저온 미생물인 Bacillus sp.에서 생성되는 extracellular protease 중에서 serine protease SE910을 60 80% ammonium sulfate fractionation, QAE A-25 anion exchange chromatography, SP C-25 cation exchange chromatography, Sephacrly S-100 gel filtration chromatography를 통해 정제하였고, 이를 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 통해 순수 분리하였다. Protease SE910을 생성해 내는 bacteria의 정확한 종과 속을 알기 위해 16s rDNA seqeuncing과 gyrA seqeuncing을 통해서 동정해 본 결과로서 Bacillus amyloliquefaciens임을 알았고, 최적 pH는 합성기질인 N-p-Tosyl-Glu-Pro-Lys pNA를 이용해서 pH 8.0임을 밝히고, protease SE910의 각 아미노산 잔기에 대해 여러 화학적인 modification을 행하여 효소의 활성에 있어서 불확성 측정을 통해 효소 활성에 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기를 찾았다. protease SE910은 각 아미노산 잔기의 modification에 대해 lysine과 carboxyl group에 대한 chemical modification에 불활성도가 측정되었으므로 효소의 활성부위에 lysine과 carboxly group의 중요 역할이 예상된다. PMSF에 대한 modification 결과는 serine inhibitor로써 큰 불활성도가 측정되었으므로 protease SE910이 serine protease임을 뒷받침해 준다. 또한 아미노산 P'2 site의 아미노산들을 달리 해서 아미노산이 달라짐에 따른 kinetics를 비교를 통해서 endopeptidase로서의 다른 반응 속도를 나타내는 것을 살펴보았다. 부분 저해제로서의 Bestatin을 이용하여 조건에 따른 경향을 살펴본 결과 효소만을 넣어 예비 반응을 시킨 것과 효소와 합성기질을 예비 반응시킨 것과 효소와 저해제를 예비 반응시킨 것을 비교해 본 결과 속도와 기질변화를 본 것에서는 효소와 합성기질을 예비 반응시킨 것이 우세하게 반응하고 있는 것을 볼 수 있지만, Linweaver-Burk plot에서는 효소만을 예비 반응시킨 것이 우세하였다. 즉, 합성기질과 저해제를 같이 첨가하였을 때 합성기질이 저해제 보다 더 경쟁적으로 효소의 활성 부위와 결합함을 볼 수 있다.
저온 미생물인 Bacillus sp.에서 생성되는 extracellular protease 중에서 serine protease SE910을 60 80% ammonium sulfate fractionation, QAE A-25 anion exchange chromatography, SP C-25 cation exchange chromatography, Sephacrly S-100 gel filtration chromatography를 통해 정제하였고, 이를 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 통해 순수 분리하였다. Protease SE910을 생성해 내는 bacteria의 정확한 종과 속을 알기 위해 16s rDNA seqeuncing과 gyrA seqeuncing을 통해서 동정해 본 결과로서 Bacillus amyloliquefaciens임을 알았고, 최적 pH는 합성기질인 N-p-Tosyl-Glu-Pro-Lys pNA를 이용해서 pH 8.0임을 밝히고, protease SE910의 각 아미노산 잔기에 대해 여러 화학적인 modification을 행하여 효소의 활성에 있어서 불확성 측정을 통해 효소 활성에 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기를 찾았다. protease SE910은 각 아미노산 잔기의 modification에 대해 lysine과 carboxyl group에 대한 chemical modification에 불활성도가 측정되었으므로 효소의 활성부위에 lysine과 carboxly group의 중요 역할이 예상된다. PMSF에 대한 modification 결과는 serine inhibitor로써 큰 불활성도가 측정되었으므로 protease SE910이 serine protease임을 뒷받침해 준다. 또한 아미노산 P'2 site의 아미노산들을 달리 해서 아미노산이 달라짐에 따른 kinetics를 비교를 통해서 endopeptidase로서의 다른 반응 속도를 나타내는 것을 살펴보았다. 부분 저해제로서의 Bestatin을 이용하여 조건에 따른 경향을 살펴본 결과 효소만을 넣어 예비 반응을 시킨 것과 효소와 합성기질을 예비 반응시킨 것과 효소와 저해제를 예비 반응시킨 것을 비교해 본 결과 속도와 기질변화를 본 것에서는 효소와 합성기질을 예비 반응시킨 것이 우세하게 반응하고 있는 것을 볼 수 있지만, Linweaver-Burk plot에서는 효소만을 예비 반응시킨 것이 우세하였다. 즉, 합성기질과 저해제를 같이 첨가하였을 때 합성기질이 저해제 보다 더 경쟁적으로 효소의 활성 부위와 결합함을 볼 수 있다.
Extracellular serine protease SE910 from Bacillus sp. was purified by 60 80% ammonium sulfate fractionation, QAE A-25 anion exchange chromatography, SP C-25 cation exchange chromatography, and Sephacrly S-100 gel filtration chromatography. The bacteria producing protease SE910 was identified by 16s ...
Extracellular serine protease SE910 from Bacillus sp. was purified by 60 80% ammonium sulfate fractionation, QAE A-25 anion exchange chromatography, SP C-25 cation exchange chromatography, and Sephacrly S-100 gel filtration chromatography. The bacteria producing protease SE910 was identified by 16s rDNA sequencing and gyrA sequencing and defined Bacillus amyloliquefaciens. The using synthetic substrate, N-p-Tosyl-Glu-Pro-Lys pNA, was determined optimum pH 8 and each amino acid in protease SE910 was modified and measured remaining activities to find important amino acid in active-site protease SE910. Protease SE910 was determined inactivities lysine and carboxly group. Chemical modifiers, lysine and carboxly group, will be recommended important roles in active-site protease SE910. The result from modification of PMSF was determined inactive for PMSF. Therefore protease SE910 was serine protease. Endopeptidase had various binding-velocity through different amino acid P'2 site kinetics were compared with each kinetics. Partial inhibitor, bestatin, was used that effects of order compared with the velocity and the concentration of substrate and Linweaver-burk plot. Pre-incubated enzyme and substrate was more superior than others on the velocity and the concentration of substrate, but pre-incubated only enzyme was superior in based on Linweaver-Burk plot. Therefore a synthetic substrate was more competitive that an inhibitor on enzyme active site.
Extracellular serine protease SE910 from Bacillus sp. was purified by 60 80% ammonium sulfate fractionation, QAE A-25 anion exchange chromatography, SP C-25 cation exchange chromatography, and Sephacrly S-100 gel filtration chromatography. The bacteria producing protease SE910 was identified by 16s rDNA sequencing and gyrA sequencing and defined Bacillus amyloliquefaciens. The using synthetic substrate, N-p-Tosyl-Glu-Pro-Lys pNA, was determined optimum pH 8 and each amino acid in protease SE910 was modified and measured remaining activities to find important amino acid in active-site protease SE910. Protease SE910 was determined inactivities lysine and carboxly group. Chemical modifiers, lysine and carboxly group, will be recommended important roles in active-site protease SE910. The result from modification of PMSF was determined inactive for PMSF. Therefore protease SE910 was serine protease. Endopeptidase had various binding-velocity through different amino acid P'2 site kinetics were compared with each kinetics. Partial inhibitor, bestatin, was used that effects of order compared with the velocity and the concentration of substrate and Linweaver-burk plot. Pre-incubated enzyme and substrate was more superior than others on the velocity and the concentration of substrate, but pre-incubated only enzyme was superior in based on Linweaver-Burk plot. Therefore a synthetic substrate was more competitive that an inhibitor on enzyme active site.
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