연구 목적 : 제대혈에는 골수와 말초 혈액에 비해 상당히 높은 비율의 다능성 조혈모세포 및 줄기세포가 존재한다. 최근에는 제대혈에서 얻어진 조혈모세포를 혈액 종양 및 여러 비종양 질환의 치료에 이용하려는 노력이 이어지고 있으나, 제대혈의 여러 세포들 중 이식편대 숙주반응(graft-versus-host disease) 유발에 관여하는 림프구의 면역학적인 특성에 관한 연구는 여러 가지 문제점에 의해 제한을 받는다. 즉 미성숙 세포가 많고, 현재까지 보고된 실험실에서의 배양 방법들이 저자들마다 서로 차이가 많으며, 결과가 일정치 않아 연구 방법 설정에 많은 어려움이 있어 다양한 연구가 이루어지지 못하고 있다. 성인에서의 림프구에 대한 연구도 실험실 배양 및 증폭(expansion)이 까다롭다는 점 때문에 많은 제한을 받고 있다. 성인에서와 달리 제대혈 T 림프구는 T 림프구 ...
연구 목적 : 제대혈에는 골수와 말초 혈액에 비해 상당히 높은 비율의 다능성 조혈모세포 및 줄기세포가 존재한다. 최근에는 제대혈에서 얻어진 조혈모세포를 혈액 종양 및 여러 비종양 질환의 치료에 이용하려는 노력이 이어지고 있으나, 제대혈의 여러 세포들 중 이식편대 숙주반응(graft-versus-host disease) 유발에 관여하는 림프구의 면역학적인 특성에 관한 연구는 여러 가지 문제점에 의해 제한을 받는다. 즉 미성숙 세포가 많고, 현재까지 보고된 실험실에서의 배양 방법들이 저자들마다 서로 차이가 많으며, 결과가 일정치 않아 연구 방법 설정에 많은 어려움이 있어 다양한 연구가 이루어지지 못하고 있다. 성인에서의 림프구에 대한 연구도 실험실 배양 및 증폭(expansion)이 까다롭다는 점 때문에 많은 제한을 받고 있다. 성인에서와 달리 제대혈 T 림프구는 T 림프구 수용체의 발현도가 낮고, 항CD3 항체와의 반응에 따른 interleukin-2(IL-2), interferon-g(IFN-g)의 생성이 감소되어 있으며 세포독성 T 림프구의 활성화 유도도 쉽지 않다. 그렇지만 제대혈에서 분리해 낸 림프구, 특히 T 림프구는 적절한 배양 환경만 확립된다면 다양한 기능을 가진 여러 세포로 분화할 수 있고, 자기 복제능이 탁월하다. 종양학과 관련하여서는 특정 종양세포에 반응하는 면역세포 분획을 선택적으로 배양, 증폭시켜 항 종양성을 갖도록 하여 세포면역요법에 적용하는 것과 같은 임상적 응용에 대한 기대효과도 크다. 따라서 본 연구의 목적은 제대혈 T 림프구를 분리하여 면역학적 표현형이 성인 말초혈액의 경우와 어떠한 차이를 보이는지 확인하고, 제대혈을 여러 방법으로 배양하여 T 림프구의 증폭을 위한 최적 조건을 확립한 후, 증폭 전후의 림프구의 면역학적 특성을 서로 비교 분석하고자 하였다. 연구 방법 : 정상 만삭 산모 40명을 대상으로 하여 태반이 만출되기 전 제대혈을 채취하였다. 배양 전 제대혈 림프구의 세포 표식자 및 혈액학적 결과를 성인 말초 혈액의 경우와 비교하기 위해 정상 성인 10명으로부터 혈액을 채취하였다. 제대혈에서 림프구만을 분리한 후에 배양전후로 각각 림프구 세포 표식자 분석을 시행하여 결과를 비교하였다. 사용된 단일 클론 항체는 CD3, CD4, CD8, CD25, CD38, CD16/56, CD45RA, 및 CD45 RO에 대한 항체들이었다. 제대혈 T 림프구에 대한 최적의 배양 조건을 확인하기 위하여 두 단계로 연구를 시행하였다. 먼저 항CD3 항체가 T 림프구를 증폭시키는지 여부를 알아보기 위해 여러 농도의 항CD3 항체를 첨가하여 배양한 후 각각의 배양 시간, 항CD3 항체의 농도에 따라 결과를 서로 비교하였다. 또한 면역 증강 물질인 Loranthus yadoriki 가 항CD3 항체의 증폭 효과에 미치는 영향을 알아보고자 10㎍/ml의 L. yadoriki를 첨가하여 배양한 후 첨가하지 않은 군과 비교하였다. 다음으로 증폭된 T 림프구의 세포 표식자 변화 등의 면역학적 특성을 알아보기 위해 항CD3 항체로 전처리한 플라스크에서 림프구를 4일간 배양하고 빈 플라스크에 옮겨 IL-2 175U/ml를 첨가하여 10일간 배양하였다. 배양 후 세포 표식자 분석, 증폭능, 세포 살해능 등에 대한 분석을 시행하였다. 연구 결과 1. 제대혈에서는 성인의 말초혈액에 비해 뚜렷하게 대구증(macrocytosis), 백혈구 증가증이 관찰되었으며, 혈색소치도 증가되어 있었다. 2. 배양 전 제대혈 T 림프구의 세포 표식자 분석 결과 미성숙 세포를 의미하는 CD3^(+)CD38^(+)과 CD45RA^(+)의 발현을 보인 세포 수가 제대혈에서 성인의 말초 혈액에 비해 유의하게 높게 관찰되었다. 3. 항CD3 항체를 100ng/ml를 첨가한 경우에 제대혈 T 림프구가 유의하게 증폭하였다(p<0.05). L. yadoriki 의 첨가는 항CD3 항체만 첨가한 경우에 비해 제대혈 T 림프구의 증폭을 유의하게 증가시키지는 않았다. 배양시간에 따른 증폭율의 비교에서는 IL-2 단독으로 사용한 군에서는 3일 이후에는 세포수가 50% 이상 감소하였고 생존력도 90% 이하로 감소한 반면, 항CD3 항체와 IL-2를 함께 사용한 경우에서는 배양 제 6일에서 8일 사이에 높은 증폭을 보이다가 이후에는 증폭 속도가 감소되었다. 또한 세포의 생존력도 제6일까지는 평균 90% 이상이었으나, 그 이후에는 90% 미만으로 점차 감소하였다. 4. 항CD3 항체와 IL-2를 이용하여 배양한 경우에는 배양 전에 비해 전체 T 림프구 중 CD3^(+) 분획의 비율이 현저하게 증가하였고, CD45RA^(+) 분획은 감소한 반면 CD45RO^(+)는 증가하였다. 또한 CD25^(+)의 증가도 관찰되었다. 5.K562 세포 및 SK-OV-3 세포에 대한 배양 전후의 세포 살해능을 비교한 결과 SK-OV-3 세포에 대한 살해능은 effector/target(E/T) 세포의 비율을 40:1로 하였을 때 체외 증폭 이전에 비해 증폭 후에 유의하게 증가 하였다. 그렇지만 증폭 전후의 림프구에서 K562 세포에 대한 세포 살해능의 변화는 관찰되지 않았다. 결론 : 성인의 말초 혈액에 비해 제대혈에는 면역학적으로 기능이 미성숙한 T 림프구가 많음을 확인하였다. 항CD3 항체와 IL-2는 특정 제대혈 T 림프구의 분획을 선택적으로 증폭 및 성숙시켰다. 따라서 본 연구에서 사용한 배양 방법으로 제대혈 T 림프구의 원하는 특정 분획을 선택적으로 배양할 수 있고, 세포 살해능의 증가도 가져올 수 있을 것으로 판단된다.
연구 목적 : 제대혈에는 골수와 말초 혈액에 비해 상당히 높은 비율의 다능성 조혈모세포 및 줄기세포가 존재한다. 최근에는 제대혈에서 얻어진 조혈모세포를 혈액 종양 및 여러 비종양 질환의 치료에 이용하려는 노력이 이어지고 있으나, 제대혈의 여러 세포들 중 이식편대 숙주반응(graft-versus-host disease) 유발에 관여하는 림프구의 면역학적인 특성에 관한 연구는 여러 가지 문제점에 의해 제한을 받는다. 즉 미성숙 세포가 많고, 현재까지 보고된 실험실에서의 배양 방법들이 저자들마다 서로 차이가 많으며, 결과가 일정치 않아 연구 방법 설정에 많은 어려움이 있어 다양한 연구가 이루어지지 못하고 있다. 성인에서의 림프구에 대한 연구도 실험실 배양 및 증폭(expansion)이 까다롭다는 점 때문에 많은 제한을 받고 있다. 성인에서와 달리 제대혈 T 림프구는 T 림프구 수용체의 발현도가 낮고, 항CD3 항체와의 반응에 따른 interleukin-2(IL-2), interferon-g(IFN-g)의 생성이 감소되어 있으며 세포독성 T 림프구의 활성화 유도도 쉽지 않다. 그렇지만 제대혈에서 분리해 낸 림프구, 특히 T 림프구는 적절한 배양 환경만 확립된다면 다양한 기능을 가진 여러 세포로 분화할 수 있고, 자기 복제능이 탁월하다. 종양학과 관련하여서는 특정 종양세포에 반응하는 면역세포 분획을 선택적으로 배양, 증폭시켜 항 종양성을 갖도록 하여 세포면역요법에 적용하는 것과 같은 임상적 응용에 대한 기대효과도 크다. 따라서 본 연구의 목적은 제대혈 T 림프구를 분리하여 면역학적 표현형이 성인 말초혈액의 경우와 어떠한 차이를 보이는지 확인하고, 제대혈을 여러 방법으로 배양하여 T 림프구의 증폭을 위한 최적 조건을 확립한 후, 증폭 전후의 림프구의 면역학적 특성을 서로 비교 분석하고자 하였다. 연구 방법 : 정상 만삭 산모 40명을 대상으로 하여 태반이 만출되기 전 제대혈을 채취하였다. 배양 전 제대혈 림프구의 세포 표식자 및 혈액학적 결과를 성인 말초 혈액의 경우와 비교하기 위해 정상 성인 10명으로부터 혈액을 채취하였다. 제대혈에서 림프구만을 분리한 후에 배양전후로 각각 림프구 세포 표식자 분석을 시행하여 결과를 비교하였다. 사용된 단일 클론 항체는 CD3, CD4, CD8, CD25, CD38, CD16/56, CD45RA, 및 CD45 RO에 대한 항체들이었다. 제대혈 T 림프구에 대한 최적의 배양 조건을 확인하기 위하여 두 단계로 연구를 시행하였다. 먼저 항CD3 항체가 T 림프구를 증폭시키는지 여부를 알아보기 위해 여러 농도의 항CD3 항체를 첨가하여 배양한 후 각각의 배양 시간, 항CD3 항체의 농도에 따라 결과를 서로 비교하였다. 또한 면역 증강 물질인 Loranthus yadoriki 가 항CD3 항체의 증폭 효과에 미치는 영향을 알아보고자 10㎍/ml의 L. yadoriki를 첨가하여 배양한 후 첨가하지 않은 군과 비교하였다. 다음으로 증폭된 T 림프구의 세포 표식자 변화 등의 면역학적 특성을 알아보기 위해 항CD3 항체로 전처리한 플라스크에서 림프구를 4일간 배양하고 빈 플라스크에 옮겨 IL-2 175U/ml를 첨가하여 10일간 배양하였다. 배양 후 세포 표식자 분석, 증폭능, 세포 살해능 등에 대한 분석을 시행하였다. 연구 결과 1. 제대혈에서는 성인의 말초혈액에 비해 뚜렷하게 대구증(macrocytosis), 백혈구 증가증이 관찰되었으며, 혈색소치도 증가되어 있었다. 2. 배양 전 제대혈 T 림프구의 세포 표식자 분석 결과 미성숙 세포를 의미하는 CD3^(+)CD38^(+)과 CD45RA^(+)의 발현을 보인 세포 수가 제대혈에서 성인의 말초 혈액에 비해 유의하게 높게 관찰되었다. 3. 항CD3 항체를 100ng/ml를 첨가한 경우에 제대혈 T 림프구가 유의하게 증폭하였다(p<0.05). L. yadoriki 의 첨가는 항CD3 항체만 첨가한 경우에 비해 제대혈 T 림프구의 증폭을 유의하게 증가시키지는 않았다. 배양시간에 따른 증폭율의 비교에서는 IL-2 단독으로 사용한 군에서는 3일 이후에는 세포수가 50% 이상 감소하였고 생존력도 90% 이하로 감소한 반면, 항CD3 항체와 IL-2를 함께 사용한 경우에서는 배양 제 6일에서 8일 사이에 높은 증폭을 보이다가 이후에는 증폭 속도가 감소되었다. 또한 세포의 생존력도 제6일까지는 평균 90% 이상이었으나, 그 이후에는 90% 미만으로 점차 감소하였다. 4. 항CD3 항체와 IL-2를 이용하여 배양한 경우에는 배양 전에 비해 전체 T 림프구 중 CD3^(+) 분획의 비율이 현저하게 증가하였고, CD45RA^(+) 분획은 감소한 반면 CD45RO^(+)는 증가하였다. 또한 CD25^(+)의 증가도 관찰되었다. 5.K562 세포 및 SK-OV-3 세포에 대한 배양 전후의 세포 살해능을 비교한 결과 SK-OV-3 세포에 대한 살해능은 effector/target(E/T) 세포의 비율을 40:1로 하였을 때 체외 증폭 이전에 비해 증폭 후에 유의하게 증가 하였다. 그렇지만 증폭 전후의 림프구에서 K562 세포에 대한 세포 살해능의 변화는 관찰되지 않았다. 결론 : 성인의 말초 혈액에 비해 제대혈에는 면역학적으로 기능이 미성숙한 T 림프구가 많음을 확인하였다. 항CD3 항체와 IL-2는 특정 제대혈 T 림프구의 분획을 선택적으로 증폭 및 성숙시켰다. 따라서 본 연구에서 사용한 배양 방법으로 제대혈 T 림프구의 원하는 특정 분획을 선택적으로 배양할 수 있고, 세포 살해능의 증가도 가져올 수 있을 것으로 판단된다.
Objectives: The umbilical cord blood(UCB) has become an alternative source to bone marrow(BM) for the treatment of some hematological diseases and malignancies. T lymphocytes among many types of cells in cord blood are important in graft-versus-host disease, and have some different characteristics w...
Objectives: The umbilical cord blood(UCB) has become an alternative source to bone marrow(BM) for the treatment of some hematological diseases and malignancies. T lymphocytes among many types of cells in cord blood are important in graft-versus-host disease, and have some different characteristics when it is compared to lymphocytes in adult BM. They have low expression of T cell receptors, and produce less interleukin-2(IL-2) and interferon-γ(IFN-γ) in response to the anti-CD3 antibody. In addition, the T lymphocytes of UCB are difficult to expand in vitro, and no established culture system for T lymphocytes is available. However, once the culture system is optimized, the T-lymphocytes in UCB can be characterized and a certain population of the T lymphocytes with ability to response to cancer cells can be expanded for cancer treatment. The objectives of this study were, first to characterize the immunological differences of the T lymphocytes of UCB compared to adult blood T lymphocytes; second to expand the T lymphocytes in ex vivo condition of a short term culture, and last to assess the immunological function of the expanded T lymphocytes of UCB. Methods: The immunophenotypic study of 40 UCB and 10 adult peripheral blood(PB) was performed with the flow cytometry using a large panel of monoclonal antibodies in the double labeling. The fresh UCB mononuclear cells(MNCs) were isolated by Ficoll-Hypaque density centrifugation. The nonadherent MNC fractions were then cultured with the anti-CD3 antibody with or without Loranthus yadoriki (10mg/ml) at the concentration of 1, 10, and 100 ㎍/ml for 48 and 72 hours, respectively. The MNCs were cultured in the anti-CD3 antibody-coated flasks for 4 days. Then the cells were transferred to the non-coated flasks, which were added IL-2 175U/ml and cultured for another 10 days. Proliferative ability of UCB T lymphocytes, cell surface markers of expanded and unexpanded T lymphocytes, and cytotoxicity assays of the expanded T lymphocytes were performed. Results: 1. Macrocytosis, leukocytosis, and greater hemoglobin content in the red cells were the most prominent features of the UCB. 2. Cell surface markers of the UCB T lymphocytes were different from those of adult T cells significantly. UCB contained T lymphocytes that appear to phenotypically immature. 3. The UCB T lymphocytes cultured with the anti-CD3 antibody 100ng/ml showed a significant increase in the proliferative ability(p<0.05). The UCB lymphocytes kept increasing the cell numbers up to 8 days of the culture period, and then slowing down afterward. The cell viability on day 6 was more than 90%. 4. After culture in the anti-CD3 antibody coated flask with IL-2, expression of the activated T lymphocytes were increased significantly. 5. The cells cultured with the anti-CD3 antibody and IL-2 exhibited substantial killing activity on the SK-OV-3 target cells (E/T ratio 40:1) compared to the fresh UCB lymphocytes, but not on the K562 target cells. Conclusions: These data suggest that ex vivo combination of the anti-CD3 antibody and IL-2 significantly enhanced proliferation, activation, and maturation of the UCB T lymphocytes. Moreover cytotoxic potential of the expanded UCB T cells on the SK-OV-3 target cells was observed.
Objectives: The umbilical cord blood(UCB) has become an alternative source to bone marrow(BM) for the treatment of some hematological diseases and malignancies. T lymphocytes among many types of cells in cord blood are important in graft-versus-host disease, and have some different characteristics when it is compared to lymphocytes in adult BM. They have low expression of T cell receptors, and produce less interleukin-2(IL-2) and interferon-γ(IFN-γ) in response to the anti-CD3 antibody. In addition, the T lymphocytes of UCB are difficult to expand in vitro, and no established culture system for T lymphocytes is available. However, once the culture system is optimized, the T-lymphocytes in UCB can be characterized and a certain population of the T lymphocytes with ability to response to cancer cells can be expanded for cancer treatment. The objectives of this study were, first to characterize the immunological differences of the T lymphocytes of UCB compared to adult blood T lymphocytes; second to expand the T lymphocytes in ex vivo condition of a short term culture, and last to assess the immunological function of the expanded T lymphocytes of UCB. Methods: The immunophenotypic study of 40 UCB and 10 adult peripheral blood(PB) was performed with the flow cytometry using a large panel of monoclonal antibodies in the double labeling. The fresh UCB mononuclear cells(MNCs) were isolated by Ficoll-Hypaque density centrifugation. The nonadherent MNC fractions were then cultured with the anti-CD3 antibody with or without Loranthus yadoriki (10mg/ml) at the concentration of 1, 10, and 100 ㎍/ml for 48 and 72 hours, respectively. The MNCs were cultured in the anti-CD3 antibody-coated flasks for 4 days. Then the cells were transferred to the non-coated flasks, which were added IL-2 175U/ml and cultured for another 10 days. Proliferative ability of UCB T lymphocytes, cell surface markers of expanded and unexpanded T lymphocytes, and cytotoxicity assays of the expanded T lymphocytes were performed. Results: 1. Macrocytosis, leukocytosis, and greater hemoglobin content in the red cells were the most prominent features of the UCB. 2. Cell surface markers of the UCB T lymphocytes were different from those of adult T cells significantly. UCB contained T lymphocytes that appear to phenotypically immature. 3. The UCB T lymphocytes cultured with the anti-CD3 antibody 100ng/ml showed a significant increase in the proliferative ability(p<0.05). The UCB lymphocytes kept increasing the cell numbers up to 8 days of the culture period, and then slowing down afterward. The cell viability on day 6 was more than 90%. 4. After culture in the anti-CD3 antibody coated flask with IL-2, expression of the activated T lymphocytes were increased significantly. 5. The cells cultured with the anti-CD3 antibody and IL-2 exhibited substantial killing activity on the SK-OV-3 target cells (E/T ratio 40:1) compared to the fresh UCB lymphocytes, but not on the K562 target cells. Conclusions: These data suggest that ex vivo combination of the anti-CD3 antibody and IL-2 significantly enhanced proliferation, activation, and maturation of the UCB T lymphocytes. Moreover cytotoxic potential of the expanded UCB T cells on the SK-OV-3 target cells was observed.
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