We have determined and analyzed the full-length cDNA sequence of a coxsackievirus B3 (CVB3) Korean isolate (CVB3-Korea/97) which has been known as a general human pathogen. The whole genome contains 7,400 nucleotides and has a single large open reading frame with 6,555 nucleotides that encodes a pot...
We have determined and analyzed the full-length cDNA sequence of a coxsackievirus B3 (CVB3) Korean isolate (CVB3-Korea/97) which has been known as a general human pathogen. The whole genome contains 7,400 nucleotides and has a single large open reading frame with 6,555 nucleotides that encodes a potential polyprotein precursor of 2,185 amino acids. The genome also contains a 5' non-coding region (NCR) of 741 bases and a 3' NCR of 104 bases followed by poly(A) tail. Sequence homologies of nucleotides and deduced amino acids between the CVB3-Korea/97 strain and the prototype (Nancy strain) were 81.7% and 91.5%, respectively. The genes encoding the functional proteins including viral protease and RNA dependent RNA polymerase showed higher homology than those encoding the structural proteins. We have further analyzed the sequences of 5' NCR, VP1 and VP2 of CVB3-Korea/97, which are known as cardiovirulent determining factors at the nucleotide and amino acid levels. Although the CVB 3-Korea/97 strain was isolated from an aseptic meningitis patient without cardiomyopathy, its 234th nucleotide and 165th amino acid were uracil and Asn as same as those of other cardiovirulent strains one. However, the 155th amino acid of VP1, which closely associated with cardiovirulence, was replaced with $Arg^{155}$ by single nucleotide substitution from $A^{2916}$ to $T^{2916}$. Moreover, additional amino acid substitutions were observed in the flanking region of $Asp^{155}$. Taken together, amino acid(s) substitution in VP1 may playa critical role in determining cardiovirulence of the CVB3-Korea/97 strain rather than individual nucleotide replacements in the 5' NCR and/or an amino acid substitution in VP2.
We have determined and analyzed the full-length cDNA sequence of a coxsackievirus B3 (CVB3) Korean isolate (CVB3-Korea/97) which has been known as a general human pathogen. The whole genome contains 7,400 nucleotides and has a single large open reading frame with 6,555 nucleotides that encodes a potential polyprotein precursor of 2,185 amino acids. The genome also contains a 5' non-coding region (NCR) of 741 bases and a 3' NCR of 104 bases followed by poly(A) tail. Sequence homologies of nucleotides and deduced amino acids between the CVB3-Korea/97 strain and the prototype (Nancy strain) were 81.7% and 91.5%, respectively. The genes encoding the functional proteins including viral protease and RNA dependent RNA polymerase showed higher homology than those encoding the structural proteins. We have further analyzed the sequences of 5' NCR, VP1 and VP2 of CVB3-Korea/97, which are known as cardiovirulent determining factors at the nucleotide and amino acid levels. Although the CVB 3-Korea/97 strain was isolated from an aseptic meningitis patient without cardiomyopathy, its 234th nucleotide and 165th amino acid were uracil and Asn as same as those of other cardiovirulent strains one. However, the 155th amino acid of VP1, which closely associated with cardiovirulence, was replaced with $Arg^{155}$ by single nucleotide substitution from $A^{2916}$ to $T^{2916}$. Moreover, additional amino acid substitutions were observed in the flanking region of $Asp^{155}$. Taken together, amino acid(s) substitution in VP1 may playa critical role in determining cardiovirulence of the CVB3-Korea/97 strain rather than individual nucleotide replacements in the 5' NCR and/or an amino acid substitution in VP2.
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제안 방법
ABI PRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction kit (Perkin Elmer)을 사용하여 생성한 반응 산물을 ABI PRISM 377 DNA sequencer (Perkin Elmer)를 이용하여 조사하였다. 염기서열의 분석은 Lasergene 프로그램 (DNASTAR Inc.
CVB3 게 놈을 기 초로 하여 5' 말단 26개의 뉴클레오타이 드를 forward primer (ELDF, 5' ttaaaaca- gcctgtgggttgatcca 3)로 제작하였고, 3' 말단 NCR의 22개 뉴클레 오타이 드와 oligo-dT가 포함된 40개의뉴클레 오타이 드를 제 작하여 reverse primer로 이용하였다 [11, 15, 16). PCR 용액은 증류수를 첨가하여 적정한 총 50 μl 내에 dNTP (2.
동정 에 사용한 바이러스는 103'~ 10"TCID5o/ml의 역가로 희석하여 사용하였다. CVB3에 대한 토끼 다클론 항혈청과 중화가 확인된 바이러스를 CVB3-Korea/97라 명명하였으며 plaque assay를 수행하여 바이러스를 정제한 후 RNA 추출에 사용하였다.
생성된 집락을 ampicillin이 포함된 LB broth에 진탕배양한 후 plasmid DNA를 추출하여 insert를 확인하였다. Insert가 확인된 plasmid DNA를 EcoRI으로 절단하여 pCR2.2 (modified pCR2.1) 벡 터 에 subcloning 하였다.
LD-PCR을 통해 증폭된 DNA 산물을 0.7% agarose gel에서 전기 영동한 후 CVB3 전체 게놈 크기인 7.4 kb 부근의 band만을 선택하여 분리 하였다. 정제한 PCR 산물 4 μl와 pCR2.
[11, 15, 16). PCR 용액은 증류수를 첨가하여 적정한 총 50 μl 내에 dNTP (2.5 mM) 6 μl, 10X EX Taq (Takara) 완충용액 5 |11, ELDF (10 pmol)와 ELDR (10 pmol) 각각 5 |11, EX Taq 0.5 μl, 합성 된 cDNA 3 μl가 포함되 도록 하였으며 94tJ 에서 3분 동안 denaturation시킨 후 94p 30초, 5812 30초, 72 ℃ 6분 30초의 cycle을 30회 반복하고 마지막으로 72 ℃ 에서 7분간 extension하여 CVB3 cDNA 의 증폭을 시도하였다. PCR 증폭에 의해 생성된 DNA 산물은 0.
혈청형 이 CVB3로 동정 된 바이 러 스로부터 Tri-reagent 방법을 이용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성 하였다. cDNA가 장내바이 러스의 유전자로부터 합성된 것임을 확인하기 위하여 ZoU 등 [28]이 고안한 장내바이러스 특이 primer (EntF, 5' caagcacttctgt-ttccccgg 3'; EntR, 5' attgtcaccataagcagcca 3)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 436 bp 크기의 특이 산물이 증폭되었으며, 이를 통하여 분리 한바이 러스가 장내바이 러스라는 사실과 cDNA 합성 여부를 확인하였다 (Figure 1).
pCVB3K를 EcoRI으로 절단하여 그 절편을 pCR2.2 벡터에 subcloning 하였으며, 각 subclone (pCVB3K- F1 ~pCVB3K-F5)은 1~2 kb 정도의 크기 인 것을 확인하였다 (Figure 3).
그러나 국내의 경우 CVB3 전체 게놈의 염기서열 규명과 병원성 결정 부위 의 염 기 변화에 대한 연구는 전무한 실정 이다. 따라서 본 연구는 국내 무균성 뇌막염 환자로부터 분리 한 CVB3 (CVB3-Korea/97)의 전체 게놈을 LD-PCR 방법으로 증폭한 후 7.4 kb의 PCR 산물을 클로닝하여 염기서열을 결정 하였고 CVB3 의원 형주 (Nancy 주) 및 앞서 보고된 여러가지 변이주의 염기서열 및 아미노산 서열을 비교함으로써 유전적 특성 및 병원성 결정 요인에 대한 염기서열의 변화를 분석하였다.
특히 보고된 CVB3와 국내 분리 CVB3 분리주들과의 염기서열 변이 분석이나 심장질환 또는 무균성 뇌 막염을 유발하는 분리 주들의 병원성과 관련된 염기서열의 분석은 전혀 시도된 바 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내 무균성 뇌막염 환자에서 분리된 CVB3의 전체 게놈을 대상으로 염기서열을 분석한 후 원형주 (Nancy strain) 및 국외의 CVB3 염기서열과 비교하였으며, 국내 분리주의 심장질환의 병인과 관련된 유전자 변이를 분석하였다.
무균성 뇌막염 환자의 가검물은 전처리과정을 거쳐 Rd-cdc 세포와 Hep2-c 세포에 접종하였다. 수일 후 CPE가 관찰된 세포의 배양 상층액을 -701; 에서 얼리고 녹이는 과정을 반복하여 동일 세포에 접종함으로써 바이러스를 분리하였다.
바이러스로부터 추출한 RNA 5 ul에 2.5 mM dNTP 5 gl, 5 X RTase 완충용액 4 p.1, 0.1 M DTT 2 p.1, MMLV reverse transcriptase (Gibco BRL) 1 |il, 20 mM oligo-dT 1 gl를 첨 가하고 증류수로 20 |X1 를 적정한 후 46P에서 2시간 동안 반응시켰다. 위 와 같이 합성 된 cDNA를 PCR의 시 료로 사용하였다.
수일 후 CPE가 관찰된 세포의 배양 상층액을 -701; 에서 얼리고 녹이는 과정을 반복하여 동일 세포에 접종함으로써 바이러스를 분리하였다. 분리된 바이 러 스를 1O3°~1O40 TCIDso/mlSl 역 가로 희석하여 coxsackievirus B군 동정용 토끼 다 클론 항혈청 (Denka-seiken)으로 동정하였다. 혈청형 이 CVB3로 동정 된 바이 러 스로부터 Tri-reagent 방법을 이용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성 하였다.
coli cell ToplOF과 함께 ampicillin0] 포함된 LB 평 판배지 에 도말한 후 14~16시간 정도 370 배양기 에서 배양하였다. 생성된 집락을 ampicillin이 포함된 LB broth에 진탕배양한 후 plasmid DNA를 추출하여 insert를 확인하였다. Insert가 확인된 plasmid DNA를 EcoRI으로 절단하여 pCR2.
여러 연구자들에 의해 심장질환의 병원성과 관련된 것으로 알려진 CVB3 게놈의 특정 부위들의 염기서열을 본 연구 결과에서 확인된 CVB3- Korea/97의 염기서열과 비교하였다. Camero-Wil- son 등 [5]은 병원성을 나타내는 바이러스의 2, 916 번 염기가 A2.
ABI PRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction kit (Perkin Elmer)을 사용하여 생성한 반응 산물을 ABI PRISM 377 DNA sequencer (Perkin Elmer)를 이용하여 조사하였다. 염기서열의 분석은 Lasergene 프로그램 (DNASTAR Inc.)을 이 용하여 실시하였으며, 그 결과를 염기서열이 보고된 기존의 5가지 CVB3 분리주의 염기서열과 비교분석하였다.
중화항체 시험법과 장내바이러스 특이적 PCR 방법으로 확인된 CVB3-Korea/97 cDNA를 주형으로 ELDF, ELDR primer를 이용하여 LD-PCR을 수행하였다. PCR 산물을 전기 영 동한 결과 CVB3 전체 게 놈의 크기 와 동일한 약 7.
증폭된 7.4 kb의 LD-PCR 산물을 정제하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 ligation하여 ToplOF competent E. coli cell을 이용한 형질전환을 시도하였다. 형질전환된 E.
2)로 10% 용액이 되도록 섞은 후 원심분리를 실시하여 상층 액을 chloroform으로 처리하였다. 처리된 가검물용액을 rhabdomyosarcoma (Rd-cdc)와 human larynx carcinoma (Hep2-c) 세포에 접종하여 70— 80% 정도의 세 포병 변효과 (cytopathic effect; CPE)가 관찰되면 세포를 -7(T0 에서 냉동시키고 다시 녹이는 과정을 2~3회 반복한 후 현탁액을 동일 세포에 접종함으로써 바이 러스를 분리하였다. 분리된 바이 러 스는 네 덜 란드 RIVM (Rijksinstituut voor de Volksgezondheid en Milieuhygiene, Amsterdam, The Netherlands)에서 제작하여 세계보건기구가 분양한 enterovirus serum pool set 및 CVB 에 대한 토끼 다클론 항혈청 (Denka-Seiken)을 사용하여 김 등 [1] 의 방법으로 동정하였다.
이를 다시 4P 에서 14, 000 rpm으로 15분간 원심분리 한 후 침전물을 70% 에탄올로 세척하여 건조시켰다. 침 전물은 10 ul의 0.01% diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma)로 처리된 증류수로 현탁시켜 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다.
클로닝된 plasmid DNA를 주형으로 사용하여 M13 forward 와 M13 reverse primer 및 internal prim- er를 제작한 후 sequencing 하였다 (Table 1). ABI PRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction kit (Perkin Elmer)을 사용하여 생성한 반응 산물을 ABI PRISM 377 DNA sequencer (Perkin Elmer)를 이용하여 조사하였다.
분리된 바이 러 스를 1O3°~1O40 TCIDso/mlSl 역 가로 희석하여 coxsackievirus B군 동정용 토끼 다 클론 항혈청 (Denka-seiken)으로 동정하였다. 혈청형 이 CVB3로 동정 된 바이 러 스로부터 Tri-reagent 방법을 이용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성 하였다. cDNA가 장내바이 러스의 유전자로부터 합성된 것임을 확인하기 위하여 ZoU 등 [28]이 고안한 장내바이러스 특이 primer (EntF, 5' caagcacttctgt-ttccccgg 3'; EntR, 5' attgtcaccataagcagcca 3)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
coli cell을 이용한 형질전환을 시도하였다. 형질전환된 E. coll 클론은 ampicillin이 포함된 배지를 이용하여 선택하였으며, 선택된 클론으로부터 plasmid DNA를 추출하여 insert DNA를 확인하고, 확인된 클론을 pCVB3K라 명명하였다.
ORF는 2, 185개의 아미노산을 암호화하고 있었으며 764개의 아미노산으로 구성된 외막단백질 영역과 1, 421개의 아미노산으로 구성된 비구조단백질 영역으로 구성되어있었다. 확인된 CVB3-Korea/97과 전체 게놈 염기서열을 이미 보고된 5가지의 CVB3 분리주와 비교하였다. 분석한 결과는 Lindberg 등 [17], Klump 등 [13], Tracy 등 [25], Knowlton 등 [14], Chapman 등 [기이 보고한 sequence와 각각 81.
대상 데이터
916로 치환되어 Gly (GGT) 으로 변화되면 심 장질환의 병 원성 이 약독화 (atte- nuation)된다고 보고하였다. 본 연구에서는 CVB3- Korea/97의 경우 2, 916번 염기가 AG2.916로 triplet codon 자체가 Arg를 암호화하고 있었으며 VP1 155번 염기의 주변에서 변이가 관찰되었다 (Table 4, Figure 4A). 이 사실은 비록 CVB3-Korea/97의 VP1 155번 아미노산은 Camero-Wilson 등 [5] 이 약독화 주에서 분석한 바와 같이 Glye 아니지만 CVB3-Korea/97이 심장질환이 없는 무균성 뇌 막염환자에서 분리된 바이러스라는 것을 고려해 볼 때 VP1의 155번 아미노산의 변이가 CVB3의 심장질환 병원성의 중요한 부분일 가능성이 있다는 것을 확인하였다.
이론/모형
처리된 가검물용액을 rhabdomyosarcoma (Rd-cdc)와 human larynx carcinoma (Hep2-c) 세포에 접종하여 70— 80% 정도의 세 포병 변효과 (cytopathic effect; CPE)가 관찰되면 세포를 -7(T0 에서 냉동시키고 다시 녹이는 과정을 2~3회 반복한 후 현탁액을 동일 세포에 접종함으로써 바이 러스를 분리하였다. 분리된 바이 러 스는 네 덜 란드 RIVM (Rijksinstituut voor de Volksgezondheid en Milieuhygiene, Amsterdam, The Netherlands)에서 제작하여 세계보건기구가 분양한 enterovirus serum pool set 및 CVB 에 대한 토끼 다클론 항혈청 (Denka-Seiken)을 사용하여 김 등 [1] 의 방법으로 동정하였다. 동정 에 사용한 바이러스는 103'~ 10"TCID5o/ml의 역가로 희석하여 사용하였다.
성능/효과
CVB3-Korea/97의 VP1영역의 155번 근처의 아미노산 서열이 병원성 주와 많은 차이가 있다는 본 연구 결과로부터 VP1의 아미노산 변이 또는 일련의 아미노산 군 (motif)의 변이가 바이 러스의외 피 구조를 3차원적 으로 변화시 킴 으로써 CVB3 의 병 원성 에 영향을 미 칠 수도 있다는 추론이 가능하다. 그러나 본 연구에서 분석한 바와 같이 CVB3의 어느 한 부분의 단일 염 기 또는 단일 아미노산 자체의 변이 분석에 의해 정확하게 병원성 결정 에 작용하는 아미노산 서열을 규명하는 것은 불가능하다.
7, 400 bp로 확인되었다. CVB3-Korea/97의 전체염기서열 및 아미노산 서 열을 원형주로 알려져있는 Nancy주와 비교한 결과 CVB3-Korea/97의 구조단백질 영역에서 아미노산 서 열은 84.7%, 염기서열은 77.5%의 유사성이 있음을 확인하였고, 비구 조단백질 영역에서 아미노산 서열은 94.1%, 염기서열은 84.9%의 유사성 이 있음을 확인하였다. 이 결과는 동일한 혈청형 내에서도 지역적 특성에 따라 25% 정도의 염기서열 변이가 있다고 보고한 Muir 등 [20]의 결과와 일치 한다.
ELDF, ELDR primer를 이용하여 LD-PCR을 수행하였다. PCR 산물을 전기 영 동한 결과 CVB3 전체 게 놈의 크기 와 동일한 약 7.4 kb 크기의 DNA 가 증폭되 었음을 확인하였다 (Figure 2).
Subcloning된 각각의 plasmid에 대한 염기서열분석을 실시한 결과 CVB3-Korea/97 전체 게놈은 7, 400 bp로서 741 bp의 5' NCR과 6, 555 bp의 open reading frame (ORF) 및 104 bp의 3' NCR로 구성 되어 있음을 확인하였다. ORF는 2, 185개의 아미노산을 암호화하고 있었으며 764개의 아미노산으로 구성된 외막단백질 영역과 1, 421개의 아미노산으로 구성된 비구조단백질 영역으로 구성되어있었다.
cDNA가 장내바이 러스의 유전자로부터 합성된 것임을 확인하기 위하여 ZoU 등 [28]이 고안한 장내바이러스 특이 primer (EntF, 5' caagcacttctgt-ttccccgg 3'; EntR, 5' attgtcaccataagcagcca 3)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 436 bp 크기의 특이 산물이 증폭되었으며, 이를 통하여 분리 한바이 러스가 장내바이 러스라는 사실과 cDNA 합성 여부를 확인하였다 (Figure 1).
0%의 유사성을 확인하였다. 동일한 영역의 아미노산서열 유사성은 외막단백질을 구성하는 P1영 역은 84.7%, 비구조단백질을 구성하는 P3영 역은 96.6%의 유사성을 확인하였다. 따라서 바이 러스의 외 막단백질을 암호화하고 있는 구조단백질 영역 (P1)은 염기 및 아미노산 서열에서 바이러스 유전자의 복제 및 단백질 분해기 능을 수행하는 비구조단백질 영역 (P2, P3) 및비 암호화 영역 (5' NCR, 3 'NCR) 보다 유사성 이 낮은 것으로 확인되었다.
6%의 유사성을 확인하였다. 따라서 바이 러스의 외 막단백질을 암호화하고 있는 구조단백질 영역 (P1)은 염기 및 아미노산 서열에서 바이러스 유전자의 복제 및 단백질 분해기 능을 수행하는 비구조단백질 영역 (P2, P3) 및비 암호화 영역 (5' NCR, 3 'NCR) 보다 유사성 이 낮은 것으로 확인되었다.
반면에 구조단백질의 경우 숙주 세포 수용체 결합부위 같이 바이러스의 생존에 중요한 영역도 존재하지만 그 밖의 대부분의 구조단백질을 암호화하는 영역의 변이는 바이러스의 생존에 치명적인 영향을 주지는 않는다. 따라서 본 연구에서도 CVB3-Korea/97 구조단백질 영역의 변이와는 달리 단백질 분해효소, RNA 중합 효소 등 비구조단백질을 암호화하고 있는 영역의 경우 유전자의 보존성이 매우 높은 것으로 확인되 었다.
관찰되지 않았다. 또한 RNA 의존성 RNA 중합 효소 (RNA dependent RNA polymerase; RDRP) 의활성부위라고 알려져 있는 159번-:163번 아미노산 (Lys-Asp-Glu-Leu-Arg), 327번-330번 아미노산 (Tyr- Gly-Asp-Asp)부분에서도 변이가 일어나지 않음을 확인하였다. °1 사실은 CVB3-Korea/97에서 바이러스의 구성 및 증식에 관련된 기능단백질을 암호화하는 부분은 잘 보존되어 있다는 것을 나타내 주는 결과이다.
7%의 유사성을 확인하였다 (Table 2). 또한 본 연구에서 확인된 염기서열과 보고된 염 기서 열을 각각의 유전자 영 역으로 나누어 염기서열 유사성을 확인한 결과 Table 3과 같이 77.2%에서 90.0%의 유사성을 확인하였다. 동일한 영역의 아미노산서열 유사성은 외막단백질을 구성하는 P1영 역은 84.
그.러므로 CVB3-Korea/97의 VP1/VP2 부위 아미노산 서열 중 VP2의 165번 아미노산은 병원성 주와 동일한 반면 VP1 155번 아미노산 등 다른 부위의 아미노산 서열은 병원성 주와 다르다는 것을 확인하였고 지금까지 보고된 VP2의 165번 및 VP1의 155번 등 단일 아미노산의 변화 자체가 CVB3의 병원성 여부에 결정적 요인으로 작용하지 않는다는 것을 의미 한다.
반면 Chapman 등 [6]은 5' NCR의 234번 염기의 변화는 CVB3의 병 원성 과 관계가 없다는 보고를 하여 5' NCR의 234번 염기가 CVB3 병원성 결정에 중요한 기능을 담당한다는 사실에 대한 논란이지속되고 있다. 본 연구에서 분석한 CVB3-Korea/ 97 염기서열의 경우 5' NCR의 234번 염기가 U로 확인되어 Tu 등 [26]이 주장한 병원성 주의 염기와 동일한 양상을 나타내고 있으나 CVB3-Korea/ 97이 심장이상을 보이지 않는 무균성 뇌막염 환자로 분리되 었음을 고려해 볼 때 Chapman 등 [6] 이 주장한 대로 CVB3 5' NCR의 234번 염기의 변화가 CVB3의 병 원성 을 결정 하는 인자가 아닐 가능성 이 높다고 할 수 있다. 그러나 picornavirus의 5' NCRe 바이러스 단백질의 해독 및 바이러스 RNA 복제 에 중요한 역할을 수행하는 IRES를 포함하고 있으며, 5'NCR의 2차 구조 또한 중요한역 할을 수행 한다고 알려져 있다.
본 연구에서 분석한 CVB3-Korea/97의 경우 심장이상이 관찰되지 않은 무균성 뇌 막염 환자로부터 분리 한 비 병 원성 주임 에도 불구하고 병원 성주에서 발견되는 아미노산 (Asn)를 가지는 것으로 나타났다. Knowlton 등 [14]은 VP1 을 암호화하고 있는 염기 중 2, 916번 염기의 변이 (A->G)로 인해 155번 아미노산이 변화 (Asp; GAT->Gly; GGT) 함으로써 병원성이 약화된다고 보고하였다.
확인된 CVB3-Korea/97과 전체 게놈 염기서열을 이미 보고된 5가지의 CVB3 분리주와 비교하였다. 분석한 결과는 Lindberg 등 [17], Klump 등 [13], Tracy 등 [25], Knowlton 등 [14], Chapman 등 [기이 보고한 sequence와 각각 81.4%, 81.8%, 81.8%, 81.7%, 81.7%의 유사성을 확인하였다 (Table 2). 또한 본 연구에서 확인된 염기서열과 보고된 염 기서 열을 각각의 유전자 영 역으로 나누어 염기서열 유사성을 확인한 결과 Table 3과 같이 77.
염기서열 분석결과 CVB3-Korea/97의 전체 게놈은 7, 400 bp로 확인되었다. CVB3-Korea/97의 전체염기서열 및 아미노산 서 열을 원형주로 알려져있는 Nancy주와 비교한 결과 CVB3-Korea/97의 구조단백질 영역에서 아미노산 서 열은 84.
916로 triplet codon 자체가 Arg를 암호화하고 있었으며 VP1 155번 염기의 주변에서 변이가 관찰되었다 (Table 4, Figure 4A). 이 사실은 비록 CVB3-Korea/97의 VP1 155번 아미노산은 Camero-Wilson 등 [5] 이 약독화 주에서 분석한 바와 같이 Glye 아니지만 CVB3-Korea/97이 심장질환이 없는 무균성 뇌 막염환자에서 분리된 바이러스라는 것을 고려해 볼 때 VP1의 155번 아미노산의 변이가 CVB3의 심장질환 병원성의 중요한 부분일 가능성이 있다는 것을 확인하였다.
후속연구
그러나 picornavirus의 5' NCRe 바이러스 단백질의 해독 및 바이러스 RNA 복제 에 중요한 역할을 수행하는 IRES를 포함하고 있으며, 5'NCR의 2차 구조 또한 중요한역 할을 수행 한다고 알려져 있다. [6, 9, 13, 26], 따라서 5' NCR 부위의 점돌연변이 (point mutation) 를 유발시킨 후 이러한 단일 염기서열 변이가 5' NCR 2차 구조 분석 및 단백질 해 독기 능에 어 떠한 영향을 주는지에 대한 분석은 5' NCR 부위가 CVB3의 병원성 결정과 관련되어 있는지 그리고 그중 어느 부분이 병원성의 결정에 중요한가를 밝힐 수 있는 단서를 제공할 수 있을 것이다. 본연구에서 확보한 CVB3-Korea/97의 전체 게놈을 포함하는 클론 및 염기서열은 향후 이러한 연구 분야에 중요한 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
그러나 본 연구에서 분석한 바와 같이 CVB3의 어느 한 부분의 단일 염 기 또는 단일 아미노산 자체의 변이 분석에 의해 정확하게 병원성 결정 에 작용하는 아미노산 서열을 규명하는 것은 불가능하다. 또한 RNA 바이러스의 특성상 quasispecies viral RNA population의 존재 가능성 을 완벽히 배제 할 수는 없으므로 CKB3에 의한 무균성 뇌막염 환자 및 심장질환 환자로부터 바이러스 RNA를 직접 분리한 후 염기서열을 결정하여본 연구에서 확인된 CVB3-Korea/97과 비교한다면 병원성 결정 요인에 대한 보다 정확한 유 전자적 분석이 이루어질 수 있을 것으로 생각한다.
[6, 9, 13, 26], 따라서 5' NCR 부위의 점돌연변이 (point mutation) 를 유발시킨 후 이러한 단일 염기서열 변이가 5' NCR 2차 구조 분석 및 단백질 해 독기 능에 어 떠한 영향을 주는지에 대한 분석은 5' NCR 부위가 CVB3의 병원성 결정과 관련되어 있는지 그리고 그중 어느 부분이 병원성의 결정에 중요한가를 밝힐 수 있는 단서를 제공할 수 있을 것이다. 본연구에서 확보한 CVB3-Korea/97의 전체 게놈을 포함하는 클론 및 염기서열은 향후 이러한 연구 분야에 중요한 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
장내바이 러 스에 대한 연구가 활발하지 못한 국내 상황에서 최초로 비병원성 CVB3 전체 염기서열을 확인한 본 연구 결과는 향후 CVB3의 병원성 결정인자 규명 및 지역적 변이에 따른 항원 성분 석 등 장내바이러스의 분자유전학적 연구에 중요한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 생각한다.
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