초록 ▼

□ 연구개발 목표 및 내용
◼ 최종 목표
CD40L 타겟에 특이적으로 결합하여 신호전달을 차단하는 Affimer를 엑소좀 표면에 발현하도록 유전적으로 조작한 중간엽 줄기세포주와 엑소좀을 안정적으로 분리할 수 있는 Exodisc 기술을 이용하여 엔지니어링된 엑소좀 치료제 생산공정을 구축하고자 함. 생산된 엑소좀은 뇌의 신경염증 부위로 높은 전달 효율로 이송되어 과도한 면역세포의 활성화를 억제하는 기전을 갖도록 설계되며 이러한 기전을 이용하여 난치성 중추신경계질환인 뇌졸중 치료제로 개발하여 기술이전 하고자 함

◼

□ 연구개발 목표 및 내용
◼ 최종 목표
CD40L 타겟에 특이적으로 결합하여 신호전달을 차단하는 Affimer를 엑소좀 표면에 발현하도록 유전적으로 조작한 중간엽 줄기세포주와 엑소좀을 안정적으로 분리할 수 있는 Exodisc 기술을 이용하여 엔지니어링된 엑소좀 치료제 생산공정을 구축하고자 함. 생산된 엑소좀은 뇌의 신경염증 부위로 높은 전달 효율로 이송되어 과도한 면역세포의 활성화를 억제하는 기전을 갖도록 설계되며 이러한 기전을 이용하여 난치성 중추신경계질환인 뇌졸중 치료제로 개발하여 기술이전 하고자 함

◼ 전체 내용
본 과제의 성공적인 목표달성을 위하여, 각 단계 및 연차별 하기와 같은 목표로 연구개발을 추진하고자 함
○ 1단계 목표: Affimer 발현 엑소좀 엔지니어링 및 랩스케일 생산공정 개발(논문게재 1건 이상 및 국내 특허출원 1건 이상)
1) 1차년도: 엑소좀 엔지니어링 최적 후보도출 및 발현 벡터 선정
2) 2차년도: 엔지니어링된 엑소좀 생산세포주 제작 및 Exodisc 분리 방법 최적화
3) 3차년도: 엑소좀 생산공정 개발, 엑소좀의 in vivo 분포평가

◼ 1단계
❏ 목표
Affimer 발현 엑소좀 엔지니어링 및 랩스케일 생산공정 개발
❏ 내용
○ 1차년도: 엑소좀 엔지니어링 최적 후보도출 및 발현 벡터 선정
1) 엑소좀 후보물질 도출: 엑소좀 외부에 Affimer 발현량 또는 활성 증가 목적으로 엑소좀 엔지니어링 수행. 유전자 construct를 설계하고 발현 및 활성을 평가하여 최적 후보 선정
2) 최적 벡터 도출: 최적 후보 유전자를 탑재한 벡터 스크리닝 후, Affimer 발현 및 활성을 평가하여 최적 벡터를 선정
3) 예상기전 원리도출: Affimer 발현 엑소좀의 컨텐츠를 분석한 후, 예상기전 도출
○ 2차년도: 엔지니어링된 엑소좀 생산 세포주 제작 및 Exodisc 분리 방법 최적화
1) 세포주 제작: 엑소좀 엔지니어링 최종후보 유전자가 도입된 세포주(Research Cell Bank)의 제조 완료
2) 세포주 특성분석: 제작된 세포주가 DW-MSC의 특성을 유지하고 있는지 세포 표면마커 및 secretion 프로파일을 통한 특성분석 완료
3) 생산공정 기초자료 확보: 제작된 세포주를 이용한 배양 및 분리정제에 대한 기초자료 확보
○ 3차년도: 엑소좀 생산공정 개발, 엑소좀의 in vivo 분포평가 (논문게재 1건 이상 및 국내 특허출원 1건 이상)
1) 배양공정개발: 제작된 세포주를 이용하여 엑소좀의 특성 변화없이 생산되는 배양 parameter 도출 및 in process control 항목을 선정
2) 분리 정제공정 개발: 제작된 세포주의 배양액을 이용한 Exodisc 최적 분리 조건 확립
3) 분석법 개발: 엑소좀 및 Affimer의 활성을 평가할 수 있는 in vitro 분석법 및 정량, 확인시험법을 개발하고 엑소좀의 size, particle 수, aggregation 등 생산 엑소좀의 quality control 기준 수립
4) 생산 엑소좀의 in vivo 분포평가: 활성화된 면역세포를 타겟하는 Affimer 발현 엑소좀의 체내분포 평가를 통해 효능평가의 투여 방법 등 결정

□ 연구개발성과
○ 엑소좀 후보물질 도출
1) 엑소좀 엔지니어링을 위해 후보 유전자 총 68종을 설계함
2) 설계 유전자 및 플라스미드 68종 모두 성공적으로 확보
3) 발현 수준 5배 이상 증가 (Western blot 확인)
○ 최적 벡터 도출
1) 벡터 7종 유전자 및 렌티바이러스 벡터 합성 완료
2) 기존 CMV 프로모터 대비 30배 이상 발현증가 확인
3) 신규 발굴 프로모터로 제작된 렌티바이러스를 이용하여 세포주 제작
4) 세포주 조건 선별(항생제, 농도, 처리일) 및 세포 분석법 구축
5) 제작 세포주는 세포의 형태, 크지, 성장 특성, 세포 마커 등 세포의 특성에 영향을 주지 않음
6) Affimer 발현에 따른 세포주 제작 (Monomer, Dimer, Trimer)
○ 예상 작용기전 도출
1) 제작 세포주로부터 엑소좀을 분리하여 miRNA 및 프로테옴 분석 완료
2) 유전자 도입되지 않은 MSC의 엑소좀과 비교하여 Affimer 발현 엑소좀의 내부 contents의 변화 적음. 특히, miRNA의 contents는 변화가 거의 없이 유지되며 뇌졸중에 효과를 가진 miRNA 3종 확인
3) miRNA간 유사 기능을 갖는 cluster 분석 진행중
4) 세포주 제작 및 분석 방법 확립
5) CD40L 발현 세포주 제작 완료
○ 엑소좀 생산세포주 제작
1) 세포 공정지표, particle 생산량, Affimer 발현량 기준 최종 후보 유전자 선정 완료
2) 유전자 도입 조건 (MOI) 최적화
3) 엑소좀 생산세포주 제작 및 RCS (Research Cell Stock) 확보
○ 엑소좀 생산세포주 배양 공정 개발
1) 엑소좀 최종 후보 유전자 도입 세포주의 장기 계대 배양 안정성 확인 및 자료 확보
2) 엑소좀 생산세포주 배양 공정 최적화를 위한 기초 배지 및 첨가제 조건 설정
3) 배양액 회수용 기초배지 선정 및 회수 프로토콜 확립
○ 엑소좀 생산세포주 분리 정제 공정 개발
1) 배양액 (CCM) 및 엑소좀 시료 보관 조건 (온도, 보관 기한 등) 선정 완료
2) ExoDISC를 이용한 엑소좀 분리정제 프로토콜 최적화
3) 엑소좀의 상업적 생산을 위한 scale-up 테스트 및 관련 기초 자료 확보
○ 엑소좀 분석법 개발
1) 엑소좀 발현 Affimer의 활성 평가 시험법 개발 완료
2) 엑소좀 확인 및 순도시험범 개발 완료
3) PDI (Polydispersity index) 기반 엑소좀 사이즈 균일성 평가 기준 설정
○ in vivo 분포평가
1) PTM 뇌졸중 모델을 이용한 in vivo 분포평가 시험 디자인 및 평가 가능 기관 확보
○ in vitro 약효평가
1) 혈관내피세포 이용, 엑소좀 처리에 의한 세포 이동능 개선 효과 확인 및 관련 자료 확보

□ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
[활용계획]
○ 뇌졸중 혁신치료제 개발
1) 뇌졸중은 전 세계적으로 3대 사망원인 중의 하나로서, 전 세계 인구 6명 중 1명이 경험을 하게 되며, 암, 심혈관질환과 함께 한국 전체 사망원인의 절반 이상을 차지하는 3대 질환임. 뇌졸중은 발병 직후에 사망률이 가장 높으며, 발병 이후 1년 이내 사망할 확률도 30% 정도로 높음. 재발률 또한 1년내 5~25%, 5년내 20~40%로 높은 질환임에도 불구하고 활용 가능한 약물은 항혈소판제제와 항응고제 외 적절한 치료제가 없는 실정임
2) 뇌졸중은 환자가 발병 후 병원으로 응급으로 실려오는 경우가 대부분으로 급성기에 시기를 놓칠 경우 심각한 후유 장애가 동반되지만 사용할 수 있는 약물이 제한적임. 본 과제를 통해 개발된 치료제는 응급환경에서 환자에게 투여됨으로써 1차적으로 뇌출혈 및 경색 부위에서 혈액의 응고를 억제하고, 2차적으로 병변 부위로 침투하는 면역세포의 활성을 조절하여 염증반응을 낮출 수 있음. 세포 치료제와 달리 엑소좀은 반복 투여에 따른 위험이 낮아 초기 응급상황뿐 아니라 신경보호 및 회복, 혈관 재생효과 등의 작용 기전으로 회복시 치료요법으로도 활용가능할 것임
○ 중추신경 질환 치료제 적응증 확대
1) Affimer 발현 엑소좀 치료제를 뇌졸중에 적용하여 효과 및 분포의 변화를 입증하면 다른 중추신경계 질환으로 확장이 가능할 것임. 이러한 질환으로는 신경염증이 주요 발병 원인이 되는 질환이나 CD40L을 타겟으로 유효한 효과를 입증한 질환이 될 수 있음
○ 엑소좀 공정 표준화를 통한 사업 확대
1) 엑소좀 치료제는 기존 약물(화합물, 재조합 단백질, 항체치료제, 세포치료제)과 다른 유형으로 치료제의 품질관리 기준과 생산방법에 대한 허가기관의 가이드가 없는 실정임. 이중 생산방법은 엑소좀을 치료제로 개발하는데 가장 중요한 허들이 될 것으로 판단됨. 특히 엑소좀을 균질한 품질로 안정적으로 생산하기 위해서는 세포의 기원과 분리정제 공정이 매우 중요함. 그러나 현재 엑소좀 치료제는 초기 단계로 허가기관의 기준이 없고 상업화를 위한 표준 생산방법이 확립되어 있지 않음
2) 세포의 기원과 분리정제 공정을 기반으로 Affimer 발현 엑소좀의 안정적 생산이 본 과제를 통해 검증되면, 엑소좀의 아이디어를 산업화로 즉시 연결할 수 있는 CDMO 사업이 가능할 것으로 판단됨. 또한, 세포의 기원과 분리정제 공정을 플랫폼으로 구성하여 기술 이전하고 그에 따른 기술료 및 로열티 수익을 기대할 수 있음
[기대 효과]
○ 기술적 측면 기대효과
1) CD40L 타겟 엑소좀치료제의 신규성
- 엑소좀 엔지니어링을 위한 다양한 연구가 수행되고 있는데 대부분 특정 세포 또는 암세포에 특이적 마커를 타겟으로 진행중. 또한, 타겟에 대한 결합력을 위주로 평가하며, 엑소좀의 활성을 가진경우는 드문 것으로 파악됨
- CD40L을 타겟하는 엑소좀 치료제는 처음으로 시도되는 연구로 최근 큰 관심을 받고 있는 신경염증과 퇴행성 뇌질환으로 확장할 수 있는 잠재력을 보유함. CD40L을 타겟으로 개발된 항체는 장기 이식 후 거부반응이나 자가면역질환 임상시험에서 우수한 효능을 나타냈으나 혈소판의 응집을 유도하는 부작용이 보고되었음. 이 부작용은 항체의 Fc부위로 인해 발생하는 것으로 본 과제가 새로운 modality로 가능성이 입증되면 초기 개발단계에서도 기술이전이 가능할 것으로 판단됨
2) 약물전달 플랫폼으로 확장
- CD40L은 많은 자가면역질환 환자의 조직에서 발현이 증가되어 있다고 보고됨. 특히 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 루푸스 질환에서 활성화되어 있는바 난치질환의 새로운 약물전달 플랫폼으로 활용할 수 있음. 뇌졸중 외 다양한 적응증을 발굴하고 글로벌 파트너와 협력하여 공동개발 또는 라이선스 아웃을 추가로 추진하는 기반을 마련하고자 함.
- 1형 당뇨와 루푸스는 유효성 있는 치료제가 없는 질환으로 부작용이 최소화되도록 타겟에 약물이 운송되어야 함. 본 과제를 통해 개발된 엑소좀에 유전자를 탑재하는 Proof of Concept을 증명하고 유전자 치료제의 전달 플랫폼으로 확장 가능함
- 본 과제를 통해 타겟 이송과 유효성을 입증후 CD40-CD40L과 유사한 면역질환 또는 신경염증 질환에서 과활성화된 신호전달 체계를 타겟으로 신규 과제 추진이 가능함
○ 사회적 측면 기대효과
1) 국민건강 기여
- 대한뇌졸중학회가 국민건강영양조사 자료를 분석한 결과에 따르면, 성인 60명 중 1명이 뇌졸중 환자에 해당하며 유병률로는 1.7%에 달함. 매년 10만 명이 넘는 환자가 발생하고 있으며, 19세 이상 성인에서 뇌졸중 평생 유병률은 인구 1,000명당 15.9명으로 나타남
- 국내 뇌졸중 사망자 수는 2009년 1만 5,682명, 2012년 1만 4,257명, 2016년 1만 4,479명, 2019년 1만 4,045명에 달함. 사회경제적 비용은 약 4조 8,000억으로 직접비 2조 9,772억원, 간접비 1조 8,944억이며, 고령화로 인해 점차 증가할 것으로 예상됨
- 매년 ~1만 5,000명의 사망자와 ~5조 사회적 비용 중 ~10% 환자에게 적용할 수 있는 치료제가 개발되면, 사회경제적 비용을 5,000억 이상 절감할 수 있는 효과가 있음

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 1) 연구개발 과제목표 ... 7
• 2) 연구개발 배경 ... 7
• 3) 대상질환 개요 및 개발 필요성 ... 8
• 4) 대상 제품의 개요 ... 10
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 11
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 41
• 1) 연구수행 결과 ... 41
• (1) 정성적 연구개발성과 ... 41
• (2) 정량적 연구개발성과 ... 42
• (3) 세부 정량적 연구개발성과 ... 43
• (4) 계획하지 않은 성과 및 관련 분야 기여사항 ... 45
• 2) 목표 달성 수준 ... 46
• 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 47
• 1) 목표 미달 원인(사유) 자체분석 내용 ... 47
• 2) 자체 보완활동 ... 47
• 3) 연구개발 과정의 성실성 ... 47
• 5. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 48
• 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 48
• 끝페이지 ... 50