내동성 관련 유전자의 차등 발현을 이용한 보리 내동성 검정 Analysis of freezing tolerance using differential expression of freezing tolerance-related genes in barley(hordeum vulgare L.)원문보기
보리의 내동성 정도를 분석하기 위하여 내동성 관련 유전자의 차등 발현에 기초한 내동성 검정방법의 개발을 목적으로 본 연구를 다음과 같이 수행하였다. 보리의 내동성 관련 단백질의 탐색 동보리1호에서 저온에 의해 세포밖 공간에 단백질이 축적되며, 이러한 단백질은 호밀에서 발견된 반결빙 단백질의 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다. 동보리1호를 3일∼74일까지 저온처리하여 저온기간이 길어짐에 따라 세포밖 공간 단백질의 농도의 변화를 관찰한 결과 저온처리 30일을 전후로 하여 축적되는 단백질의 양이 가장 많고, 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 저온처리 53일의 동보리1호 와 저온처리하지 않은 대조구 동보리1호를 각각 3g(F/W)씩 사용하여 추출한 ...
보리의 내동성 정도를 분석하기 위하여 내동성 관련 유전자의 차등 발현에 기초한 내동성 검정방법의 개발을 목적으로 본 연구를 다음과 같이 수행하였다. 보리의 내동성 관련 단백질의 탐색 동보리1호에서 저온에 의해 세포밖 공간에 단백질이 축적되며, 이러한 단백질은 호밀에서 발견된 반결빙 단백질의 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다. 동보리1호를 3일∼74일까지 저온처리하여 저온기간이 길어짐에 따라 세포밖 공간 단백질의 농도의 변화를 관찰한 결과 저온처리 30일을 전후로 하여 축적되는 단백질의 양이 가장 많고, 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 저온처리 53일의 동보리1호 와 저온처리하지 않은 대조구 동보리1호를 각각 3g(F/W)씩 사용하여 추출한 apoplastic protein을 이용한 Two-Dimensional Gel Electrophoresis로 분석한 결과 약 pI 5.7, pI 7.0, pI 9.2의 27.7KD에서 CLP로 추정되는 단백질과 pI 6.2, pI 7.2, pI 9.2의 16, 31KD에서 TLP로 추정되는 단백질이 급격히 증가함을 확인하였다. 내동성 관련 단백질의 생산과 항체생산 pET32 plasmid를 이용하여 CLP, Dhn5를 E.coli.에서 발현하도록 구축하였고, 동보리1호로부터 분리한 16KD의 TLP 단백질을 토끼 피하에 주사하여 각각의 1차 항체를 생산하였다. 생산된 CLP, TLP polyclonal 항체를 이용하여 동보리1호의 세포밖 공간 단백질을 western 분석한 결과 내동성 관련 단백질인 27.7KD의 CLP가 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 확인하였고, 6, 26, 27, 30, 31KD의 TLP가 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 확인하였다. Dhn5는 대장균에서 항원 생산을 위한 단백질 생산 과정에 있다. CLP, TLP 항체를 이용한 Western 분석과 내동성 관련 유전자 primer를 이용한 Quantitative RT-PCR을 통한 내동성 검정 저온처리 기간이 길어짐에 따라 CLP 항체에 의한 반응 차이를 이용하여 내동성 정도의 차이를 확인하였다. 20일 저온처리 이후에 품종별 내동성을 명확히 구분할 수 있었다. TLP 또한 16, 26, 27, 30, 31KD의 단백질 항체 반응으로 내동성 정도의 차이를 확인하였다. 내동성 관련 유전자의 primer를 이용한 quantitative RT-PCR로 동보리1호에서 특이적인 band를 확인하였으며, 특히 Dhn5 primer에서 내동성 정도에 양적으로 일치하는 band를 확인하였다. In Situ Immunolocalization 분석과 Ion Leakage Test에 의한 내동성 검정 In Situ immunolocalization 분석에 의하여 내동성 관련 단백질의 축적 위치가 잎 조직의 양끝과 통도 조직임을 확인하였으며, 저온처리 기간이 길어짐에 따라 품종간 내동성 정도의 차이를 확인할 수 있었다. 또한 ion leakage test에 의한 상대적 내동성 정도의 검정으로 저온처리 20, 40일에서 품종간 차이를 확인하였다.
보리의 내동성 정도를 분석하기 위하여 내동성 관련 유전자의 차등 발현에 기초한 내동성 검정방법의 개발을 목적으로 본 연구를 다음과 같이 수행하였다. 보리의 내동성 관련 단백질의 탐색 동보리1호에서 저온에 의해 세포밖 공간에 단백질이 축적되며, 이러한 단백질은 호밀에서 발견된 반결빙 단백질의 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다. 동보리1호를 3일∼74일까지 저온처리하여 저온기간이 길어짐에 따라 세포밖 공간 단백질의 농도의 변화를 관찰한 결과 저온처리 30일을 전후로 하여 축적되는 단백질의 양이 가장 많고, 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 저온처리 53일의 동보리1호 와 저온처리하지 않은 대조구 동보리1호를 각각 3g(F/W)씩 사용하여 추출한 apoplastic protein을 이용한 Two-Dimensional Gel Electrophoresis로 분석한 결과 약 pI 5.7, pI 7.0, pI 9.2의 27.7KD에서 CLP로 추정되는 단백질과 pI 6.2, pI 7.2, pI 9.2의 16, 31KD에서 TLP로 추정되는 단백질이 급격히 증가함을 확인하였다. 내동성 관련 단백질의 생산과 항체생산 pET32 plasmid를 이용하여 CLP, Dhn5를 E.coli.에서 발현하도록 구축하였고, 동보리1호로부터 분리한 16KD의 TLP 단백질을 토끼 피하에 주사하여 각각의 1차 항체를 생산하였다. 생산된 CLP, TLP polyclonal 항체를 이용하여 동보리1호의 세포밖 공간 단백질을 western 분석한 결과 내동성 관련 단백질인 27.7KD의 CLP가 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 확인하였고, 6, 26, 27, 30, 31KD의 TLP가 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 확인하였다. Dhn5는 대장균에서 항원 생산을 위한 단백질 생산 과정에 있다. CLP, TLP 항체를 이용한 Western 분석과 내동성 관련 유전자 primer를 이용한 Quantitative RT-PCR을 통한 내동성 검정 저온처리 기간이 길어짐에 따라 CLP 항체에 의한 반응 차이를 이용하여 내동성 정도의 차이를 확인하였다. 20일 저온처리 이후에 품종별 내동성을 명확히 구분할 수 있었다. TLP 또한 16, 26, 27, 30, 31KD의 단백질 항체 반응으로 내동성 정도의 차이를 확인하였다. 내동성 관련 유전자의 primer를 이용한 quantitative RT-PCR로 동보리1호에서 특이적인 band를 확인하였으며, 특히 Dhn5 primer에서 내동성 정도에 양적으로 일치하는 band를 확인하였다. In Situ Immunolocalization 분석과 Ion Leakage Test에 의한 내동성 검정 In Situ immunolocalization 분석에 의하여 내동성 관련 단백질의 축적 위치가 잎 조직의 양끝과 통도 조직임을 확인하였으며, 저온처리 기간이 길어짐에 따라 품종간 내동성 정도의 차이를 확인할 수 있었다. 또한 ion leakage test에 의한 상대적 내동성 정도의 검정으로 저온처리 20, 40일에서 품종간 차이를 확인하였다.
Plants, including barley are able to synthesize a wide array of proteins to protect themselves against freezing conditions. The identification of these freezing tolerance-associated proteins and the elucidation of the mechanism for their antifreezing activity will give rise to many important applica...
Plants, including barley are able to synthesize a wide array of proteins to protect themselves against freezing conditions. The identification of these freezing tolerance-associated proteins and the elucidation of the mechanism for their antifreezing activity will give rise to many important applications such as molecular breeding and marker-assisted selection. For that purposes, an establishment of the methods to measure freezing tolerance in plants is essential. In this study, we developed new methods to estimate the degree of freezing tolerance based on differential expression of the corresponding genes in barley. Upon exposure to low temperature, it was shown that a unique set of proteins were accumulated in extracellular space of Dongbori 1 and the some of them showed an antifreezing aclivity. The accumulation of the proteins in the extracellular space during cold acclimation was increased gradually and there was a peak of accumulation at day 30 and then a gradual decrease. In the 2D (IEF/SDS-PAGE) analysis of the apoplastic proteins accumulated at day 53, the CLPs of 27.7 KD, at pI 5.7, pI 7.0 and pI 9.2 and the TLPs of 16.3 KD at pI 6.3, pI 7.2 and pI 9.2 were tentatively identified. The proteins involved in freezing tolerance, CLP and Dhn5 were produced in E.coli transformed with pET-CLP and pET-Dhn5, respectively and their polyclonal antibodies were produced. Western analysis of the apoplastic proteins with the CLP and TLP antiserum showed increased levels of the corresponding proteins as time for cold acclimation increased. Western analysis of apoplastic protein accumulated 20 days after cold acclimation using CLP antibody showed differential amounts corresponding to their freezing tolerance estimated by field test among 5 cultivars of barley(Dongboril, Olbori, Saechalsalbori, Albori, Doowonchapsalbori). The similar observation was also achieved using a western analysis with TLP antibody. Quantitative RT-PCR methods using the specific primers, CLP, TLP, GLP and Dhn5 were performed and showed that the levels of transcript. for Dhn5 in each of five cultivars during cold acclimation showed a close correlation to levels of the freezing tolerance as shown in plants. In situ immunolocalization analysis with Dongbori 1 showed localized accumulations of CLP at the edge of the leaves and around the vein and there was a correlation observed between the levels of the CLP and freezing tolerance among different cultivars. In addition, ion leakage tests showed that a cold acclimation could enhance a freeze tolerance in plants by showing a definite correlation between a length of the exposure to low temperature and degree of freezing tolerance. All these tests together, it appears that the more accurate experimental protocols to measure freezing tolerance in plant will be developed and will support many endeavors to enhance freezing tolerance in overwintering crops including barley.
Plants, including barley are able to synthesize a wide array of proteins to protect themselves against freezing conditions. The identification of these freezing tolerance-associated proteins and the elucidation of the mechanism for their antifreezing activity will give rise to many important applications such as molecular breeding and marker-assisted selection. For that purposes, an establishment of the methods to measure freezing tolerance in plants is essential. In this study, we developed new methods to estimate the degree of freezing tolerance based on differential expression of the corresponding genes in barley. Upon exposure to low temperature, it was shown that a unique set of proteins were accumulated in extracellular space of Dongbori 1 and the some of them showed an antifreezing aclivity. The accumulation of the proteins in the extracellular space during cold acclimation was increased gradually and there was a peak of accumulation at day 30 and then a gradual decrease. In the 2D (IEF/SDS-PAGE) analysis of the apoplastic proteins accumulated at day 53, the CLPs of 27.7 KD, at pI 5.7, pI 7.0 and pI 9.2 and the TLPs of 16.3 KD at pI 6.3, pI 7.2 and pI 9.2 were tentatively identified. The proteins involved in freezing tolerance, CLP and Dhn5 were produced in E.coli transformed with pET-CLP and pET-Dhn5, respectively and their polyclonal antibodies were produced. Western analysis of the apoplastic proteins with the CLP and TLP antiserum showed increased levels of the corresponding proteins as time for cold acclimation increased. Western analysis of apoplastic protein accumulated 20 days after cold acclimation using CLP antibody showed differential amounts corresponding to their freezing tolerance estimated by field test among 5 cultivars of barley(Dongboril, Olbori, Saechalsalbori, Albori, Doowonchapsalbori). The similar observation was also achieved using a western analysis with TLP antibody. Quantitative RT-PCR methods using the specific primers, CLP, TLP, GLP and Dhn5 were performed and showed that the levels of transcript. for Dhn5 in each of five cultivars during cold acclimation showed a close correlation to levels of the freezing tolerance as shown in plants. In situ immunolocalization analysis with Dongbori 1 showed localized accumulations of CLP at the edge of the leaves and around the vein and there was a correlation observed between the levels of the CLP and freezing tolerance among different cultivars. In addition, ion leakage tests showed that a cold acclimation could enhance a freeze tolerance in plants by showing a definite correlation between a length of the exposure to low temperature and degree of freezing tolerance. All these tests together, it appears that the more accurate experimental protocols to measure freezing tolerance in plant will be developed and will support many endeavors to enhance freezing tolerance in overwintering crops including barley.
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