[학위논문]기내배양에 의한 병풀[Centella asiatica (L.) Urban]의 대량증식과 triterpene glycosides 생산 Micropropagation of centella asiatica (L.) urban by in vitro cultures and production of triterpene glycosides원문보기
병풀(Centella asiatica)의 기내(in vitro) 배양을 통하여 triterpene glycosides 생산 가능성을 조사하기 위하여 체세포 배발생과 multiple shoot 배양을 통한 대량 증식 조건을 확립하였고, Agrobacterium rhizogenes에 의해 유도된 모상근과 캘러스의 배양조건을 확립하였다. 이러한 기내 배양된 재분화체, 모상근, 캘러스, 그리고 채집한 식물체의 잎에서 triterpene glycosides를 추출한 후, asiaticoside와 madecassoside를 분리하여 ...
병풀(Centella asiatica)의 기내(in vitro) 배양을 통하여 triterpene glycosides 생산 가능성을 조사하기 위하여 체세포 배발생과 multiple shoot 배양을 통한 대량 증식 조건을 확립하였고, Agrobacterium rhizogenes에 의해 유도된 모상근과 캘러스의 배양조건을 확립하였다. 이러한 기내 배양된 재분화체, 모상근, 캘러스, 그리고 채집한 식물체의 잎에서 triterpene glycosides를 추출한 후, asiaticoside와 madecassoside를 분리하여 TLC, HPLC, MP, IR, NMR 등을 통해 화학 구조를 동정, 확인하였다. 병풀(C. asiatica)의 엽병 조직 절편으로부터 형성된 배발생 캘러스(embryogenic callus)로부터 체세포 배발생(somatic embryogenesis)에 의한 소식물체(plantlet)의 재분화를 이루었다. 엽병 조직 절편을 1mg/L 2,4-D 와 1mg/L KIN이 조합 처리된 MS 배지에 치상하여 85%의 효율로 배발생 캘러스를 유도할 수 있었다. 이와 같은 배발생 캘러스를 5㎎/L NAA와 1mg/L KIN이 첨가된 배지로 옮겼을 때 체세포배는 87%까지 형성되었다. 체세포배는 기본배지의 농도를 절반으로 줄이고 0.2mg/L NAA와 0.2㎎/L KIN이 첨가된 배지 조건에서 기관 분화를 거쳐 유식물체로 재분화되었다. 정아 절편을 0.02㎎/L 2,4-D, IAA, IBA, NAA와 5㎎/L BA, KIN이 조합 처리된 MS 배지에 치상하여 광조건에서 6주간 배양한 후, shoot 형성률을 조사하였다. 0.02㎎/L 2,4-D와 5㎎/L BA 처리구에서 녹색의 단단한 캘러스가 형성되었으며, 동시에 shoot가 재분화되어 절편당 6.3개의 가장 많은 shoot가 발생하였다. 재분화된 multiple shoot는 0.2㎎/L NAA만 단독으로 첨가된 MS 배지에 치상하여 광조건에서 3-4주 배양하여 뿌리를 유도하였으며, MS 기본배지에 2-3회 계대배양하여 더욱 신장시킨 후, vermiculite에 옮겨 활착시켰다. A. rhizogenes A4와 ATCC 15834 균주를 사용하여 병풀의 잎 절편으로부터 모상근을 유도, 배양하였으며, 모상근 유도에 사용된 균주와 생장률, 그리고 형태적 특성에 따라 5종류의 모상근 clone을 선발하였고 형질 전환된 조직에서는 opine의 검출을 확인하였다. 배지에 따른 각 모상근은 MS 배지(pH 5.2)에서 가장 잘 생장하였으며, 탄소원으로서는 sucrose, glucose, fructose을 사용하였는데, glucose 처리구(0.085g, dry wt) 보다는 sucrose(0.295g, dry wt)와 fructose(0.262g, dry wt) 처리구가 생장이 양호하였다. 인산의 농도는 2.5 mM가 최적이었으며 NH₄^+/NO₃^-의 조합 비율은 MS 기본배지와 동일한 비율(20.6 mM NH₄^+/39.4 mM NO₃^-)에서 적합하였다. 캘러스 생장률은 10^-6 M NAA가 첨가된 MS 액체배지(70 mL)에 생중량 1g을 접종하였을 때, sucrose 농도는 3-4%, 배지는 MS 배지에서 적합하였다. 위의 실험을 통하여 얻어진 재분화체와 모상근, 캘러스, 그리고 채집한 식물체에서 추출한 triterpene glycosides을 HPLC로 정량한 결과 asiaticoside와 madecassoside 함량은 채집한 식물체의 잎에서 건중량당 0.314%(asiaticoside, yield)와 0.273%(madecassoside, yield)였고, 체세포 배발생을 통하여 만들어진 재분화체에서는 각각 0.148%와 0.124%, multiple shoot에서는 0.127%와 0.108%로 채집한 식물체의 약 1/2 수준이었다. 모상근에서는 0.026%와 0.061%로 모식물체의 1/12 수준이었으나 캘러스에서는 두 성분 모두 검출되지 않았다.
병풀(Centella asiatica)의 기내(in vitro) 배양을 통하여 triterpene glycosides 생산 가능성을 조사하기 위하여 체세포 배발생과 multiple shoot 배양을 통한 대량 증식 조건을 확립하였고, Agrobacterium rhizogenes에 의해 유도된 모상근과 캘러스의 배양조건을 확립하였다. 이러한 기내 배양된 재분화체, 모상근, 캘러스, 그리고 채집한 식물체의 잎에서 triterpene glycosides를 추출한 후, asiaticoside와 madecassoside를 분리하여 TLC, HPLC, MP, IR, NMR 등을 통해 화학 구조를 동정, 확인하였다. 병풀(C. asiatica)의 엽병 조직 절편으로부터 형성된 배발생 캘러스(embryogenic callus)로부터 체세포 배발생(somatic embryogenesis)에 의한 소식물체(plantlet)의 재분화를 이루었다. 엽병 조직 절편을 1mg/L 2,4-D 와 1mg/L KIN이 조합 처리된 MS 배지에 치상하여 85%의 효율로 배발생 캘러스를 유도할 수 있었다. 이와 같은 배발생 캘러스를 5㎎/L NAA와 1mg/L KIN이 첨가된 배지로 옮겼을 때 체세포배는 87%까지 형성되었다. 체세포배는 기본배지의 농도를 절반으로 줄이고 0.2mg/L NAA와 0.2㎎/L KIN이 첨가된 배지 조건에서 기관 분화를 거쳐 유식물체로 재분화되었다. 정아 절편을 0.02㎎/L 2,4-D, IAA, IBA, NAA와 5㎎/L BA, KIN이 조합 처리된 MS 배지에 치상하여 광조건에서 6주간 배양한 후, shoot 형성률을 조사하였다. 0.02㎎/L 2,4-D와 5㎎/L BA 처리구에서 녹색의 단단한 캘러스가 형성되었으며, 동시에 shoot가 재분화되어 절편당 6.3개의 가장 많은 shoot가 발생하였다. 재분화된 multiple shoot는 0.2㎎/L NAA만 단독으로 첨가된 MS 배지에 치상하여 광조건에서 3-4주 배양하여 뿌리를 유도하였으며, MS 기본배지에 2-3회 계대배양하여 더욱 신장시킨 후, vermiculite에 옮겨 활착시켰다. A. rhizogenes A4와 ATCC 15834 균주를 사용하여 병풀의 잎 절편으로부터 모상근을 유도, 배양하였으며, 모상근 유도에 사용된 균주와 생장률, 그리고 형태적 특성에 따라 5종류의 모상근 clone을 선발하였고 형질 전환된 조직에서는 opine의 검출을 확인하였다. 배지에 따른 각 모상근은 MS 배지(pH 5.2)에서 가장 잘 생장하였으며, 탄소원으로서는 sucrose, glucose, fructose을 사용하였는데, glucose 처리구(0.085g, dry wt) 보다는 sucrose(0.295g, dry wt)와 fructose(0.262g, dry wt) 처리구가 생장이 양호하였다. 인산의 농도는 2.5 mM가 최적이었으며 NH₄^+/NO₃^-의 조합 비율은 MS 기본배지와 동일한 비율(20.6 mM NH₄^+/39.4 mM NO₃^-)에서 적합하였다. 캘러스 생장률은 10^-6 M NAA가 첨가된 MS 액체배지(70 mL)에 생중량 1g을 접종하였을 때, sucrose 농도는 3-4%, 배지는 MS 배지에서 적합하였다. 위의 실험을 통하여 얻어진 재분화체와 모상근, 캘러스, 그리고 채집한 식물체에서 추출한 triterpene glycosides을 HPLC로 정량한 결과 asiaticoside와 madecassoside 함량은 채집한 식물체의 잎에서 건중량당 0.314%(asiaticoside, yield)와 0.273%(madecassoside, yield)였고, 체세포 배발생을 통하여 만들어진 재분화체에서는 각각 0.148%와 0.124%, multiple shoot에서는 0.127%와 0.108%로 채집한 식물체의 약 1/2 수준이었다. 모상근에서는 0.026%와 0.061%로 모식물체의 1/12 수준이었으나 캘러스에서는 두 성분 모두 검출되지 않았다.
The possibility of triterpene-glycoside production with in vitro cultures of Centella asiatica was investigated. Micropropagation system through somatic embryogenesis and multiple shoot cultures, hairy root and callus cultures were established. Identification of triterpene glycosides extracted from ...
The possibility of triterpene-glycoside production with in vitro cultures of Centella asiatica was investigated. Micropropagation system through somatic embryogenesis and multiple shoot cultures, hairy root and callus cultures were established. Identification of triterpene glycosides extracted from the leaves of field-grown plants, hairy root, callus, plants derived from somatic embryogenesis, and multiple shoot was performed by analytical methods using TLC, HPLC, MP, IR, and NMR spectroscopy. Somatic embryogenesis and subsequent plantlet formation were accomplished from embryogenic calli derived from young petioles of C. asiatica. Embryogenic callus cultures were induced from the petiole explants of C. asiatica on basal MS medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L kinetin. After transfer of these calli to MS medium supplemented with 5.0 mg/L NAA and 1.0 mg/L kinetin, 87% of embryogenic calli were differentiated into embryoids with primary and adventitious roots, elongated hypocotyl and cotyledon. Plantlets were induced when these embryoids were transferred to a half strength inorganic salts of basal MS medium supplemented with 0.2 mg/L NAA and 0.2 mg/L kinetin. Multiple shoot formation was obtained from excised terminal buds of C. asiatica cultured on the media containing various growth regulators such as auxin and cytokinin under light condition. MS medium supplemented with 0.02 mg/L 2,4-D and 5 mg/L BA was best for the greatest number of shoot formation, and the average number of shoot regeneration was 6.3 shoots per explant after 6 weeks. For root proliferation, regenerated shoots were transferred to MS medium with 0.2 m/L NAA or MS basal medium. Rooted plantlets were successfully transplanted to pots containing vermiculite. The hairy root cultures of C. asiatica were established by infection of leaf explants with Agrobacterium rhizogenes A4, and ATCC 15834 strain in a 1/2 Murashige and Skoog liquid medium supplemented with 50 μM acetosyringone. The induced hairy roots were subjected to paper electrophoresis for the detection of opine, and the opine-positive clones were considered to have been transformed. Five hairy root clones were selected according to the different bacterial strains used, growth rate and pattern. Among the surveyed media, MS basal medium (pH 5.2, 3% sucrose) with substituted phosphate concentration by 2.5 mM K₂HPO₄ showed the highest growth rate in the dark condition. Calli grew well in MS liquid medium containing 10^-6M NAA, 3-4% sucrose, and 1 g of cell (fr wt) per 70 mL of MS medium. Quantities of triterpene glycosides extracted from the leaves of field-grown plants, hairy roots, calli, plants derived from somatic embryogenesis, and multiple shoots were compared with those of authentic samples. Highest amounts of asiaticoside (0.314%, yield) and madecassoside (0.273%, yield) were obtained in the leaves of field-grown plants. The contents of triterpene glycosides in plants derived from somatic embryogenesis and multiple shoot cultures were compared to be about half the level of those obtained from field-grown plants. In hairy roots, cultured under the light condition, asiaticoside and madecassoside were obtained in 0.026% and 0.061% yield, respectively. In calli, however, none of the triterpene glycosides were detected.
The possibility of triterpene-glycoside production with in vitro cultures of Centella asiatica was investigated. Micropropagation system through somatic embryogenesis and multiple shoot cultures, hairy root and callus cultures were established. Identification of triterpene glycosides extracted from the leaves of field-grown plants, hairy root, callus, plants derived from somatic embryogenesis, and multiple shoot was performed by analytical methods using TLC, HPLC, MP, IR, and NMR spectroscopy. Somatic embryogenesis and subsequent plantlet formation were accomplished from embryogenic calli derived from young petioles of C. asiatica. Embryogenic callus cultures were induced from the petiole explants of C. asiatica on basal MS medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L kinetin. After transfer of these calli to MS medium supplemented with 5.0 mg/L NAA and 1.0 mg/L kinetin, 87% of embryogenic calli were differentiated into embryoids with primary and adventitious roots, elongated hypocotyl and cotyledon. Plantlets were induced when these embryoids were transferred to a half strength inorganic salts of basal MS medium supplemented with 0.2 mg/L NAA and 0.2 mg/L kinetin. Multiple shoot formation was obtained from excised terminal buds of C. asiatica cultured on the media containing various growth regulators such as auxin and cytokinin under light condition. MS medium supplemented with 0.02 mg/L 2,4-D and 5 mg/L BA was best for the greatest number of shoot formation, and the average number of shoot regeneration was 6.3 shoots per explant after 6 weeks. For root proliferation, regenerated shoots were transferred to MS medium with 0.2 m/L NAA or MS basal medium. Rooted plantlets were successfully transplanted to pots containing vermiculite. The hairy root cultures of C. asiatica were established by infection of leaf explants with Agrobacterium rhizogenes A4, and ATCC 15834 strain in a 1/2 Murashige and Skoog liquid medium supplemented with 50 μM acetosyringone. The induced hairy roots were subjected to paper electrophoresis for the detection of opine, and the opine-positive clones were considered to have been transformed. Five hairy root clones were selected according to the different bacterial strains used, growth rate and pattern. Among the surveyed media, MS basal medium (pH 5.2, 3% sucrose) with substituted phosphate concentration by 2.5 mM K₂HPO₄ showed the highest growth rate in the dark condition. Calli grew well in MS liquid medium containing 10^-6M NAA, 3-4% sucrose, and 1 g of cell (fr wt) per 70 mL of MS medium. Quantities of triterpene glycosides extracted from the leaves of field-grown plants, hairy roots, calli, plants derived from somatic embryogenesis, and multiple shoots were compared with those of authentic samples. Highest amounts of asiaticoside (0.314%, yield) and madecassoside (0.273%, yield) were obtained in the leaves of field-grown plants. The contents of triterpene glycosides in plants derived from somatic embryogenesis and multiple shoot cultures were compared to be about half the level of those obtained from field-grown plants. In hairy roots, cultured under the light condition, asiaticoside and madecassoside were obtained in 0.026% and 0.061% yield, respectively. In calli, however, none of the triterpene glycosides were detected.
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