초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
○ 제1세부과제(검역본부): 개 브루셀라 특이 다중항원 제작 및 진단키트 평가
가. 특이항원 조합을 통한 B. canis 다중항원 제작 및 평가
- SSOE-PCR을 이용해 2종(BP26+Omp31) 복합 recombinant DNA를 제작하였으며, Nano scale gene synthesis기법를 이용해 3종(BP26+Omp31+Omp2b) 조합 유전자를 합성하였음.
- 두 조합으로 획득된 2/3종 재조합단백질에 대한 발현 및 정제를 위한 조건 및 기술을 구축 하였으며, 최종 산물의

5. 최종 연구결과 요약
○ 제1세부과제(검역본부): 개 브루셀라 특이 다중항원 제작 및 진단키트 평가
가. 특이항원 조합을 통한 B. canis 다중항원 제작 및 평가
- SSOE-PCR을 이용해 2종(BP26+Omp31) 복합 recombinant DNA를 제작하였으며, Nano scale gene synthesis기법를 이용해 3종(BP26+Omp31+Omp2b) 조합 유전자를 합성하였음.
- 두 조합으로 획득된 2/3종 재조합단백질에 대한 발현 및 정제를 위한 조건 및 기술을 구축 하였으며, 최종 산물의 특이 면역원성 반응을 확인하였음.

나. 다중항원 기반 ELISA의 진단 최적조건 설정 및 효율성 평가
- 제작된 다중항원을 indirect ELISA 진단법에 적용하기 위하여 항원 코팅농도, buffer 조성, 혈청 및 항체 반응농도, 온도/시간 등 반응의 최적조건을 설정하였음.
- 기존 구축된 혈청패널(진양성, 진음성)을 이용하여 조합 항원단백질에 대한 cut-off value, 양성 및 음성 컨트롤을 설정하였음.
- 다중항원 단백질이 코팅된 ELISA법으로 균분리 검사법과의 상관관계를 비교해본 결과 균분리 검사와의 일치율은 3종(95.4%, kappa value(κ)=0.89), 2종(92.6%, κ=0.82)으로 3종 다중항원이 더 높은 일치율을 보였음.
- 기존 3종 단일항원과 비교해보면, 3종 다중항원은 단일항원보다 균분리 검사와의 일치율이 모두 높게 나왔으며, 각 단일항원끼리와의 일치율(91~93%)은 모두 비슷한 수준을 보였음.
- 기존 혈청진단법(2ME-RSAT, ICT)과 일치율 비교 시, 기존 혈청진단법들과 높은 일치율을 보였으며 2ME-RSAT(87.1%)보다 ICT(94.8%)와 더 높은 일치율을 보였음.

다. 야외시료 적용을 통한 효율성 평가 및 교차반응 비교시험을 통한 분석적 특이도 평가
- 야외혈청 패널 적용 시, ELISA 키트의 민감도(Se)는 91.9%, 특이도(Sp)는 96.3%로 각 단일항원보다 높은 민감도와 특이도를 나타냈으며, 균분리 검사와 95.8%(κ=0.81)의 높은 일치율을 보였음.
- 양성과 음성에 대한 감별력이 전반적으로 높았으며, 단일항원들보다 낮은 음성반응이 더 많은 비율을 나타내면서 특이도가 뛰어남이 인정되었음.
- 비특이유발균주(Y. enterocolitica O:9) 및 다른 Brucella균주(B. abortus, B. melitensis) 감염혈청(소, 염소)을 이용해 비교시험해 본 결과 3종 다중항원-ELISA에서는 교차반응이 관찰되지 않았음.

라. 개 브루셀라병 진단키트 시제품에 대한 효율성 및 적용 평가
- 산업체에서 제작한 3종 다중항원 ELISA 키트 시제품을 진양성/진음성 혈청을 이용하여 분석적 효율성을 평가해 본 결과, 민감도 및 특이도가 각각 95.2% 및 95.4%로 확인되었으며, 균분리 검사법과 95.4%의 일치율(κ=0.90)로 높은 상관관계를 나타냈음.
- 신속진단키트 시제품의 분석적 효율성 평가 결과, 민감도 및 특이도가 각각 91.4% 및 100%로 확인되었으며, 균분리 검사법과 88.6%의 일치율(κ=0.77)을 나타냈음.
- 실험실(n=2, 검역본부 및 메디안) 및 시험자(n=2)간 비교시험을 통한 ELISA 키트 및 신속 진단키트의 재현성 검사 결과, 모두 100% 일치율을 보였음.
- 개 바이러스성 주요 질병에 대한 교차반응을 비교하기 위해 4종 질병(CPV1, CPV2, CCoV, CDV) 감염 양성 개혈청(n=26)과 비교 분석해 본 결과, 이들 질병과의 교차반응은 전혀 없었음.
- 번식농장, 동물병원 등에서 확보된 야외시료를 이용하여 ELISA 키트 및 신속진단키트 시제품을 평가해 본 결과, 균분리 검사와 각각 95.2%(κ=0.88, Se 94.4%, Sp 94.6%) 및 89.3%(κ=0.79, Se 92.1%, Sp 87.0%)의 일치율을 보였고, 기존 혈청진단법인 2ME-RSAT와는 각각 84.8% 및 93.0%, ICT와는 각각 92.7% 및 93.0%로 일치율을 보였음.

○ 제2세부과제(산업체): 개 브루셀라병 ELISA 키트 및 신속진단키트 개발
1. 개 브루셀라병 진단용 ELISA 키트 개발
가. 다중항원에 대한 단크론항체 제작 및 평가
- 다중항원을 면역원으로 마우스에 5차 면역 후 단크론항체의 cloning 및 스크린 후 다중항원이 코팅된 ELISA에 적용하여 특이적인 단크론항체를 선발하였음.
- 선발된 단크론항체의 Isotype(G1, Kappa)을 확인하여 항체 특성을 분석하였으며, 혈청학적 교차반응 균주(Salmonella, Yersinia, E coli) 항원과 교차반응성이 없음을 확인하였음.
- 양성표준 대조시약으로 사용할 선발 단크론 항체(mouse IgG)는 개 항체(dog IgG)와 conjugation 한 후 다중항원과 anti-dog IgG (HRP conjugated)의 조합으로 높은 반응성을 보였음.

나. ELISA 키트 시제품 제작 및 성능 평가
- ELISA 키트에 사용되는 capture(다중항원, 1ug/mL) 및 conjugate (2차항체, 25~50ng/mL), 희석액, 세척액, 정지액 조건을 최적화하였으며, 양성대조의 흡광도(OD)는 0.5 이상, 음성 대조는 0.2 미만으로 최적의 조건을 설정하여 키트를 제작하였음.
- 선별 혈청패널을 이용하여 임상적 민감도 및 특이도 평가를 실시한 후 TG-ROC 분석을 통해 판정기준(S/P값 1.0 이상일 경우 양성)을 설정하였음.
- ELISA 키트 시제품의 Lot별 평가를 통한 재현성을 평가해 본 결과, Lot간 높은 상관성 (r2=0.95~0.98)을 나타냈음.
- ELISA 키트시제품의 안정성 평가 결과, 10개월동안 실험군 모두 동일한 판정결과를 보였으며 S/P값의 유의한 변화가 인정되지 않아 보존 후 10개월까지의 안정성을 확인하였으며 장기간 (18개월) 평가를 통한 최종 유효기간을 설정할 예정임.

2. 개 브루셀라병 진단용 고감도 신속진단키트 개발
가. 신속진단용 면역스트립 제작 및 검출한계 설정
- 신속진단키트의 capture/conjugate pair 선별평가 결과, anti-canine IgG 후보 10종 conjugate를 사용하여 스크리닝 후 다중항원(capture)의 최적능도(1.5mg/ml)를 결정하였음.
- 키트 플랫폼을 indirect form과 샌드위치 form으로 비교해 본 결과, 샌드위치 form에서 양/음성 감별이 가능한 반응성을 확인하였음.

나. 신속진단키트 시제품 제작 및 성능평가
- 양성검체의 감도를 개선하기 위하여 Detector는 Gold 입자 대신에 CNB 입자로 결정하였으며, CNB Pad의 OD 0.5일 경우 음성검체의 비특이반응이 약해짐을 확인하였음.
- 키트에 사용할 버퍼의 선별평가 결과, 10종을 스크리닝하여 Tris성분이 포함된 버퍼5를 1차 선정하였고 감도개선 및 비특이반응의 감소를 위해 버퍼5에 1% Tween20 및 0.1% Casein salt를 추가한 버퍼로 최적화하였음.
- 최적화 완료된 키트와 버퍼를 사용하여 표준검체의 반응성을 비교한 결과 타사키트와 비교 하여 양성검체의 감도는 비슷하고 음성검체와 버퍼의 비특이가 없음을 확인하였음.
- 신속진단키트 시제품의 Lot별 평가를 통한 재현성을 평가해 본 결과, 시료에 따라 반응성의 차이는 인정되었으나 최종 판정 결과는 모두 동일함을 확인하였음.

(출처 : 요약 2p)

Abstract ▼

Canine brucellosis is a crucial cause of reproductive failures, including abortion which is the most prominent sign in dogs. Serological tests are most common tools for brucellosis diagnosis, however the definitive diagnosis that pass current widely for canine brucellosis have not been established.

Canine brucellosis is a crucial cause of reproductive failures, including abortion which is the most prominent sign in dogs. Serological tests are most common tools for brucellosis diagnosis, however the definitive diagnosis that pass current widely for canine brucellosis have not been established. Serodiagnosis for canine brucellosis has mainly difficulties due to broad cross-reactivity between the rough cell wall antigens of B. canis and heterospecific antibodies present in normal, uninfected dogs. Therefore, this study was performed to characterize and compare the immunogenic proteins in antigens (Ags) extracted from B. canis, which defined the antigenic specificity of the humoral antibody responses to B. canis-infected dogs. First we extracted and purified a variety of B. canis Ags including hot-saline Ag, cytoplasmic protein Ag (CPAg), TCA-Ag and cell supernatant proteins (CSP). Next, we checked the sort and range of each protein on SDS-PAGE and verified the immunogenic proteins leading to reaction with antisera of B. canis-infected dogs. In an immunoproteomic assay, lots of polypeptides on one or two dimensional electrophoresis (DE) were specifically reacted to antisera from B. canis-infected dogs but rarely not from non-infected dogs. The polypeptide with approximate 60 KDa on 1-DE was commonly recognized at all four kinds of Ags. In the immunoblot profiles on 2-DE, about 20 and 17 protein spots in TCA-Ag and CPAg, respectively, were observed with antisera of infected dogs after excluding spots reacting with non-infected dogs. Interestingly, four immunodominant proteins were detected in CSP, which newly challenge to analyze antigens of B. canis, without any nonspecific reaction with sera in non-infected dogs. Accordingly, this study detected the prominent immunogenic proteins in diverse antigens of B. canis, suggesting that those potential proteins may achieve a specific serodiagnosis for canine brucellosis. Moreover, we will further evaluate the combination of immunodominant proteins from those antigens to support the development of advanced diagnostic methods with high specificity and accuracy.

(source : Abstract 48p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• 2. 연구최종목표 ... 6
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재 료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• III. 연구결과 ... 9
• 1. 제1세부과제: 개 브루셀라 특이 다중항원 제작 및 진단키트 평가 ... 9
• 2. 제2세부과제: 개 브루셀라병 ELISA 키트 및 신속진단키트 개발 ... 23
• IV. 연구결과요약 ... 43
• V. 고 찰 ... 45
• VI. 참고문헌 ... 46
• VII. 영문초록 ... 48
• 끝페이지 ... 49