초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
○ 세부과제명: 소 결핵병에서의 실시간 PCR진단법의 개발 및 유전자추출법 개선
- 다양한 전처리법의 적용 : 최적의 육아종 전처리법 확립을 위해 물리적인 방법 (Snap freezing+ Thawing, boiling), 화학물질 처리(SDS, CTAB, Chelex, Triton-X), Phage, 효소처리(Lysozyme, Lysostaphin, Mutanolysin, 3종 효소 혼합) 등의 조건으로 소결핵병 양성 육아종에 적용하였으며, 그 결과, Snap freezing(급속 냉해동 3회)

5. 최종 연구결과 요약
○ 세부과제명: 소 결핵병에서의 실시간 PCR진단법의 개발 및 유전자추출법 개선
- 다양한 전처리법의 적용 : 최적의 육아종 전처리법 확립을 위해 물리적인 방법 (Snap freezing+ Thawing, boiling), 화학물질 처리(SDS, CTAB, Chelex, Triton-X), Phage, 효소처리(Lysozyme, Lysostaphin, Mutanolysin, 3종 효소 혼합) 등의 조건으로 소결핵병 양성 육아종에 적용하였으며, 그 결과, Snap freezing(급속 냉해동 3회), CTAB. Lysozyme, Lysostaphin, Mutanolysin 처리 구에서 상대적으로 좋은 결과가 확인됨.
- 최적의 전처리법 조합 확인 : 1차실험 결과를 토대로 상대적으로 좋은 효율을 보였던 전처리법을 이용해 종 17개의 실험군을 조합하여 대조군인 PK 단독 처리군, Lysozyme + PK처리군과 비교한 결과, Snap freezing + PK처리군과 Snap freezing + CTAB + Lysostaphin + PK처리군이 가장 안정적인 결과를 나타냈으며, 이 두 가지 방법을 15개 검체에 적용한 결과, Snap freezing+ PK법이 가장 효율이 좋았음(93.3%).
- 시험소에서 사용 중인 결핵병 육아종 전처리법 현황 조사 및 비교 : Snap freezing+PK법과 동물위생시험소에서 사용 중인 5가지 전처리 방법으로 결핵균 분리가 확인된 45개의 육아종 검체에 적용한 결과, 민감도가 37.5~93.3%까지 다양하게 확인되었으며, Snap freezing+PK처리가 미감도가 가장 좋았고(93.3%). 유제액의 원심분리 후 pellet을 버리고 상층액을 이용하여 유전자를 추출하는 방법은 효율이 좋지 않았음(37.5-51.1%). 또한 모든 실험군에서 검체 당 1개의 유제액을 제조했을 때보다 3개 제조했을 때(3개 유제액 중 1개 이상 PCR양성 확인시 양성판정) 민감도가 4.4~22.3% 까지 증가하였음.
- 유전차 추출법 현황 조사 및 비교 : 동물위생시험소에서 육아종 진단에 사용 중인 유전자 추출킷트(5종)를 포함하여 6종 킷트에 의한 추출효율을 비교한 겸과. 민감도가 60.0~100%까지 다양하게 확인되었으며, Magnetic bead 방식으로 조직 전용킷트를 썼을때 효율이 가장 좋았음. 전체적으로 Magnetic bead 방식의 자동화 추출킷트와 Dual Column방식의 추출킷트는 잔여조직과 조직 유래 inhibitor의 영향을 덜 받아 효율이 좋았음. 각 추출방식별 주의사항 등을 전처리법 가이드라인에 반영하였음.
- 육아종 전처리법의 시험소(3개소)현장적용 : 확립뒤 전처리법을 3개 시험소에서 현장적용함. 시험소 담당자가 양성조직 10개를 이용해 시험소와 검역본부 전처리방법으로 각각 처리하였으며, 3개 시험소 모두 검역본부 방법이 시험소 방법 대비 민감도가 최대 30/까지 높았음. 또한 시험소 처리방법 중 조직 처리방법(조직양. 채취 및 처리방법)의 문제점을 확인하였으며, 이를 전처리법 가이드라인에 반영함.
- 결핵 육아종 시료에 대한 표준진단요령 개선 및 시.도 담당자 대상 교육 완료 : 확립된 전처리법과 함께 육아종 조직의 채취-파쇄-유제화-snap freezing-유제액의 lysis 및 DNA추출까지의 과정을 정리하여 표준진단요령 개선안을 마련함. 개선된 전처리법에 대해 시.도 결핵병 담당자 대상 진단 교육을 완료함('20.10.23).
- Real time PCR진단법의 개발 : 소결핵균 특이유전자 중 IS1561, IS6110을 이용하여 Real Time PCR 1종을 제작. 개발된 킷트는 목적유전자 각각 최적의 Tm값에서 증폭되도록 디자인하였음.
- PCR진단법의 민감도비교 : 개발된 PCR 킷트(A킷트)는 모두 시.도에서 사용 중인 Conventioanl PCR(대조군)과 양성조직에 대한 민감도와 표준균주 DNA에 대한 검출한계을 비교하였음. A킷트는 50개 조직에서 민감도 100%(50/50)를 나타냈으며, 대조군(92%, 46/50) 대비 8% 높았음. 결핵균 표준균주 DNA에 대한 검출한계는 A킷트에서 1/8×10⁴까지 대조군에서는 1/10⁴로 확인되어 8배 향상됨.
- PCR진단법의 특이도평가 : 대조군과 A킷트 모두 음성 조직검체(20두)와 소 결핵균 외 기타 균주(조결핵, 요네 등 Mycobacterium spp. 5종 포함 24종 균주)에서 비특이 증폭반응이 확인되지 않았음.

(출처 : 요약 1p)

Abstract ▼

To establish the optimal pretreatment of granuloma from the cattle, physical, chemical and enzymetical methods were tested. Physical method included snap freezing, thawing, boiling and chemical method included SDS, CTAB, Chelex, Triton-X, etc. The enzymatic methods were Lysozyme, Lysostaphin, Mutano

To establish the optimal pretreatment of granuloma from the cattle, physical, chemical and enzymetical methods were tested. Physical method included snap freezing, thawing, boiling and chemical method included SDS, CTAB, Chelex, Triton-X, etc. The enzymatic methods were Lysozyme, Lysostaphin, Mutanolysin, and mixed with all three enzymes. As a result, three repititive snap freezing and CTAB, Lysozyme, Lysostaphin, and Mutanolysin treatment had better results than others. Based on the results of the first experiment, a total of 17 experimental groups were combined using the pretreatment method that showed relatively good efficiency and compared with the control group, snap freezing + PK treatment group showed the most stable results.
The established pretreatment method was applied in 3 laboratories. The person in charge of the laboratory used 10 positive tissues and treated using the pre-treatment method of APQA, The sensitivity of APQA method was up to 30% higher than the conventiomal laboratory method. The training of process from collection of granuloma tissue to DNA extraction was completed.
Real-time PCR was developed using IS1561 and IS6110, the tuberculosis specific genes. The developed kit was designed to amplify the target genes in the optimal Tm value for each target gene. The sensitivity of the developed PCR kit (Kit A) was compared with the conventioanl PCR (control group) using 50 positive tissues. Kit A showed 100% (50/50) sensitivity, which was 8% higher than that of the control group (92%, 46/50).
The detection limit of kit A for the Mycobacterium bovis standard strain DNA was confirmed to be 1/8×10⁴ cells compared with 1/10⁴ in the control group. This meant real time PCR was 8 times more sensitive than conventional PCR. Non-specific amplification reactions in kit A and conventional PCR didn't happen in 20 negative tissue samples and other 24 strains including 5 Mycobacterium spp.

(source : Abstract 33p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구 배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구 배경 ... 3
• 2. 연구 최종목표 ... 5
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 6
• 1. 재 료 ... 6
• 2. 연구전략 및 방법 ... 6
• III. 연구 결과 ... 7
• 1. 제1 세부 과제명 : 소 결핵병 실시간 PCR 진단법의 개발 및 유전자 추출법 개선 ... 7
• IV. 연구결과요약 ... 30
• V. 고찰 ... 31
• VI. 참고자료 ... 32
• VII. 영문 초록 ... 33
• 끝페이지 ... 33