[논문]Bacillus sp. SMMJ-2의 Keratinolytic protease 생산최적조건

박성민; 유대식

Bacillus sp. SMMJ-2의 Keratinolytic protease 생산최적조건
Optimization of Keratinolytic Protease Productions from Bacillus sp. SMMJ-2 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.34 no.2, 2006년, pp.150 - 157

초록
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스웨덴 스톡홀름의 항구부근 토양시료로부터 분리한 Bacillus sp. SMMJ-2는 단백질 분해활성이 높은 균주로써 특히 keratinolytic protease 생산성이 우수한 균주이다. 효소생산을 위한 최적 배지조성은 0.7% $K_2HPO_4$, 0.2% $KH_2PO_4$, 1.0% fructose, 1.2% soybean meal(roasted), 그리고 0.01% $Na_2CO_3$ 이었으며 배양초기 pH는 7.0, 배양온도는 30$^{\circ}C$에서 200 rpm조건일 때 효소생산이 가장 우수하였으며 이때의 활성은 105 units/ml/min로 조사되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Bacillus sp. SMMJ-2 producing extracellular keratinolytic protease was isolated from the Swedish soils. The optimal culture conditions for production of keratinolytic protease by Bacillus sp. SMMJ-2 were investigated. The optimal medium compositions for the keratinolytic protease production were 0.7% $K_2HPO_4$, 0.2% $KH_2PO_4$, 1.0% fructose,1.2% soybean meal (roasted), and 0.01% $Na_2CO_3$. Optimal initial pH and temperature for the production of keratinolytic protease were 7.0 and 30$^{\circ}C$, respectively. The keratinolytic protease production showed a maximum of 105 units/ml/min after 72 hours cultivation under the optimal culture conditions.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

Bacillus sp. SMMJ-2를 각각 0.1, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0, 그리고 10.0% 접종하여 keratinolytic protease를 조사하였다.
것으로 밝혀진 Bacillus sp. SMMJ-2를 이용하여 효소의 생산성을 증가시키기 위한 다양한 배양학적 특성을 조사하였다.
Bacillus sp. SMMJ-2에 의한 keratinolytic protease의 생산에 미치는 무기질소원의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 최적배지에 ammonium chloride, ammonium citrate, ammonium molybdate, ammonium nitrate, ammonium phosphate, ammonium sulfate, cadmium nitrate, potassium nitrate, 그리고 sodium nitrate를 0.1% 첨가하여 배지를 제조하고 4일간 배양하면서 keratinolytic protease 활성을 조사흐]- 였다.
Bacillus sp. SMMJ-2에 의한 keratinolytic protease의 생산에 미치는 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 효소생산 기본 배지의 탄소원인 fiuctose를 대조구로 하고 arabinose, whole chicken feather, galactose, glucose, lactose, maltose, mannitol, raffinose, sorbitol, soluble starch, 그리고 sucrose 를 fructose 대신 0.1% 첨가하여 배지를 제조한 후, 앞에서 조사된 효소생산 최적 배양조건에서 4일간 배양하면서 효소 활성의 변화를 조사하였다. Whole chicken feather은 지역 양계장에서 닭을 구입하여 수세, 건조하여 사용하였다.
질소원에 따른 Bacillus sp. SMMJ-2에 의한 keratinolytic protease의 생산은 유기질소원과 무기질소원으로 나누어서 조사하였다. 효소생산 배지에 탄소원으로 1.
fructose, 1.2% soybean meal(roasted), 0.7% K2HPO₄, 0.2% KH₂PO₄, 0.01% NajCOjS- 배지를 제조한 후, 최적배양조건인 30°C, 200 rpm으로 4일간 배양하면서 조사하였다. 5.
pH의 영향을 조사하기 위하여 호소생산 기본배지의 pH를 0.5N HC₁과 0.5N NaOH를 이용하여 4.0에서 11.0으로 조정하여 앞에서 조사된 효소생산 최적배양온도에서 180 rpm, 4 일간 배양하면서 조사하였다.
금속이온의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 효소의 생산을 위한 배지에 calcium chloride, ferric chloride, ferrous sulfate, lead chloride, magnesium chloride, magnesium sulfate, manganese chloride, manganese sulfate, mercuric chloride, potassium chloride, 그리고 zinc chloride 를 각각 0.1% 첨가하여 배지를 제조한 후 4일간 배양하면서 keratinolytic protease의 생산에 미치는 영향을 조사하였다.
12, 000 rpm, 4。(2에서 10분간 원심분리 하여 불용성의 기질을 제거하고 기질에서 유리된 sulphanilic acid 발색단을 흡광도 440 nm에서 측정하였다. 대조구는 기질에 조호소액을 첨가하지 않고 실험구와 함께 동일한 조건에서 반응시킨 후 TCA를 첨가하고 조효소액을 혼합하여 조사하였으며, 동일한 실험을 3회 반복한 후 그 평균수치로 keratinolytic protease활성을 나타내었다. Keratinolytic pro- tease에 대한 정의는 5CTC에서 1분간 기질과 반응하여 440 nm에서 흡광도 0.
대조구와 유사한 정도의 keratinolytic protease 활성을 나타내는 것으로 조사된 glucose와 fructose# 대상으로 농도에 따른 keratinolytic protease 활성을 조사하였다. Fructose 와 glucose를 각각 0.
5 ml의 folin reagent를 첨가하여 3VC에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 660 nm에서 흡광도를 측정하고 tyrosine standard curve에 대입하여 기질로부터“유리된 tyrosine량을 측정하였다. Protease활성은 37。(2에서 1분간 기질로부터 1 卩g의 tyrosine을 유리하는 효소의 총량을 1 unit로 정의하였다.
배양속도에 따른 keratinolytic protease 생산을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 효소생산을 위한 최적 pH로 배지를 제조한 후, 최적배양온도에서 각각 정치배양, 50, 100, 150, 180, 그리고 200 rpm으로 4일간 배양하면서 호소의 활성을 조사하였다.
Whole chicken feather은 지역 양계장에서 닭을 구입하여 수세, 건조하여 사용하였다. 질소원의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 최적 탄소 원을 첨가한 후, 1.2% soybean meal(roasted) 대신 유기질소 원인 beef extract, malt extract, peptone, polypeptone, soybean meal(raw), tryptone, urea, chicken feather, 그리고 yeast extract를 각각 1.2% 첨가하여 배지를 제조하고 4일간 배양하면서 효소의 활성을 조사하였다.
효소생산 기본배지의 K2HPO₄ 농도를 0, 0.3, 0.7, 1.0, 3.0, 그리고 5.0%旦 각각 조정한 후 효소생산 최적농도를 조사하였으며 KH₂P04는 0, 0.2, 0.5, 1.0, 3.0, 그리고 5.0%로 각각 조정하여 keratinolytic protease의 생산에 미치는 영향을 조사하였다.
0)에 접종한 후, 30。。에서 12시간동안 배양하여 전 배양액으로 사용하였다. 효소의 생산에 미치는 배양온도의 영향을 조사하기 위하여 전배양액 1.0%를 효소생산 기본배지 50 ml 에 접종한 후 24, 30, 37, 45, 그리고 5UC에서 180 rpm, 4일간 배양하면서 효소의 활성을 조사하였다.

대상 데이터

1% 첨가하여 배지를 제조한 후, 앞에서 조사된 효소생산 최적 배양조건에서 4일간 배양하면서 효소 활성의 변화를 조사하였다. Whole chicken feather은 지역 양계장에서 닭을 구입하여 수세, 건조하여 사용하였다. 질소원의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 최적 탄소 원을 첨가한 후, 1.

이론/모형

Keratinolytic protease 활성은 azo-casein을 기질로 이용하는 Sangali 등[16]의 방법을 이용하였다. 배양액을 12, 000 rpm, 4。(2에서 10분간 원심분리 한 후, 상등액을 조 효소액으로 사용하였다.
()1 을 증가시키는 효소량을 1 unit로 흐}였다. Protease 활성은 Lowry 등[1 기의 방법을 이용하였다. 즉, 조효소액 250(11를 0.

성능/효과

유기질 소원으로 soybean meal(roasted)을 첨가하지 않은 경우에 keratinolytic protease활성은 매우 낮게 조사되었으며 이 결과를 바탕으로 질소원으로 soybean meal(roasted)으】 공급이 keratin이ytic protease의 생산에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다. 1.2%의 soybean meal(roasted)을 공급하였을 때가장 높은 활성을 나타내었으며 0.6%와 1.8%의 경우에도 비슷한 수준의 높은 활성을 나타내었고 2.4%와 3.0%의 경우에는 배양 4일째에 가장 높은 활성을 나타내었다.
Fructose 와 glucose를 각각 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 그리고 3.0%의 농도로 첨가하여 배지를 제조한 후 배양하면서 keratinolytic protease활성을 조사한 결과, 0.1%의 glucose를 첨가하였을 때 1.0% 什uctose를 첨가한 경우와 비교하여 배양 3일째 93%의 활성을 나타내는 것으로 나타났으나, glucose의 경우 농도가- 증가할수록 활성이 약간씩 감소하는 것으로 조사되었다. Fructose의 경우에는 1.
SMMJ-2의 keratinolytic protease의 생산을 위한 탄소 원으로 적합하지 않았던 앞선 보고[15]와 동일한 결과를 나타내었다. Protease 활성은 배양 2일째까지 galactose를 첨가한 경우 각각 84, 400 units/ml/min으로 가장 높게 조사되었으며 , 3일째는 maltose를 첨가한 경우에(420 units/ml/min), 그리고 4일째는 sorbitol을 첨가한 경우에 640 units/ml/min으로 가장 높게 조사되었다.
0으로 보고한 Anbu 등[23}과 김 등[24]의 결과와는 약간의 차이를 나타내었다. Protease 활성의 경우에도 pH 7.0 에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 약산성(pH₆₀)에서약알카리성(pH 10.0) 사이의 범위에서 전반적으로 높은 protease 활성을 나타내었다.
Bacillus sp. SMMJ-2는 pH 4.0에서는 생육을 하지 못하였으나, pH 4.0을 제외한 모든 조건에서 pH 7.0과 비교하였을 때 80% 이상의 keratinolytic protease 활성을 나타내는 것으로 조사되었다. 그리고 pH 5.
이 결과로 볼 때 Bacillus sp. SMMJ-2에 의해서 생산되어지는 keratinolytic protease는 고온의 배양조건 보다는 37°C 이하의 상온조건에서 보다 양호한 생산을 한다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 2UC에서 30。(6보다 두 배 이상의 keratinolytic protease를 생산한다고 보고한 Shohei 등[18}의 결과보다는 조금 높은 배양온도였으며 37°C로 보고한 전 등 [19}의 결과와는 유사하였고 45°C로 보고한 Cheng 등[20}의 결과와는 상이하였으며 70°C로 보고한 Letoumear 등[21]의 결과와는 많은 차이를 나타내었다.
무기염으로 첨가한 K2HPO₄의 농도에 따른 keratinolytic protease 활성을 조사한 결과, 0% 경우에는 배양 3일째 대조 구인 0.7%와 비교하였을 때 약 92%의 활성을 나타내었으며 0.3%와 1.0%의 경우에도 97%로 조사되었다. 그러나 3.
따라서 이후의 실험에서는 무기 질소원을 첨가하지 않았다. 무기질 소원을 첨가한 대부분의 배지조건에서 keratinolytic protease활성은 대조구에 비하여 10% 정도 저해되는 것으로 조사되었다. 그리고, cadmium nitrate에 의해서는 Bacillus sp.
SMMJ-2가 증식을 하지 못하였다. 배양 3일째 대조구의 경우에 105 units/ml/min의 활성을 나타내었고 potassium chloride를 첨가한 경우에만 대조구와 비교할 때 98%의 활성을 나타내었으며 배양 4일째에는 대조구에 비하여 높은 활성을 나타내었다. 이 결과는 0.
0% 접종한 경우 배양 1일째와 2일째 가장 높은 keratinolytic protease 활성을 나타내었으나 다른 경우와 큰차이는 나타내지 않았다. 배양 3일째에는 10.0%를 제외한 모든 경우에서 유사한 keratinolytic protease 활성을 나타내었으며 4일째에는 모든 조건에서 활성 이 감소하는 것으로 조사되었으며 5.0%와 10.0%의 경우에는 다른 조건보다 보다 많이 감소하는 것으로 조사되었다(Fig. 8).
배양속도에 따른 keratinolytic protease 활성을 조사하기 위하여 정치배양 및 다양한 rpm으로 진탕 배양한 결과, 200 rpm으로 진탕배양 하였을 때 108 units/ml/min으로 가장 높은 keratinolytic protease 활성을 나타내었다. 180 rpm으로 배양한 경우에도 2Q0 rpm과 유사한 활성을 나타내었으며 100 rpm 이상의 진탕속도 에서는 200 rpm과 비교하였을 때 96% 이상의 활성을 나타내는 것으로 조사되었다.
5와 같다. 유기질 소원으로 soybean meal(roasted)을 첨가하지 않은 경우에 keratinolytic protease활성은 매우 낮게 조사되었으며 이 결과를 바탕으로 질소원으로 soybean meal(roasted)으】 공급이 keratin이ytic protease의 생산에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다. 1.
째 첨가한 탄소원에 의한 keratinolytic protease활성은 전반적으로 대조구인 fructose와 큰 차이를 나타내지 않았으나, arabinose, maltose 그리고 soluble starch를 첨가한 경우는 대조 구와 비교할 때 67% 정도의 keratinolytic protease 활성을 나타내었고 chicken feather를 첨가한 경우에는 12%를 나타내었다. 배양 2일째 chicken feather> 제외한 다른 탄소 원의 경우에 대조구와 유사한 keratinolytic protease 활성을 나타내었으나, 배양 3일과 4일째는 fructose!- 첨가한 대조 구가 102 units/ml/min, 101 units/ml/min으로 가장 높은
첨가하여 30°C에서 200 rpm으로 배양하면서 keratinolytic protease 활성을 조사한 결과 배양 3일째 ammonium sulfate 를 첨가한 경우에 대조구와 동일한 106 units/ml/min의 활성을 나타내었으나, keratinolytic protease 생산성에 있어서 무기질 소원의 첨가에 따른 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서 이후의 실험에서는 무기 질소원을 첨가하지 않았다.
한 결과, 배양 1일째 pH 11.0의 경우에는 균은 증식하였으나 keratinolytic protease 활성은 확인되지 않았으나 배양 2 일째 이후부터는 활성을 확인할 수 있었으며 pH 7.0에서 배양 3일째 103 uints/ml/min으로 가장 높은 keratinolytic protease 활성을 나타내었다. Bacillus sp.
SMMJ-2에 의한 keratinolytic protease의 생산은 유기질소원과 무기질소원으로 나누어서 조사하였다. 효소생산 배지에 탄소원으로 1.0% 什uctose를첨가하고 대조구인 1.2% soybean meal(roasted) 대신에 다양한 유기 질소원을 첨가하여 30°C, 200 rpm으로 배양하면서 조人]■한 결고}, soybean meal(roasted, and raw), chicken feather, polypeptone, 그리고 yeast extract에서만 keratinolytic protease 활성을 확인할 수 있었다. Beef extract, skim milk, peptone, 그리고 trypt이le을 첨가한 경우에는 Bacillus sp.
SMMJ-2는 단백질 분해활성이 높은 균주로써 특히 keratinolytic protease 생산성이 우수한 균주이다. 효소생산을 위한 최적 배지조성은 0.7% K2HPO₄, 0.2% KH₂PO₄, 1.0% fructose, 1.2% soybean meal(roasted), 그리고 0.01% Na2CO₃ 이었으며 배양초기 pH는 7.0, 배양온도는 30°C에서 200 rpm 조건일 때 효소생산이 가장 우수하였으며 이때의 활성은 105 units/ml/min로 조사되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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