초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
○ 제1세부과제명: 국내 다발생 PRRSV 병원성 및 면역학적 특성 분석
- 국내 북미형 바이러스 ORF5 염기서열을 통한 계통유연관계 분석결과 국내분리주는 Lineagel(9주) 및 Lineage5(83주)에 속하고 있으며, 한국형 Lineage는 Korean lineageA(33주), Korean lineageB(72주), Korean lineageC(50주)로 구분됨
: 각 lineage별 상동성을 분석한 결과 국내분리주간 NT 79.93%~100% 및 AA 77.61%~100%

5. 최종 연구결과 요약
○ 제1세부과제명: 국내 다발생 PRRSV 병원성 및 면역학적 특성 분석
- 국내 북미형 바이러스 ORF5 염기서열을 통한 계통유연관계 분석결과 국내분리주는 Lineagel(9주) 및 Lineage5(83주)에 속하고 있으며, 한국형 Lineage는 Korean lineageA(33주), Korean lineageB(72주), Korean lineageC(50주)로 구분됨
: 각 lineage별 상동성을 분석한 결과 국내분리주간 NT 79.93%~100% 및 AA 77.61%~100%
- 북미형 5개 Lineage별 증식성이 높은 2주를 선택하여 11주 (총10주 및 prototype 1주)에 대하여 병원성 실험을 실시함(1년차8주, 2년차3주)
: 혈중바이러스역가, 비강배출 바이러스역가, 체온, 체중, 폐렴지수, 항체수준을 종합적으로 분석한 결과 Korean lineageB에 속하는 NA10 및 10D415의 병원성이 높은데 반해 Lineage5에 속하는 바이러스는 상대적으로 병원성이 낮았음
: PBMC에서 면역세포(NK, NKT, Treg, Th1, Th17, CTL 등)를 분석한 결과 병원성이 높은 NA10 및 10D415는 Treg의 활성도가 높았음. CTL의 활성이 낮은 경우 폐병변이 높은 편에 속하였으며, NK 및 NKT 반응은 일자별PT 증감이 바이러스마다 상이하였음
- 국내 유럽형 바이러스 ORF5 염기서열을 통한 계통유연관계 분석결과 국내분리주는 모두 Subtype1에 속하며 Subtype1은 다시 1-A, 1-B, 1-C로 구분됨
: subtype별 상동성 분석 결과 국내분리주간 NT 80.36%~100% 및 AA 78.71%~100%를 보였으며, Subtype 1-A와 1-B의 상동성이 가장 낮았음
- 유럽형 분리주 중 증식성이 높은 2주를 선택하여 (총6주) 병원성 실험을 실시함(2년차 6주)
: 폐렴지수인 경우 3주(EU17, EU35, EU47)가 1-2로 북미형보다는 낮은 것으로 분석됨.
- 3차년도에 실시할 교차면역분석용으로 북미형6주 (10D415, NA10, NA73, 10D149, 11D42, NA45)와 유럽형 1주 (CBNU0495)를 선정함

○ 제2세부과제명: 국내 다발생 PRRSV간 교차방어면역 평가
- 국내 분리바이러스 PRRSV type 2 (10D415, NA10, NA73, 10D419, 11D42, NA45) 6종과 PRRSV type 1 (CBNU0495) 1종에 대하여 국내에 사용 중인 PRRSV type 1 백신 2종에 대한 교차방어면역 평가 실시
- PRRS 음성의 4주령 돼지 30두를 3두씩 총 10그룹으로 나눈 뒤, 각 그룹당 3두는 백신 2ml을 이근부에 근육 접종하고, 3두는 접종 하지 않음. 백신 접종 4주 후 1X10³ TCID₅₀/ml의 각각의 분리주를 양쪽 콧구명에 각 1ml씩 공격접종 실시하고 일자별 시료채취
- 공격접종 전 PRRS type 1 백신 2종 특성평가
• 비백신군에 비해 4종의 백신 접종군 모두 일자별로 증체율이 증가하였으며, A, D 백신접종군의 경우 컨트롤 그룹 및 비백신 그룹에 비해 높은 증체율을 나타냄.
• 모든 백신접종군에서 백신접종 후 4일 이후부터 혈액 내 viremia 가 상승하였으며, 백신접종 14일 이후부터 감소하는 패턴을 보였으나 공격접종일인 백신접종 후 28일 경에도 전체 백신 그룹에서 낮은 수준의 viremia 가 유지되었음.
• 모든 백신접종군에서 백신접종 후 7일부터 혈액 내 PRRSV 특이항체가 형성되었으며, 28일 이후로도 지속적으로 유지되었음
• 면역학적 분석결과 A 백신의 경우 접종 후 28일간 지속적으로 regulatory T cell 이 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였음.
- 공격접종 후 동물실험 결과
• 체온과 lung gross lesion의 경우, 백신그룹과 비백신그룹간의 통계학적으로 유의있는 수준의 차이가 관찰되지 않아 교차방어능 분석효과평가에 제외하기로 하였으며, 공격접종 후 증체량, 혈액 내 viremia 및 Microscopic lesion 으로 교차방어능을 평가하기로 함
• D 백신를 이용한 교차방어능 평가 실험에서 NA42, NA149, NA45를 공격접종그룹에서 비백신 그룹이 백신 접종 그룹보다 낮은 체온이 관찰되었음.
• 공격접종 후 14일 후 증체율을 비교했을 시 C 백신그룹 평가에서 NA149 NA10, NA45 공격접종한 그룹에서 비백신군에 비해 백신군에서 증체율이 증가함.
• A 백신의 경우, NA10, 10D415, NA45, NA42 접종 그룹에서 교차방어능을 나타내었으나, NA10과 10D415의 경우 충분한 방어능은 보이지 않음.
• B 백신의 경우, 10D415, 10D149, NA45, CBNU049에 대해 교차방어능을 나타냄
• C 백신의 경우 NA73에 대해 교차방어능을 나타냄
• C,D 백신의 경우 CBNU0495에 대하여 유효한 수준의 교차방어능을 나타냄
• Microscopic lesion 결과 A vaccine 접종군의 경우 inflammation 수치가 비접종군 및 B백신 접종군에 비해 낮음을 확인할 수 있었음.

○ 제3세부과제명: 국내 상용 PRRSV 항체검사(ELISA) 킷트 효능 평가
- 일반양돈장의 사육단계별 혈청패널 1,053두(2차년도 347두 추가함)를 구축함
- 세계적으로 통용되는 I사 ELISA 킷트를 기준으로 분석한 결과 B사 및 M사의 ELISA킷트는 각각 민감도 95.22%/95.94%, 특이도 96.97%/98.90%, 정확도 95.82%/96.96% 등의 결과를 보였으며, 두 킷트 모두 Kappa 계수가 0.91 및 0.93으로 탁월한(excellent) 일치를 보임
: 북미형11주 및 유럽형 3주를 공격접종 후 일자별 혈청시료를 대상으로 킷트에 적용한 결과 3킷트 모두 접종 14일부터 항체를 검출할 수 있었음
: Lot별 시료의 SP수치의 변동은 1사가 가장 적었으며, B사 및 M사와도 큰 차이는 없었음
: 농장단위 사육단계별 항체모니터링 분석시 3킷트 모두 항체양전 구간 파악이 가능함
- 킷트별 SP값이 상이한 혈청(양음성 상이)을 대상으로 IFA를 실시한 결과 대부분 음성으로 판정되어, 위양성 반응 혈청들에 대해 3개 회사 킷트가 서로 보완적 사용은 결과 도출이 어려움

○ 제4세부과제명: 국내 PRRSV 유전자 진단킷트 효능 평가
- 대학진단기관(5곳) 및 상용 PRRS 유전자 진단킷트 (3개소) 포함 총 8개소를 선정함. 이중 D대학은 상용화된 G사의 킷트를 사용중으로 총 7개의 진단법에 대해 효능평가를 실시함
- 민감도 분석에서 RT-PCR의 EU는 B대학(10^-1 TCID₅₀/100µl)이 가장 높았으며, NA는 A대학, M사 및 B대학 모두 10⁰ TCID₅₀/100µl로 동일함. C대학, 대학, K사, G사/D대학의 real-time RT-PCR인 경우 EU와 NA 모두 10⁰ TCID₅₀/100µl로 동일한 민감도를 보임
- 11주의 북미형 및 4주의 유럽형 바이러스를 공격접종 후 14일과 28일째 수거한 총 141점의 시료 (폐, 편도, 림프)를 7종 진단킷트에 적용한 결과, A대학, B대학, M사, D대학/G사, 대학은 검출률이 비슷하였으나, real-time PCR을 사용하는 K사[14일(92.5%)/28일(88.8%)] 및 C대학[14일(55.7%)/28일(75.2%)]은 상대적으로 검출률이 낮았음
- 동물질병표준 진단요령에 등록되어 있는 conventional RT-PCR외에 시도 및 대학 진단기관 요구에 대비하여 PNA probe를 이용한 real-time RT-PCR을 개발함

(출처 : 요약 1p)

Abstract ▼

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is a widespread viral pathogen that has caused tremendous economic losses in the global swine industry. The continuous evolution of this virus causes difficulties in controlling, preventing, and accurately diagnosing PRRSV. In this study, w

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is a widespread viral pathogen that has caused tremendous economic losses in the global swine industry. The continuous evolution of this virus causes difficulties in controlling, preventing, and accurately diagnosing PRRSV. In this study, we investigated the genetic characteristics of PRRSV-1 and PRRSV-2 circulating in Korea from 2018 to 2020. The ORF5 gene of 38 PRRSV-1 and 47 PRRSV-2 were sequenced and analyzed. Nucleotide sequence analysis showed that the ORF5 of the PRRSV-1 shared 83.33-93.35% of its nucleotide homology with Lelystad virus, and the pairwise nucleotide similarities in the detected PRRSV-1 were 79.49-99.84%. Additionally, the PRRSV-2 had 79.47-93.33% of nucleotide homology with VR2332 virus, and the pairwise nucleotide similarity between PRRSV-2 was 76.05-100% in the ORF5. Interestingly, the 5 strains of PRRSV-2 belonging to the lineage 8 were first reported in Korea. In this study, the strains analyzed showed 96.58-99.00% homology with Fostera PRRS MLV strain. The amino acid sequence analysis showed that these strains were similar with Fostera PRRS MLV strain and American lineage 8 reference strain, but different from Chinese HP-PRRSV. In addition, the decoy epitope and two B cell epitopes (aa 1-15 and 186-200) of glycoprotein 5 (GP5) had evolved under positive selection pressure. The key amino acid substitutions were found in position 102 of GP5 and 70 of membrane protein (M). A total of 85 PRRSV positive strains were detected with two commercial kits used in Korea, one in-house diagnostic method, and World Organization for Animal Health (OIE) recommending diagnostic method. The results show that the three diagnostic methods based on Korean isolates showed high sensitivity, whereas the diagnostic methods based on European and USA isolates showed low sensitivity. The data of this study demonstrate genetic diversity of PRRSV-1 and PRRSV-2, and the first identification of lineage 8 of PRRSV-2 in Korea. In addition, the influence of new genetic variants of PRRSV circulating in Korea on molecular diagnosis was evaluated.

(source : Abstract 54p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• 2. 연구최종목표 ... 6
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재 료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 8
• III. 연구결과 ... 12
• IV. 연구결과요약 ... 49
• V. 고 찰 ... 52
• VI. 참고문헌 ... 53
• Ⅶ. 영문초록 ... 54
• 끝페이지 ... 55