Vibrio vulnificus는 연안해수에 서식하는 호염성 미생물로서 창상 감염과 원발성 패혈증의 형태로 사람에서 병을 일으킨다. 이 병원균은 자연환경과 감염과정에서 급격한 환경변화에 따른 스트레스에 직면하게 된다. 특히 계절변화에 따른 온도, 염도, 그리고 영양분의 변화나, host defense mechanism을 통한 다양한 스트레스에 적절히 대응하여 살아 남아야 한다. Alternative sigma factor σ^38(RpoS)는 여러 환경 스트레스에 대항하여 생존하는데 필요한 단백질군을 암호화하는 유전자들의 발현을 조절한다고 잘 알려져 있다. V. vulnificus에서 rpoS 유전자를 찾고자 하던 중에 rpoS 대신에 catalase-peroxidase 유전자를 클로닝하게 되었다. 본 논문에서는 catalase-peroxidase katG 유전자를 클로닝 하였으며, KatG 단백질의 분자생물학적인 특성과 생리학적인 역할을 조사하였다. V. vulnificus type strain인 ATCC 29307의 cosmid genomic library를 이용하여, 유해한 ...
Vibrio vulnificus는 연안해수에 서식하는 호염성 미생물로서 창상 감염과 원발성 패혈증의 형태로 사람에서 병을 일으킨다. 이 병원균은 자연환경과 감염과정에서 급격한 환경변화에 따른 스트레스에 직면하게 된다. 특히 계절변화에 따른 온도, 염도, 그리고 영양분의 변화나, host defense mechanism을 통한 다양한 스트레스에 적절히 대응하여 살아 남아야 한다. Alternative sigma factor σ^38(RpoS)는 여러 환경 스트레스에 대항하여 생존하는데 필요한 단백질군을 암호화하는 유전자들의 발현을 조절한다고 잘 알려져 있다. V. vulnificus에서 rpoS 유전자를 찾고자 하던 중에 rpoS 대신에 catalase-peroxidase 유전자를 클로닝하게 되었다. 본 논문에서는 catalase-peroxidase katG 유전자를 클로닝 하였으며, KatG 단백질의 분자생물학적인 특성과 생리학적인 역할을 조사하였다. V. vulnificus type strain인 ATCC 29307의 cosmid genomic library를 이용하여, 유해한 활성산소 species인 과산화수소를 물과 산소로 전환시키는 catalase-peroxidase katG (Vv-katG) 유전자를 클로닝 하였으며 그 염기서열을 분석하였다. Vv-katG 유전자는 총 2,172 nucleotide로 이루어져 있으며, 분자량 79,530-Da의 723개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하고 있다. V. vulnificus의 katG 유전자는 그 DNA 염기서열에 있어 V. cholerae의 catalase-peroxidase 유전자와 78%의 상동성을 나타냈다. 그리고 Vv-KatG의 아미노산 서열은 Vibrio cholerae catalase-peroxidase (85%), Synechococcus sp. catalase-peroxidase (77%), Legionella pneumophila catalase-peroxidase KatB (75%), Agrobacterium tumefaciens catalase(72%), Synechocystis sp. catalase HPI (71%), Bacillus stearothermophilus catalase (66%), 그리고 E. coli hydroperoxidase HPI (59%) 등과 같은 여러 세균의 catalase-peroxidase와 높은 상동성을 나타냈다. V. vulnificus 에서 KatG catalase-peroxidase의 생리학적 역할을 알아보기 위해 positive selection suicide vector인 pKAS32를 사용하여 Vv-katG deletion mutant를 제조하였다. Vv-katG mutant는 H₂O₂처리에 대해 현저한 감수성을 나타냈다. 그리고 wild type V. vulnificus를 60 μM H₂O₂로 30분 동안 전처리 하여 Vv-KatG를 induction 시킬 경우 치사 농도인 4 mM H₂O₂ 에 대해서도 높은 저항성을 나타내었다. 이러한 adaptation 현상은 katG mutant에서는 관찰되지 않았다. Catalase-peroxidase 활성이 사라졌음에도 불구하고, katG 돌연변이주는 정상 균주와 비교해서 배양 24 시간까지 정상적인 배가시간을 보였다. 그러나 오랜 기간동안 교반 배양 시 돌연변이주의 viability 는 배양 24 시간 이후 정상 균주에 비해 보다 빠르게 감소하였다. 게다가, 낮은 온도와 인공바닷물의 영양 결핍 상태에서 배양 시 돌연변이주의 viability는 정상 균주에 비해 보다 신속히 감소하였다. 돌연변이주의 경우 일단 배양이 불가능한 VBNC 상태가 되면 정상 균주에서 보였던 어떠한 resuscitation도 관찰되지 않았다. Non-denaturing PAGE 분석 결과 Vv-KatG 는 V. vulnificus에 존재하는 유일한 catalase 이며, catalase-peroxidase KatG는 cytoplasmic fraction에 위치하고 있음을 알 수 있다. 60 μM H₂O₂ 전처리에 따른 Vv-KatG induction 은 Western blot analysis에 의해 증명되었다. H₂O₂ 첨가에 의해 induction된 세균은 지수생장기와 휴지기 모두에서 더 높은 수준의 Vv-KatG 발현을 보여주었다. katG 유전자 발현의 조절 단계를 알아보기 위해 chromosomal 또는 plasmid P_katG::lacZ transcriptional reporter strain을 사용하여 Vv-lacZ deletion mutant에서 katG 유전자의 전사활성을 조사하였다. 60 μM H₂O₂ 전처 리에 따른 어떠한 katG transcription도 관찰되지 않았다. 이를 토대로 Vv-KatG 발현은 전사 후 수준에서 조절되는 것으로 사료된다. 이상의 분자생물학적 및 생리적인 연구 분석 결과를 종합해 볼 때, V. vulnificus catalase-peroxidase가 자연환경에 생존할 수 있는 oxidative stress, starvation, low temperature, 그리고 hyperosmolarity 등의 다양한 스트레스에 대한 저항성에 중요한 역할을 담당할 것으로 사료된다.
Vibrio vulnificus는 연안해수에 서식하는 호염성 미생물로서 창상 감염과 원발성 패혈증의 형태로 사람에서 병을 일으킨다. 이 병원균은 자연환경과 감염과정에서 급격한 환경변화에 따른 스트레스에 직면하게 된다. 특히 계절변화에 따른 온도, 염도, 그리고 영양분의 변화나, host defense mechanism을 통한 다양한 스트레스에 적절히 대응하여 살아 남아야 한다. Alternative sigma factor σ^38(RpoS)는 여러 환경 스트레스에 대항하여 생존하는데 필요한 단백질군을 암호화하는 유전자들의 발현을 조절한다고 잘 알려져 있다. V. vulnificus에서 rpoS 유전자를 찾고자 하던 중에 rpoS 대신에 catalase-peroxidase 유전자를 클로닝하게 되었다. 본 논문에서는 catalase-peroxidase katG 유전자를 클로닝 하였으며, KatG 단백질의 분자생물학적인 특성과 생리학적인 역할을 조사하였다. V. vulnificus type strain인 ATCC 29307의 cosmid genomic library를 이용하여, 유해한 활성산소 species인 과산화수소를 물과 산소로 전환시키는 catalase-peroxidase katG (Vv-katG) 유전자를 클로닝 하였으며 그 염기서열을 분석하였다. Vv-katG 유전자는 총 2,172 nucleotide로 이루어져 있으며, 분자량 79,530-Da의 723개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하고 있다. V. vulnificus의 katG 유전자는 그 DNA 염기서열에 있어 V. cholerae의 catalase-peroxidase 유전자와 78%의 상동성을 나타냈다. 그리고 Vv-KatG의 아미노산 서열은 Vibrio cholerae catalase-peroxidase (85%), Synechococcus sp. catalase-peroxidase (77%), Legionella pneumophila catalase-peroxidase KatB (75%), Agrobacterium tumefaciens catalase(72%), Synechocystis sp. catalase HPI (71%), Bacillus stearothermophilus catalase (66%), 그리고 E. coli hydroperoxidase HPI (59%) 등과 같은 여러 세균의 catalase-peroxidase와 높은 상동성을 나타냈다. V. vulnificus 에서 KatG catalase-peroxidase의 생리학적 역할을 알아보기 위해 positive selection suicide vector인 pKAS32를 사용하여 Vv-katG deletion mutant를 제조하였다. Vv-katG mutant는 H₂O₂처리에 대해 현저한 감수성을 나타냈다. 그리고 wild type V. vulnificus를 60 μM H₂O₂로 30분 동안 전처리 하여 Vv-KatG를 induction 시킬 경우 치사 농도인 4 mM H₂O₂ 에 대해서도 높은 저항성을 나타내었다. 이러한 adaptation 현상은 katG mutant에서는 관찰되지 않았다. Catalase-peroxidase 활성이 사라졌음에도 불구하고, katG 돌연변이주는 정상 균주와 비교해서 배양 24 시간까지 정상적인 배가시간을 보였다. 그러나 오랜 기간동안 교반 배양 시 돌연변이주의 viability 는 배양 24 시간 이후 정상 균주에 비해 보다 빠르게 감소하였다. 게다가, 낮은 온도와 인공바닷물의 영양 결핍 상태에서 배양 시 돌연변이주의 viability는 정상 균주에 비해 보다 신속히 감소하였다. 돌연변이주의 경우 일단 배양이 불가능한 VBNC 상태가 되면 정상 균주에서 보였던 어떠한 resuscitation도 관찰되지 않았다. Non-denaturing PAGE 분석 결과 Vv-KatG 는 V. vulnificus에 존재하는 유일한 catalase 이며, catalase-peroxidase KatG는 cytoplasmic fraction에 위치하고 있음을 알 수 있다. 60 μM H₂O₂ 전처리에 따른 Vv-KatG induction 은 Western blot analysis에 의해 증명되었다. H₂O₂ 첨가에 의해 induction된 세균은 지수생장기와 휴지기 모두에서 더 높은 수준의 Vv-KatG 발현을 보여주었다. katG 유전자 발현의 조절 단계를 알아보기 위해 chromosomal 또는 plasmid P_katG::lacZ transcriptional reporter strain을 사용하여 Vv-lacZ deletion mutant에서 katG 유전자의 전사활성을 조사하였다. 60 μM H₂O₂ 전처 리에 따른 어떠한 katG transcription도 관찰되지 않았다. 이를 토대로 Vv-KatG 발현은 전사 후 수준에서 조절되는 것으로 사료된다. 이상의 분자생물학적 및 생리적인 연구 분석 결과를 종합해 볼 때, V. vulnificus catalase-peroxidase가 자연환경에 생존할 수 있는 oxidative stress, starvation, low temperature, 그리고 hyperosmolarity 등의 다양한 스트레스에 대한 저항성에 중요한 역할을 담당할 것으로 사료된다.
Vibrio vulnificus is a halophilic estuarine bacterium that causes necrotizing wound infections and fatal septicemia. The microorganism encounters a wide variety of stresses in the natural niche and during infection process. V. vulnificus experiences fluctuations of temperature, salinity, and nutrien...
Vibrio vulnificus is a halophilic estuarine bacterium that causes necrotizing wound infections and fatal septicemia. The microorganism encounters a wide variety of stresses in the natural niche and during infection process. V. vulnificus experiences fluctuations of temperature, salinity, and nutrients through changing seasons. The pathogen also has to survive against the stresses imposed by host defense mechanisms. The alternative sigma factor σ^38 (RpoS) are well known to regulate expression of multiple genes coping with a wide spectrum of stresses. While trying to identify rpoS, we came to clone a catalase-peroxidase instead. In the present study, we cloned the catalase-peroxidase katG gene and investigated molecular biological and physiological roles of the KatG protein. Using a cosmid genomic library of V. vulnificus type strain ATCC29307, we have cloned and sequenced the katG gene of V. vulnificus (Vv-katG). The catalase- peroxidase is involved in the dismutation of H₂O₂, leaving O₂ and water as byproducts. Vv-katG is composed of a total of 2,172-bp nucleotides encoding 723 amino acid protein with estimated molecular mass of 79,530-Da. The DNA sequence of the Vv-katG showed 78% homology with catalase-peroxidase gene of V. cholerae. The deduced amino acid sequence of the Vv-KatG showed high homologies to multiple bacterial catalase-peroxidase such as Vibrio cholerae catalase-peroxidase (85%), Synechococcus sp. catalase-peroxidase (77%), Legionella pneumophila catalase-peroxidase KatB (75%), Agrobacterium tumefaciens catalase (72%), Synechocystis sp. catalase HPI (71%), Bacillus stearothermophilus catalase (66%), and Escherichia coli hydroperoxidase HPI (59%). To analyze the physiological role of the KatG catalase-peroxidase, a Vv-katG deletion mutant was constructed by allelic replacement using a positive selection suicide vector, pKAS32. Vv-katG mutant showed a marked sensitivity to H₂O₂ treatment. Adaptation of wild type V. vulnificus with 60 μMH₂O₂ pretreatment for 30 min resulted in an enhanced resistance to lethal dose of 4 mM H₂O₂. The adaptation phenomenon was not observed in the katG mutant. Despite the absence of catalase-peroxidase activity, the mutant showed normal doubling time until 24 hr culture when compared with the isogenic wild type. However, viability decreased more rapidly after 24 hr in the mutant, when the old cultures were vigorously agitated. In addition, viability of the mutant decreased more rapidly when the strain was rendered to low temperature and starvation in artificial seawater. No resuscitation of the mutant was observed once the cells became non-culturable. The Vv-KatG was the only catalase observed on the non-denaturing PAGE analysis and was localized only to the cytoplasmic fraction. Vv-KatG induction by 60 μM H₂O₂ pretreatment was proved by Western blot analysis. H₂O₂ induced cells showed higher level of Vv-KatG during both exponential and stationary phases. To determine whether the katG expression is controlled at the transcriptional level, transcriptional activity of katG gene was examined in the Vv-lacZ deletion mutant using a chromosomal or a plasmid P_katG::lacZ transcriptional reporter strain. No significant katG transcription was not observed by the 60 μM H₂O₂ pretreatment. Vv-KatG expression appeared to be regulated at the post-transcriptional level. By functional analysis, we propose that V. vulnificus catalase-peroxidase plays a pluripotent role in resisting to oxidative stress, carbon starvation, low temperature, and hyperosmolarity that V. vulnificus might encounter in environment.
Vibrio vulnificus is a halophilic estuarine bacterium that causes necrotizing wound infections and fatal septicemia. The microorganism encounters a wide variety of stresses in the natural niche and during infection process. V. vulnificus experiences fluctuations of temperature, salinity, and nutrients through changing seasons. The pathogen also has to survive against the stresses imposed by host defense mechanisms. The alternative sigma factor σ^38 (RpoS) are well known to regulate expression of multiple genes coping with a wide spectrum of stresses. While trying to identify rpoS, we came to clone a catalase-peroxidase instead. In the present study, we cloned the catalase-peroxidase katG gene and investigated molecular biological and physiological roles of the KatG protein. Using a cosmid genomic library of V. vulnificus type strain ATCC29307, we have cloned and sequenced the katG gene of V. vulnificus (Vv-katG). The catalase- peroxidase is involved in the dismutation of H₂O₂, leaving O₂ and water as byproducts. Vv-katG is composed of a total of 2,172-bp nucleotides encoding 723 amino acid protein with estimated molecular mass of 79,530-Da. The DNA sequence of the Vv-katG showed 78% homology with catalase-peroxidase gene of V. cholerae. The deduced amino acid sequence of the Vv-KatG showed high homologies to multiple bacterial catalase-peroxidase such as Vibrio cholerae catalase-peroxidase (85%), Synechococcus sp. catalase-peroxidase (77%), Legionella pneumophila catalase-peroxidase KatB (75%), Agrobacterium tumefaciens catalase (72%), Synechocystis sp. catalase HPI (71%), Bacillus stearothermophilus catalase (66%), and Escherichia coli hydroperoxidase HPI (59%). To analyze the physiological role of the KatG catalase-peroxidase, a Vv-katG deletion mutant was constructed by allelic replacement using a positive selection suicide vector, pKAS32. Vv-katG mutant showed a marked sensitivity to H₂O₂ treatment. Adaptation of wild type V. vulnificus with 60 μMH₂O₂ pretreatment for 30 min resulted in an enhanced resistance to lethal dose of 4 mM H₂O₂. The adaptation phenomenon was not observed in the katG mutant. Despite the absence of catalase-peroxidase activity, the mutant showed normal doubling time until 24 hr culture when compared with the isogenic wild type. However, viability decreased more rapidly after 24 hr in the mutant, when the old cultures were vigorously agitated. In addition, viability of the mutant decreased more rapidly when the strain was rendered to low temperature and starvation in artificial seawater. No resuscitation of the mutant was observed once the cells became non-culturable. The Vv-KatG was the only catalase observed on the non-denaturing PAGE analysis and was localized only to the cytoplasmic fraction. Vv-KatG induction by 60 μM H₂O₂ pretreatment was proved by Western blot analysis. H₂O₂ induced cells showed higher level of Vv-KatG during both exponential and stationary phases. To determine whether the katG expression is controlled at the transcriptional level, transcriptional activity of katG gene was examined in the Vv-lacZ deletion mutant using a chromosomal or a plasmid P_katG::lacZ transcriptional reporter strain. No significant katG transcription was not observed by the 60 μM H₂O₂ pretreatment. Vv-KatG expression appeared to be regulated at the post-transcriptional level. By functional analysis, we propose that V. vulnificus catalase-peroxidase plays a pluripotent role in resisting to oxidative stress, carbon starvation, low temperature, and hyperosmolarity that V. vulnificus might encounter in environment.
주제어
#Catalase-peroxidase katG 유전자 Vibrio vulnificus 분자생물학
학위논문 정보
저자
김춘미
학위수여기관
전남대학교 대학원
학위구분
국내박사
학과
식품공학과
지도교수
최상호
발행연도
2001
총페이지
93p.
키워드
Catalase-peroxidase katG 유전자 Vibrio vulnificus 분자생물학
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