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문제 정의
- 그러나 옥수수 펩타이드가 주요성분인 옥수수 글루텐 가수분해물(corn gluten hydrolysates, CGH)의 알코올 섭취에 따른 간 손상모델에서의 간 보호효과 및 경시적 알코올 함량변화에 대한 연구는 아직 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 CGH의 알코올성간 손상에 대한 간 보호효과를 검토하고자, 흰쥐를 대상으로 CGH 가 함유된 알코올 용액 투여에 따른 간 기능 및 에탄올 대사 관련 효소활성의 변화를 조사하였다.
제안 방법
- 간 내 SOD 활성은 Winterbourn 등(21)의 방법을 변형하여 xanthine과 xanthine oxidase에 의한 ferricytochrome C의 환원을 방해하는 정도를 측정하여, cytochrome C의 환원을 50% 방해하는 것을 1 unit으로 표시하였다. Catalase 활성은 Johansson-Hakan 법(22)을 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정한 후, formaldehyde 를 표준용액으로 하여 얻은 표준곡선으로부터 활성을 산출하였다.
- 이는 청국장의 지질 대사 및 간 기능 개선효과를 본 Lee와 Chyun(12)의 결과와 유사한 것으로, 식이 성분 중 단백질이 동물의 기호에 영향을 줌으로써 나타난 현상으로 사료된다(26,27). 또한 체중으로 인한 간 무게의 차이를 배제하기 위해 간의 무게를 체중 100 g당 무게로 환산한 간 중량으로 비교하였다. 그 결과, 간의 무게는 에탄올 섭취에 의한 유의적인 차이를 보이지 않음으로써 알코올에 의한 간 비대 또는 지방간 현상은 나타나지 않음을 알 수 있다.
- 시료처치로 4주간 사육한 흰쥐를 12시간 절식시킨 후 에테르로 마취시켜 채혈한 혈액은 4℃, 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 −70℃에서 보관하면서 혈액 내 생화학적 지표분석에 이용하였다.
- , Bethlehem, PA, USA)를 공급하였다. 실험기간 중 물과 식이는 자유로이 섭취하도록 하였으며, 동물 사육실의 환경은 항온항습(23℃, 55%) 및 12시간 명암 주기(08:00-20:00)를 유지하였다.
- 즉, 정상군(N), 에탄올 투여군(E), 에탄올 용액에 CGH를 첨가한 실험군(CGH-1%와 CGH-3%)으로 나누어 4주간 사육하였다. 알코올 투여는 30%의 에탄올 용액을 체중(kg) 당 3g 의 에탄올 함량이 되도록 매일 일정한 시간(오전 9:00-10:00)에 1회씩 경구투여 하였다. 정상군은 50%(w/v) 포도당 용액을 경구 투여 하여 총 칼로리가 알코올 및 시료 처리군과 동일하도록 조정하고, 식이는 AIN-93G(Dyets Inc.
- 알코올성 간 손상을 입은 실험동물의 간 기능 회복에 대한 CGH의 효과는 혈중 ALP, GOT 및 GPT의 활성 변화롤 통해 조사하였다(Fig. 1). 알코올 투여 대조군의 혈중 ALP 활성은 정상군보다 20% 유의적으로 증가한 반면, CGH 처리에 의해 30% 유의적으로 감소하였다.
- 에탄올 용액 경구투여 후 경시적으로 채혈한 혈액으로부터 4℃, 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 분리한 혈장 내 에탄올 및 아세트알데하이드 함량은 kit(Roche Korea Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 분석하였다. 즉, 3 mL의 NAD 용액과 혈장 100 µL를 혼합하여 20℃에서 5분간 반응시킨 후 340 nm에서 흡광도의 차이를 측정하여 에탄올 함량을 산출하였다.
- 에탄올의 경구섭취에 따른 혈중 약물동태학적 거동은 에탄올과 아세트알데하이드의 농도-시간 곡선하 면적(area under the blood concentration-time curve: AUC)을 계산하여 분석하였다. 즉, 혈액 중 에탄올과 아세트알데하이드의 농도를 0시간부터 9시간까지 시간대별로 측정하여 곡선을 작성하고, 이로부터 사다리꼴 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값(AUC0→9 hr)을 구하였다.
- oryzae를 30℃에서 2일 동안 배양하고, 배양된 원료의 농도가 20%(w/w), 염 농도 5%(w/w)가 되도록 온수를 가하여 45℃로 조정하였다. 여기에 혼합된 상업용 효소(동량의 AlkalaseTM와 FlavourzymeTM)를 원료의 단백질 함량 대비 0.5%(w/ w)로 첨가한 후, 45℃에서 72시간 동안 가수분해를 실시하였다. 분해 공정을 통해 얻은 가수분해물을 여과(Pilot filter press, Jeil Co.
- 옥수수 글루텐 가수분해물의 제조는 옥수수 글루텐을 125℃에서 8분 동안 증자 후, CelluclastTM(원료의 단백질 함량 대비 0.5% (w/w))를 첨가하여 50℃, pH 5.0에서 2시간 동안 섬유질을 제거 하였다. 옥수수 글루텐의 가수분해는 20% 수용액 형태의 코지(A.
- 0에서 2시간 동안 섬유질을 제거 하였다. 옥수수 글루텐의 가수분해는 20% 수용액 형태의 코지(A. oryzae를 접종하고 배양하여 제조)와 상업용 효소를 병용하여 진행하였다. 즉, A.
- 알코올 투여는 30%의 에탄올 용액을 체중(kg) 당 3g 의 에탄올 함량이 되도록 매일 일정한 시간(오전 9:00-10:00)에 1회씩 경구투여 하였다. 정상군은 50%(w/v) 포도당 용액을 경구 투여 하여 총 칼로리가 알코올 및 시료 처리군과 동일하도록 조정하고, 식이는 AIN-93G(Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)를 공급하였다. 실험기간 중 물과 식이는 자유로이 섭취하도록 하였으며, 동물 사육실의 환경은 항온항습(23℃, 55%) 및 12시간 명암 주기(08:00-20:00)를 유지하였다.
- oryzae를 접종하고 배양하여 제조)와 상업용 효소를 병용하여 진행하였다. 즉, A. oryzae를 30℃에서 2일 동안 배양하고, 배양된 원료의 농도가 20%(w/w), 염 농도 5%(w/w)가 되도록 온수를 가하여 45℃로 조정하였다. 여기에 혼합된 상업용 효소(동량의 AlkalaseTM와 FlavourzymeTM)를 원료의 단백질 함량 대비 0.
- , Seoul, Korea)로 1주간 적응시킨 후 난괴법에 의해 4군(n=10)으로 나누어 사용하였다. 즉, 정상군(N), 에탄올 투여군(E), 에탄올 용액에 CGH를 첨가한 실험군(CGH-1%와 CGH-3%)으로 나누어 4주간 사육하였다. 알코올 투여는 30%의 에탄올 용액을 체중(kg) 당 3g 의 에탄올 함량이 되도록 매일 일정한 시간(오전 9:00-10:00)에 1회씩 경구투여 하였다.
- 5% carboxymethyl celluiose(CMC) 용액에 현탁시킨 asparginic acid와 CGH의 효과를 비교하였다. 즉, 체중(kg) 당 1g의 시료를 경구투여하고, 30분 후에 30%의 에탄올 용액(3 g/kg body weight)을 경구투여 후 0, 0.5, 1, 3, 6, 9 hr별로 안와채혈(0.5 mL) 하였다.
- 즉, 혈액 중 에탄올과 아세트알데하이드의 농도를 0시간부터 9시간까지 시간대별로 측정하여 곡선을 작성하고, 이로부터 사다리꼴 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값(AUC0→9 hr)을 구하였다.
- 한편, 혈중 알코올 대사에 미치는 CGH의 약물 동태학적 거동 실험은 16시간 동안 공복을 유지시킨 흰쥐를 이용하여 0.5% carboxymethyl celluiose(CMC) 용액에 현탁시킨 asparginic acid와 CGH의 효과를 비교하였다. 즉, 체중(kg) 당 1g의 시료를 경구투여하고, 30분 후에 30%의 에탄올 용액(3 g/kg body weight)을 경구투여 후 0, 0.
- 혈액을 채취한 후 해부하여 간을 적출한다음 생리식염수로 세척하고 여과지로 수분을 제거한 후, 평량하여 체중 100 g당 장기중량을 환산하고, −70℃에서 보관하면서 이후 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 상등액은 다시 4℃, 12,000×g에서 15분간 원심분리하여 미토콘드리아 분획을 취하고, 분리된 상등액은 4℃, 48,000×g에서 1시간 동안 초고속원심분리하여 사이토졸과 마이크로좀 분획을 얻어 분석에 이용할 때까지 −70℃에 보관하였다. 미토콘드리아 분획은 GPX, SOD와 ALDH, 사이토졸은 ADH, 마이크로좀은 MEOS 활성측정에 각각 사용하였다.
- 5%(w/ w)로 첨가한 후, 45℃에서 72시간 동안 가수분해를 실시하였다. 분해 공정을 통해 얻은 가수분해물을 여과(Pilot filter press, Jeil Co., Daegu, Korea), 농축(Rotary vacuum evaporator system N11, Eyela, Tokyo, Japan), 탈염(Pilot electrodialysis Acilyzer 02, Astom Corp., Tokyo, Japan) 과정을 거친 후, 분말 제제화(Pilot 분무건조기 KL-8, Seo Gang Engineering Co., Chungnam, Korea) 하여 사용하였다.
- 알코올에 의해 손상된 간에 대한 시료의 보호효과는 체중 200 g 내외의 6주령 Spargue-Dawley종 수컷 흰쥐를 구입(Central Lab., Animal Inc., Seoul, Korea)하여 일반사료(Samyang Co., Seoul, Korea)로 1주간 적응시킨 후 난괴법에 의해 4군(n=10)으로 나누어 사용하였다. 즉, 정상군(N), 에탄올 투여군(E), 에탄올 용액에 CGH를 첨가한 실험군(CGH-1%와 CGH-3%)으로 나누어 4주간 사육하였다.
- 옥수수 글루텐은 (주)두산콘프로덕츠코리아(Incheon, Korea)에서 구입하였고, 전처리 및 가수분해에 사용한 CelluclastTM(Trichoderma reesei, 700 U/g), AlkalaseTM(Bacillus licheniformis, 2.4 U/g), FlavourzymeTM(Aspergillus oryzae, 1,000 U/g)은 Novozymes (Begsvaerd, Denmark)의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 Statistical Package for the Social Science(SPSS, Version 12.0, 2004, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 각 실험군의 평균과 표준편차를 계산하였고, 분산분석(Analysis of variance; ANOVA) 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의수준 0.05 이하에서 각 실험군 간 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- GPX 활성은 Flohe의 방법(23)을 이용하여 반응한 용액의 흡광도 변화를 365 nm에서 30초 간격으로 3분간 측정하여 unit 활성 단위로 나타내었다. ADH와 ALDH활성은 Lebsack 등(24)과 Shin 등(25)의 방법에 준하여 340 nm에서 NADH의 생성속도를 지표로 측정하였다.
- 간 내 SOD 활성은 Winterbourn 등(21)의 방법을 변형하여 xanthine과 xanthine oxidase에 의한 ferricytochrome C의 환원을 방해하는 정도를 측정하여, cytochrome C의 환원을 50% 방해하는 것을 1 unit으로 표시하였다. Catalase 활성은 Johansson-Hakan 법(22)을 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정한 후, formaldehyde 를 표준용액으로 하여 얻은 표준곡선으로부터 활성을 산출하였다. GPX 활성은 Flohe의 방법(23)을 이용하여 반응한 용액의 흡광도 변화를 365 nm에서 30초 간격으로 3분간 측정하여 unit 활성 단위로 나타내었다.
- Catalase 활성은 Johansson-Hakan 법(22)을 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정한 후, formaldehyde 를 표준용액으로 하여 얻은 표준곡선으로부터 활성을 산출하였다. GPX 활성은 Flohe의 방법(23)을 이용하여 반응한 용액의 흡광도 변화를 365 nm에서 30초 간격으로 3분간 측정하여 unit 활성 단위로 나타내었다. ADH와 ALDH활성은 Lebsack 등(24)과 Shin 등(25)의 방법에 준하여 340 nm에서 NADH의 생성속도를 지표로 측정하였다.
- 또한, 일본식품화공에서는 ‘페푸치노’라는 이름으로 옥수수 단백질 유래 펩타이드를 시판하였는데, 이는 알코올 대사촉진, 콜레스테롤 흡수억제, 혈압강하 등의 효능을 나타내었다(17). 알코올 대사에 대한 옥수수 펩타이드의 효능은 Yamaguchi 등(18,19)이 본태성 고혈압 유발 흰쥐와 건강한 남성을 대상으로 옥수수 펩타이드를 함유한 식이를 제공함에 따른 효과를 조사하였다. 그러나 옥수수 펩타이드가 주요성분인 옥수수 글루텐 가수분해물(corn gluten hydrolysates, CGH)의 알코올 섭취에 따른 간 손상모델에서의 간 보호효과 및 경시적 알코올 함량변화에 대한 연구는 아직 보고되어 있지 않다.
- 혈청 중 alkaline phosphatase(ALP), aspartate aminotransferase (GOT), alanine aminotransferase(GPT) 활성은 Reitman-Frankel의 방법(20)에 따라 조제된 kit(Asan Pharm, Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였다.
성능/효과
- 또한 체중으로 인한 간 무게의 차이를 배제하기 위해 간의 무게를 체중 100 g당 무게로 환산한 간 중량으로 비교하였다. 그 결과, 간의 무게는 에탄올 섭취에 의한 유의적인 차이를 보이지 않음으로써 알코올에 의한 간 비대 또는 지방간 현상은 나타나지 않음을 알 수 있다.
- Table 2와 같이, CGH 시료처리에 의해 혈중 SOD와 GPX 활성 및 MDA 농도는 알코올 투여 및 시료처치군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다. 그러나 catalase 효소활성은 알코올 투여 군에 비해 CGH 처리군에서 79%까지 유의적으로 감소하였다. 체내 항산화 효소인 SOD와 catalase는 체내 항산화 시스템의 초기 단계에 작용하는 효소로, SOD는 superoxide radical을 반응성이 약한 hydrogen peroxide로 전환시키고, 이는 catalase에 의해 물로 전환되어 배설된다(33-35).
- 특히, 숙취해소에 유효한 성분으로 알려져 있는 asparaginic acid의 경우, 본 연구에서는 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 CGH는 알코올 섭취에 따른 숙취해소 및 알코올성 간질환의 주요 원인성분인 acetaldehyde를 제거하는 알코올 대사과정을 촉진하는 기능성 성분으로 유용하게 작용할 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 일반적으로 섭취된 ethanol은 ADH에 의해 acetaldehyde로 전환되고, 세포 손상의 원인이 되는 aldehyde는 ALDH에 의해 acetic acid로 무독화되어 배설된다(39). 따라서 본 연구에서 사용한 CGH는 알코올 대사과정에 관여하는 효소 중 alcohol을 1차적으로 분해하는 ADH 보다는 2차 산물인 aldehyde에 작용하는 ALDH 활성을 촉진하는 효과를 보이는 것으로 판단된다.
- 그러나 본 연구에서 간 손상 실험군에 CGH 처리 결과는 GOT 및 GPT 활성의 증가가 나타나지 않는 등 청국장을 이용한 기존 연구 결과(12)와 유사하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 CGH는 알코올성 간 손상에 대해 GOT 및 GPT 활성보다는 ALP 활성에 영향을 주는 것을 알 수 있다.
- 특히, 3% CGH를 급여한 그룹에서는 알코올만 투여한 대조군에 비해 간내 MEOS 활성이 유의적으로 20% 감소됨으로써 CGH가 MEOS 의 활성을 억제하는 것에 효과적임을 알 수 있었다. 따라서 알코올 투여로 증가된 MEOS 활성이 CGH 처리로 유의적으로 감소함으로써 CGH의 알코올성 간 손상 보호효과를 기대할 수 있었다.
- 특히, Lee와 Chyun(12)은 청국장 급여가 catalase보다는 SOD 활성에 유의적으로 작용한다고 하여 본 연구와는 상반된 결과를 보였다. 따라서 알코올성 간 손상에 따른 간기능 회복효과에 있어서 CGH 효과는 항산화 활성 효소 중 catalase와 관련된 반응에서 영향을 주는 것으로 사료된다.
- 그러나 acetaldehyde 농도는 CGH 투여 30분 이후부터 급격히 감소하다가 9시간에는 거의 사라지는 현상을 보였다. 또한 acetaldehyde의 전체적인 변화를 곡선 하 면적으로 환산한 결과, 대조군, asparaginic acid, CGH 그룹에서 각각 953, 1,009, 380 mg hr/dL로 CGH 처리에 의해 유의적인 감소를 보였다. 특히, 숙취해소에 유효한 성분으로 알려져 있는 asparaginic acid의 경우, 본 연구에서는 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 알코올성 간 손상을 입은 실험용 수컷 흰쥐에 대해 4주간의 시료처치에 따른 체중증가, 식이섭취량 및 간 중량 변화는 Table 1과 같다. 모든 동물에서 체중증가 및 간 중량에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나, CGH를 1%와 3%로 처리한 실험군의 식이섭취량은 정상군보다 유의적으로 낮았다. 이는 청국장의 지질 대사 및 간 기능 개선효과를 본 Lee와 Chyun(12)의 결과와 유사한 것으로, 식이 성분 중 단백질이 동물의 기호에 영향을 줌으로써 나타난 현상으로 사료된다(26,27).
- 본 연구에서 사용한 옥수수 글루텐 가수분해물은 수분 5.0%, 단백질 62.5%, 탄수화물 26.5%, 조지방 0.0%, 회분 6.0%로 분석되었고, 전체 유리아미노산 대비 BCAA 함량은 40.7%(valine 7.6%, isoleucine 9.8%, leucine 9.57%)를 차지하고 있었다.
- 1). 알코올 투여 대조군의 혈중 ALP 활성은 정상군보다 20% 유의적으로 증가한 반면, CGH 처리에 의해 30% 유의적으로 감소하였다. ALP는 간 이외에도 뼈, 소장, 신장, 태반 등에서도 발견되며, ALP의 증가는 모든 범주의 간질환 및 담도 세포의 폐쇄 및 담즙 정체성 등의 간질환을 예상할 수 있는 지표로 알려져 있다(28).
- 2와 같다. 알코올 투여와 시료처리에 의해 ADH 활성은 유의적인 차이를 보이지 않았으나, ALDH 활성은 알코올 투여 대조군에 비해 CGH군에서 20% 정도 유의적으로 증가하였다. ALDH는 체내 혐기적인 해당과정의 최종 단계에서 산화-환원반응에 관여하는 효소로, 급성간염, 초기간암, 심근경색, 악성 빈혈, 백혈병 등의 발병에 의해 현저하게 상승한다(38).
- 본 실험에서 MEOS 활성은 알코올 투여군이 정상군에 비하여 유의적인 증가를 보였는데, 이는 Kishimoto 등(43)과 Koivula와 Lindros(44)의 보고와 유사하였다. 특히, 3% CGH를 급여한 그룹에서는 알코올만 투여한 대조군에 비해 간내 MEOS 활성이 유의적으로 20% 감소됨으로써 CGH가 MEOS 의 활성을 억제하는 것에 효과적임을 알 수 있었다. 따라서 알코올 투여로 증가된 MEOS 활성이 CGH 처리로 유의적으로 감소함으로써 CGH의 알코올성 간 손상 보호효과를 기대할 수 있었다.
- 또한 acetaldehyde의 전체적인 변화를 곡선 하 면적으로 환산한 결과, 대조군, asparaginic acid, CGH 그룹에서 각각 953, 1,009, 380 mg hr/dL로 CGH 처리에 의해 유의적인 감소를 보였다. 특히, 숙취해소에 유효한 성분으로 알려져 있는 asparaginic acid의 경우, 본 연구에서는 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 CGH는 알코올 섭취에 따른 숙취해소 및 알코올성 간질환의 주요 원인성분인 acetaldehyde를 제거하는 알코올 대사과정을 촉진하는 기능성 성분으로 유용하게 작용할 수 있는 가능성을 보여주었다.
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