할 수 있는 결과이며 chaperonin 단백질의 새로운 기능성을 발견한 결과로 파골세포 분화억제 및 염증성 질환의 개선에 적용할 수 있는 기전을 규명하였으므로 기능성을 확장하여 연구할 수 있는 파급효과가 큰 연구 결과로 생각됨

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 연구개발의 목적 ... 4
2) 연구개발의 필요성 ... 4
3) 가설 및 최종목표 ... 4
4) 연구범위 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
(1) 1차년도 ... 4
(2) 2차년도 ... 5
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 5
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 5
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 18
3) 목표 달성 수준 ... 18
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 19
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 19
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 19
1) 연구개발과제의 활용방안 ... 19
2) 연구개발과제의 기대효과 ... 19
6. 자체점검표 ... 20
7. 참고문헌 ... 20
끝페이지 ... 31

표/그림 (22)

표 Sequences and purification of the recombinant chaperonin 60 (CPN60). The protein was expressed by transformed into E. coli and purified using an automated protein production system. SDS-PAGE of purified CPN60 (A) and amino acid sequences of CPN60 are capitalized vector sequences underlined (B)
표 Effect of CPN60 on TRAP activity and TRAP(+) cells. Representative images of TRAP staining (100×, scale bar = 100 μm) (A), TRAP(+) cells (B), and TRAP activity (C). The values indicate the mean ± SD of three independent experiments performed in triplicates. ***p < 0.001 vs. control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 vs. RANKL-only treated group, assessed using one-way ANOVA/Tukey HSD analysis
표 Effect of CPN60 on the expression of osteoclast differentiation-related genes. The values indicate the mean ± SD of three independent experiments performed in triplicates. ***p < 0.001 vs. control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 vs. RANKL-only treated group, assessed using one-way ANOVA/Tukey HSD analysis
표 CPN60 binds to RANKL and interferes with the interaction between RANKL and RANK. (A) Maximum concentration of RANKL bound to RANK that was immobilized on chip detected using SPR. (B) Response signals of CPN60 with RANK. (C) Response signals of CPN60 with RANKL. (D) Representative images of triple immunofluorescence staining of CPN60, RANK, and RANKL observed using confocal microscopy; scale bar=2.5 μm. (E) RANK and RANKL co-localization rates analyzed using Leica LAX software. (F) The relative level of RANKL binding to RANK measured using ELISA. The values indicate the mean ± SD of three independent experiments performed in triplicates. **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. control group; ###p < 0.001 vs. RANKL-only treated group assessed using one-way ANOVA/Tukey HSD analysis
표 Docking models. (A) Tertiary structure of the RANK-RANKL complex. (B) Interaction bonds within the RANK-RANKL complex. (C) Tertiary structure of the RANK-RANKL-CPN60 complex. (D) Interaction residues within the RANK/RANKL/CPN60 complex. Green, yellow, and red colors represent RANK, RANKL, and CPN60, respectively. Protein-interacting residues were identified using PDBsum. The images illustrate hydrogen bonds (blue lines), salt bridges (red lines), and non-bonded interactions (orange tick marks) between residues at the protein–protein interface
표 Heatmap and STRING analysis. (A) Heatmap comparing 58 genes (fold change ≥10.0 or ≤0.1, p-value < 0.05, upregulated genes highlighted in red and downregulated genes in green) between the CPN60-treated group and the RANKL-only treated group. (B) STRING analysis of protein interaction networks with a confidence cutoff of 0.4. Proteins are presented as nodes connected by lines, with the thickness representing the confidence level of the interaction
표 Effect of CPN60 on the expression levels of LCN2 and proteins related to osteoclast differentiation. RAW 264.7 cells were treated with RANKL (50 ng/mL) with or without CPN60 for 4 days. (A) Representative images of double immunofluorescence staining of CPN60 and LCN2 observed using confocal microscopy (scale bar = 10 μm). (B, C) Expression levels of the proteins related to osteoclast differentiation measured using western blot (B) and quantified (C). The data represent the mean ± SD of three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 vs. Control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 vs. RANKL-only treated group
표 Inhibition of Lcn2 diminishes the impact of CPN60 on the expression of osteoclast differentiation-related genes and osteoclast differentiation. (A) The heatmap of genes associated with the osteoclast differentiation pathway (fold change 2.0 ≤ or 0.5 ≥, p-value < 0.05; red, significantly upregulated and green, significantly downregulated). (B) STRING analysis of osteoclast differentiation-related protein interaction networks with a confidence cutoff of 0.4. (C) Proteins are presented as nodes connected by lines whose thickness represents the confidence level. RANKL-induced osteoclast formation was measured by TRAP staining; 100×; scale bar = 100 μm. (D) The number of TRAP+osteoclasts. (E) quantification of TRAP activity. (F) RANKL-induced f-actin formation measured using phalloidin staining (600×, scale bar=40 μm). The data indicate the mean±SD of three independent experiments. The significance test was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD; *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001
표 Groups of animals used in this study
표 Effects of CPN60 on the biomarkers for liver damage on CIA mice
표 Effect of CPN60 on collagen-induced arthritis (CIA) in mice. (A) Daily incidence percentage of arthritis. (B) Arthritis scores measured every four days. DBA/1 mice (n = 9/group) were intraperitoneally administrated CPN60 three times a week for 3 weeks before and 8 weeks after the first injection of collagen (day 0). The % of daily incidence and the arthritis score were measured every 4 days for 8 weeks after day 0. (C, D) Representative micro-CT images of (C) knee joints and hind paws and (D) hind paws showing areas of bone erosion (orange). (E) Histomorphometric analysis of bone erosion. (F) Representative H Model: CIA mice treated with PBS; CPN60, CIA mice treated with 0.1 mg/kg CPN60. The data are expressed as the mean ± SEM and were analyzed using one-way ANOVA/Tukey’s HSD method. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 vs. control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 vs. model group
표 Effect of CPN60 on osteoclast differentiation in CIA mice. (A) Representative images of TRAP staining (magnification × 100, scale bar = 0.02 mm). (B) and the number of TRAP+ osteoclasts. TRAP staining was performed on the knee joint section and stained osteoclasts were counted. Data indicate the mean ± SEM and were analyzed by one-way ANOVA/Tukey’s HSD method. **p < 0.01 vs. control group; #p < 0.05 compared vs. model group
표 Effect of CPN60 on immune response induced by collagen injection and levels of inflammatory cytokines in CIA mice. Levels of (A) anti-collagen antibodies and (B) inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 measured using ELISA in the serum, and Il-17 in synovial tissue measured using qPCR. Data represent the mean ± SEM and were analyzed using one-way ANOVA/Tukey’s HSD method. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.000 vs. control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 vs. model group
표 Effect of CPN60 on the expression levels of genes related osteoclast differentiation in CIA model. Data represent the mean ± SEM and were analyzed using one-way ANOVA/Tukey’s HSD method. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.000 vs. control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 vs. model group
표 Characteristics of EVs derived from P. freudenreichii MJ2. Representative scanning electron microscopy images of P. freudenreichii MJ2 and the secretion of EVs (red circle) (A). Transmission electron microscopy images after negative staining of P. freudenreichii MJ2-derived EVs (B). Particle size (mean diameter: 171.86 ± 7.4 nm) (a) and concentration (b) of purified EVs measured using nanoparticle tracking analysis (C)
표 Gene Ontology enrichment and STRING analyses of identified PFEV proteins. The identified proteins of PFEVs belonging to each category were classified into biological process, cellular component, and molecular function groups (A). Interactions between the top 300 proteins on the top Sequest HT score among isolated proteins were mapped using STRING database version 12 (B). The high-confidence cutoff (0.7) represents the minimal required interaction score, and the line thickness shows the quality of the data support. The node color designates the STRING-defined local network cluster (red nodes represent a network cluster associated with gene expression and protein localization; green nodes represent a network cluster associated with the cellular amino acid biosynthetic process and nucleoside monophosphate metabolic process; purple nodes represent a network cluster associated with the TCA cycle and propanoate metabolism; white nodes are others)
표 Inhibitory effects of PFEVs on RANKL-induced osteoclast differentiation. TRAP staining (100×, scale bar = 100 μm) (A), number of osteoclasts (B), and TRAP activity (C). After double immunofluorescence staining of RANK and RANKL, high magnification images of RAW 264.7 cells were taken with Leica TCS SP8 X (4,000×, scale bar = 2.5 μm) (D). RANK and RANKL colocalization rates were analyzed with Leica LAX software (E). The values indicate the mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA/Tukey’s HSD analysis was performed. **p < 0.01 and ***p < 0.001 compared with the control group; #p < 0.05 and ###p < 0.001 compared with the RANKL-only-treated group
표 Effects of PFEVs on the expression levels of osteoclast differentiation-related genes and proteins. Expression levels of the genes were analyzed using qPCR (A, B). Expression levels of the proteins related to osteoclast differentiation were measured using western blotting (C) and quantified (D). The data indicate the mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA/Tukey’s HSD analysis was performed. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 compared with the control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 compared with the RANKL-only-treated group
표 Effect of PFEVs on CIA mice.The DBA/1 mice (n = 8/group) were intraperitoneally administrated PFEVs three times a week for 3 weeks before and 8 weeks after the first injection of collagen (day 0). The arthritis score was measured every 4 days for 8 weeks after day 0. Representative images of mouse paws (A). The % of incidence (B) and arthritis score (C). The synovial inflammation in mouse knee joints was analyzed by H #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 compared with the model group
표 Effect of PFEVs on the expression levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in CIA mice.The protein and gene expression levels of cytokines were measured in CIA mouse serum using ELISA and qPCR, respectively. Protein levels of pro-inflammatory cytokines, IL-6 and TNF-α (A), gene expression levels of IL-17(B), and protein levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10 (C). Expression levels of osteoclast differentiation-related genes (D), OPG/RANKL ratio (E), and MMP9 (F) were measured using qPCR. Data indicate the mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Tukey’s HSD w performed. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 compared with the normal control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 compared with the model group
표 Effect of PFEVs on the expression levels of genes related osteoclast differentiation in CIA mice. Expression levels of osteoclast differentiation-related genes (A), OPG/RANKL ratio (B), and MMP9 (C) were measured using qPCR. Data indicate the mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Tukey’s HSD was performed. *p < 0.05 and **p < 0.01 compared with the normal control group; #p < 0.05, ##p < 0.01, and ###p < 0.001 compared with the model group
표 Effect of PFEVs on hepatotoxicity in CIA mice. Data are represented as mean ± SEM. One-way ANOVA/Tukey HSD analysis was performed. ns, not significant. ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase

과제명(ProjectTitle) :	-
연구책임자(Manager) :	-
과제기간(DetailSeriesProject) :	-
총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
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연구내용(Abstract) :	-
기대효과(Effect) :	-

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