韓國産 겨우살이(Viscum album coloratum)로부터 分離, 精製된 Lectin의 生物學的 活性 및 그 特性에 關한 硏究 Studies on the biological activities of lectin purified from Korean mistletoe(Viscum album coloratum) extracts and its characterization원문보기
본 연구는 한국에서 서식하는 참나무에서 기생하는 겨우살이 추출물을을 이용하여 면역증강 및 항종양 활성을 가지는 물질의 탐색하고 그것을 분리, 정제하여 특성을 규명하고자 다음과 같은 연구를 수행하였다 즉, 한국산 겨우살이 추출물의 항종양활성을 면역학적인 암 전이억제의 측면에서 조사하였으며, 종양백신 및 항원에 대한 adjuvant로의 응용 가능성을 모색였다. 또한, 한국산 겨우살이의 활성물질 중의 하나로 사료되는 lectin을 분리하여 그 생화학적 특징을 조사함과 동시에 면역증강 효과와 암전이 억제효과 등의 생리활성에 대해서도 검토하였다. 그리고 한국산 겨우살이 lectin 성분의 암세포에 대한 세포독성 효과가 apoptosis에 의한 것을 밝혔으며. lectin성분에 의한 이러한 생리0활성 효과를 세포생화학적 관점에서 조사하였다. 마지막으로 lectin에 대한 단일크론 항체를 생산하여 한국산 겨우살이 추출물에서 지표물질로 lectin의 정량을 위한 ELISA법 개발과, 단일크론 항체를 이용한immunoaffinity column의 제작 및 이를 이용한 lectin의 신속한 분리법을 확립하기 위한 연구를 수행하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. KM-110은 in vitro에서 여러가지 종양세포주에 대하여 수십 ㎍/ml 이하의 농도에서 ED_(50)값이 나타나는 세포독성 효과가 있었으나, in vivo에서는 100 ㎍을 정맥주사한 후에도 간과 신장의 기능에 영향을 미치지 않는 안전한 농도로 나타났다. 2. Hydrolyzed sephrose 4B column을 이용하여 KM-110으로부터 galactose 및 N-acethyl galalctosamin에 대한 당특이성을 가지는 lectin 성분인 KML-C를 분리하였다. KML-C는 전기영동분석 결과 비환원 상태에서는 60 Kda을 환원상태에서는 주로 29 Kda 및 33 Kda의 A- 및 B-chain으로 구성되는 heterodimer 형태였고, 히미한 26 Kda의 C-chain이 동시에 관찰되었다. 3. KML-C를 유럽산 겨우살이의 lectin 성분인 EML-1과 생화학적 특성을 비교 조사한 결과 당특이성, 분자량 및 amino acid sequence에서 차이가 있는 고유한 특성을 가진 lectin으로 밝혀졌다. 5. KML-C에 대한 단일크론 항체중에서 KML-C에 특이적으로 반응하는 9H7-D10 항체를 이용한 Immunoaffinity column을 만들어 KM-110으로부터 9H7-D10 항체와 반응하는 물질을 분리한 결과, KML- C의 C-chain이 제거된 순수한 KML-1가 분리되었다. 6. 생산된 단일크론항체의 특성을 조사한 결과, KML-1의 B-chain에 특이적으로 반응하며 KML-1의 세포독성 중화효과를 가지는 9H7-D10항체, KML-1의 A-chain과 EML-1의 A- 및 B-chain을 동시에 인식하나 EML-1만의 세포독성 중화효과를 가지는 8B11-2C5항체, 그리고 KML-1의 B-chain에 특이적으로 반응하나 세포독성 중화효과가 없는 3C2-H4항체등 크게 3종류의 특성을 가지는 것으로 나타났다. 7. KM-110 및 KML-1의 in vitro 에서 여러가지 종양세포주에 대한 세포살해 활성이 나타났으며 KML-1이 KM-110보다 높은 살해활성을 나타내어 KML-1은 KM-110의 활성물질인 것으로 밝혀졌고, 그들에 의한 세포살해 효과는 Ca^(+2)/Mg^(+2) 의존적인 endonuclase가 관여하는 전형적인 apoptosis인 것으로 밝혀졌다. 8. KM-110은 macrophage로부터 ...
본 연구는 한국에서 서식하는 참나무에서 기생하는 겨우살이 추출물을을 이용하여 면역증강 및 항종양 활성을 가지는 물질의 탐색하고 그것을 분리, 정제하여 특성을 규명하고자 다음과 같은 연구를 수행하였다 즉, 한국산 겨우살이 추출물의 항종양활성을 면역학적인 암 전이억제의 측면에서 조사하였으며, 종양백신 및 항원에 대한 adjuvant로의 응용 가능성을 모색였다. 또한, 한국산 겨우살이의 활성물질 중의 하나로 사료되는 lectin을 분리하여 그 생화학적 특징을 조사함과 동시에 면역증강 효과와 암전이 억제효과 등의 생리활성에 대해서도 검토하였다. 그리고 한국산 겨우살이 lectin 성분의 암세포에 대한 세포독성 효과가 apoptosis에 의한 것을 밝혔으며. lectin성분에 의한 이러한 생리0활성 효과를 세포생화학적 관점에서 조사하였다. 마지막으로 lectin에 대한 단일크론 항체를 생산하여 한국산 겨우살이 추출물에서 지표물질로 lectin의 정량을 위한 ELISA법 개발과, 단일크론 항체를 이용한immunoaffinity column의 제작 및 이를 이용한 lectin의 신속한 분리법을 확립하기 위한 연구를 수행하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. KM-110은 in vitro에서 여러가지 종양세포주에 대하여 수십 ㎍/ml 이하의 농도에서 ED_(50)값이 나타나는 세포독성 효과가 있었으나, in vivo에서는 100 ㎍을 정맥주사한 후에도 간과 신장의 기능에 영향을 미치지 않는 안전한 농도로 나타났다. 2. Hydrolyzed sephrose 4B column을 이용하여 KM-110으로부터 galactose 및 N-acethyl galalctosamin에 대한 당특이성을 가지는 lectin 성분인 KML-C를 분리하였다. KML-C는 전기영동분석 결과 비환원 상태에서는 60 Kda을 환원상태에서는 주로 29 Kda 및 33 Kda의 A- 및 B-chain으로 구성되는 heterodimer 형태였고, 히미한 26 Kda의 C-chain이 동시에 관찰되었다. 3. KML-C를 유럽산 겨우살이의 lectin 성분인 EML-1과 생화학적 특성을 비교 조사한 결과 당특이성, 분자량 및 amino acid sequence에서 차이가 있는 고유한 특성을 가진 lectin으로 밝혀졌다. 5. KML-C에 대한 단일크론 항체중에서 KML-C에 특이적으로 반응하는 9H7-D10 항체를 이용한 Immunoaffinity column을 만들어 KM-110으로부터 9H7-D10 항체와 반응하는 물질을 분리한 결과, KML- C의 C-chain이 제거된 순수한 KML-1가 분리되었다. 6. 생산된 단일크론항체의 특성을 조사한 결과, KML-1의 B-chain에 특이적으로 반응하며 KML-1의 세포독성 중화효과를 가지는 9H7-D10항체, KML-1의 A-chain과 EML-1의 A- 및 B-chain을 동시에 인식하나 EML-1만의 세포독성 중화효과를 가지는 8B11-2C5항체, 그리고 KML-1의 B-chain에 특이적으로 반응하나 세포독성 중화효과가 없는 3C2-H4항체등 크게 3종류의 특성을 가지는 것으로 나타났다. 7. KM-110 및 KML-1의 in vitro 에서 여러가지 종양세포주에 대한 세포살해 활성이 나타났으며 KML-1이 KM-110보다 높은 살해활성을 나타내어 KML-1은 KM-110의 활성물질인 것으로 밝혀졌고, 그들에 의한 세포살해 효과는 Ca^(+2)/Mg^(+2) 의존적인 endonuclase가 관여하는 전형적인 apoptosis인 것으로 밝혀졌다. 8. KM-110은 macrophage로부터 TNF-α, IL-1. IL-6 및 INF-γ등의 cytokines을 유도하고, 종양세포에 대한 살해능의 증진 및 NK-세포를 활성화시켜 종양세포에 대한 살해활성을 증진시켰고, KML-1도 유사한 활성을 나타내어 cytokine-inducer 혹은 BRM으로의 개발 가능성을 제시하였다. 그러나, KML-1은 INF의-γ 유도분비능은 나타나지 않음으로서 KM-110에서 KML-1외에 면역자극 효과를 나타내는 또다른 물질의 존재 가능성을 시사하였다. 9. KM-110 및 KML-1은 실험동물 종양전이모델에서 colon 26-M3.1 lung carcinoma, B16-BL6 melanoma 및 L5178Y-ML25 lymphoma세포주에 의한 폐, 간장 및 비장으로의 종양전이를 유효하게 억제하는 활성을 나타내었고, 종양의 자연전이 모델에서도 KM-110 은 마우스에 이식된 혈류성 종양세포주인 B16-BL6 melanoma의 원발병소 및 폐로의 종양전이를 유효하게 억제하였다. 또한, KM-110에 의하여 유도된 TNF-α는 혈관내피세포의 증식을 억제함으로서 종양의 증식 및 전이에 필수적 요소인 종양의존성 혈관신생을 유효하게 억제하였다. 이러한 in vivo에서 KM-110 및 KML-1에 의한 항종양 활성은 종양세포에 직접적인 종양세포 살해활정 및 macrophage, NK-세포의 활성화등 종양에 대한 숙주의 면역담당세포의 활성화에 의한 것으로 사료되었다. 10. KM-110 및 KML-1을 항원과 함께 마우스에 면역할 경우, 항원 단독에 비하여 항체역가를 100~1000배 이상 상승시키는 adjuvant 활성이 있었으며, 역가가 상승된 항체의 subisotype는 IgG1, IgG2a 및 IgG2b class 였다. 항원 KLH에 감작된 마우스의 비장세포를 in vitro 에서 항원으로 재자극한 결과, KM-110 및 KML-1이 동시에 투여된 마우스의 비장세포가 KLH단독 투여된 마우스의 비장세포에 비하여 비장세포의 분화가 증가되었고, 이때 비장세포는 항원특이적면역반응을 매개하는 IL-2및 IL-4등의 cytokine의 유도능이 증가하였다. 11. KM-110및 KM은 종양세포주에 대한 세포독성 T-세포(CTL)의 활성 및 지연성과민반응을 증진시키는 활성이 있어 체액성 면역뿐 아니라 세포성 면역능을 증가시키는 adjuvant 효과를 나타내었다. 12. KM-110 adjuvant를 X-선을 조사한 B16-BL6 melanoma백신과 함께 면역한 마우스의 비장세포는 In vitro에서 종양백신으로 재자극한 결과, 세포성 면역반응인 종양백신 특이적인 비장세포의 활성화가 유도 되었고, 동물실험모델에서 종양백신과 KM-110을 함께 면역한 결과 종양의 전이가 유의성있게 억제되었다. 따라서 KM-110은 종양세포 특이적인 면역반응을 유도하는 것으로 사료되었고, 여러가지 항원에 대한 adjuvant로서의 개발가능성을 시사하였다. 13. KM-110의 세포독성 효과는 9H7-D10 및 8B11-2C5항체 각각으로는 의해서는 부분적인, 동시 처리의 결과 완전한 중화 효과가 나타났으며, KML-C 경우도 유사한 결과를 나타났다. 또한, lmmunoaffinity chromatography를 이용하여 KM-110의 성분중에서 KML-1이 제거된 F-KM-110 분획은 KM-110과의 세포독성 효과 비교에서 약 2배정도 낮은 활성을 나타냈고, 이 활성은 8B11-2C5항체의 의하여 중화되었다. 그러나, KM-110 및 F-KM-110의 macrophagc유래 cytokine 유도능 조사 결과, 두물질은 모두 유효한 활성이 있었다. 이 결과는 KM-110내에 KML-1이외에 다른 활성물질의 존재를 암시하였고, 그 물질은 KML-C의 C-chain과 관련된 물질로 사료되었다. KM-110 및 KML-1에 의한 여러가지 생물학적 활성을 도식화 하면 다음과 같다.
본 연구는 한국에서 서식하는 참나무에서 기생하는 겨우살이 추출물을을 이용하여 면역증강 및 항종양 활성을 가지는 물질의 탐색하고 그것을 분리, 정제하여 특성을 규명하고자 다음과 같은 연구를 수행하였다 즉, 한국산 겨우살이 추출물의 항종양활성을 면역학적인 암 전이억제의 측면에서 조사하였으며, 종양백신 및 항원에 대한 adjuvant로의 응용 가능성을 모색였다. 또한, 한국산 겨우살이의 활성물질 중의 하나로 사료되는 lectin을 분리하여 그 생화학적 특징을 조사함과 동시에 면역증강 효과와 암전이 억제효과 등의 생리활성에 대해서도 검토하였다. 그리고 한국산 겨우살이 lectin 성분의 암세포에 대한 세포독성 효과가 apoptosis에 의한 것을 밝혔으며. lectin성분에 의한 이러한 생리0활성 효과를 세포생화학적 관점에서 조사하였다. 마지막으로 lectin에 대한 단일크론 항체를 생산하여 한국산 겨우살이 추출물에서 지표물질로 lectin의 정량을 위한 ELISA법 개발과, 단일크론 항체를 이용한immunoaffinity column의 제작 및 이를 이용한 lectin의 신속한 분리법을 확립하기 위한 연구를 수행하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. KM-110은 in vitro에서 여러가지 종양세포주에 대하여 수십 ㎍/ml 이하의 농도에서 ED_(50)값이 나타나는 세포독성 효과가 있었으나, in vivo에서는 100 ㎍을 정맥주사한 후에도 간과 신장의 기능에 영향을 미치지 않는 안전한 농도로 나타났다. 2. Hydrolyzed sephrose 4B column을 이용하여 KM-110으로부터 galactose 및 N-acethyl galalctosamin에 대한 당특이성을 가지는 lectin 성분인 KML-C를 분리하였다. KML-C는 전기영동분석 결과 비환원 상태에서는 60 Kda을 환원상태에서는 주로 29 Kda 및 33 Kda의 A- 및 B-chain으로 구성되는 heterodimer 형태였고, 히미한 26 Kda의 C-chain이 동시에 관찰되었다. 3. KML-C를 유럽산 겨우살이의 lectin 성분인 EML-1과 생화학적 특성을 비교 조사한 결과 당특이성, 분자량 및 amino acid sequence에서 차이가 있는 고유한 특성을 가진 lectin으로 밝혀졌다. 5. KML-C에 대한 단일크론 항체중에서 KML-C에 특이적으로 반응하는 9H7-D10 항체를 이용한 Immunoaffinity column을 만들어 KM-110으로부터 9H7-D10 항체와 반응하는 물질을 분리한 결과, KML- C의 C-chain이 제거된 순수한 KML-1가 분리되었다. 6. 생산된 단일크론항체의 특성을 조사한 결과, KML-1의 B-chain에 특이적으로 반응하며 KML-1의 세포독성 중화효과를 가지는 9H7-D10항체, KML-1의 A-chain과 EML-1의 A- 및 B-chain을 동시에 인식하나 EML-1만의 세포독성 중화효과를 가지는 8B11-2C5항체, 그리고 KML-1의 B-chain에 특이적으로 반응하나 세포독성 중화효과가 없는 3C2-H4항체등 크게 3종류의 특성을 가지는 것으로 나타났다. 7. KM-110 및 KML-1의 in vitro 에서 여러가지 종양세포주에 대한 세포살해 활성이 나타났으며 KML-1이 KM-110보다 높은 살해활성을 나타내어 KML-1은 KM-110의 활성물질인 것으로 밝혀졌고, 그들에 의한 세포살해 효과는 Ca^(+2)/Mg^(+2) 의존적인 endonuclase가 관여하는 전형적인 apoptosis인 것으로 밝혀졌다. 8. KM-110은 macrophage로부터 TNF-α, IL-1. IL-6 및 INF-γ등의 cytokines을 유도하고, 종양세포에 대한 살해능의 증진 및 NK-세포를 활성화시켜 종양세포에 대한 살해활성을 증진시켰고, KML-1도 유사한 활성을 나타내어 cytokine-inducer 혹은 BRM으로의 개발 가능성을 제시하였다. 그러나, KML-1은 INF의-γ 유도분비능은 나타나지 않음으로서 KM-110에서 KML-1외에 면역자극 효과를 나타내는 또다른 물질의 존재 가능성을 시사하였다. 9. KM-110 및 KML-1은 실험동물 종양전이모델에서 colon 26-M3.1 lung carcinoma, B16-BL6 melanoma 및 L5178Y-ML25 lymphoma 세포주에 의한 폐, 간장 및 비장으로의 종양전이를 유효하게 억제하는 활성을 나타내었고, 종양의 자연전이 모델에서도 KM-110 은 마우스에 이식된 혈류성 종양세포주인 B16-BL6 melanoma의 원발병소 및 폐로의 종양전이를 유효하게 억제하였다. 또한, KM-110에 의하여 유도된 TNF-α는 혈관내피세포의 증식을 억제함으로서 종양의 증식 및 전이에 필수적 요소인 종양의존성 혈관신생을 유효하게 억제하였다. 이러한 in vivo에서 KM-110 및 KML-1에 의한 항종양 활성은 종양세포에 직접적인 종양세포 살해활정 및 macrophage, NK-세포의 활성화등 종양에 대한 숙주의 면역담당세포의 활성화에 의한 것으로 사료되었다. 10. KM-110 및 KML-1을 항원과 함께 마우스에 면역할 경우, 항원 단독에 비하여 항체역가를 100~1000배 이상 상승시키는 adjuvant 활성이 있었으며, 역가가 상승된 항체의 subisotype는 IgG1, IgG2a 및 IgG2b class 였다. 항원 KLH에 감작된 마우스의 비장세포를 in vitro 에서 항원으로 재자극한 결과, KM-110 및 KML-1이 동시에 투여된 마우스의 비장세포가 KLH단독 투여된 마우스의 비장세포에 비하여 비장세포의 분화가 증가되었고, 이때 비장세포는 항원특이적 면역반응을 매개하는 IL-2및 IL-4등의 cytokine의 유도능이 증가하였다. 11. KM-110및 KM은 종양세포주에 대한 세포독성 T-세포(CTL)의 활성 및 지연성과민반응을 증진시키는 활성이 있어 체액성 면역뿐 아니라 세포성 면역능을 증가시키는 adjuvant 효과를 나타내었다. 12. KM-110 adjuvant를 X-선을 조사한 B16-BL6 melanoma백신과 함께 면역한 마우스의 비장세포는 In vitro에서 종양백신으로 재자극한 결과, 세포성 면역반응인 종양백신 특이적인 비장세포의 활성화가 유도 되었고, 동물실험모델에서 종양백신과 KM-110을 함께 면역한 결과 종양의 전이가 유의성있게 억제되었다. 따라서 KM-110은 종양세포 특이적인 면역반응을 유도하는 것으로 사료되었고, 여러가지 항원에 대한 adjuvant로서의 개발가능성을 시사하였다. 13. KM-110의 세포독성 효과는 9H7-D10 및 8B11-2C5항체 각각으로는 의해서는 부분적인, 동시 처리의 결과 완전한 중화 효과가 나타났으며, KML-C 경우도 유사한 결과를 나타났다. 또한, lmmunoaffinity chromatography를 이용하여 KM-110의 성분중에서 KML-1이 제거된 F-KM-110 분획은 KM-110과의 세포독성 효과 비교에서 약 2배정도 낮은 활성을 나타냈고, 이 활성은 8B11-2C5항체의 의하여 중화되었다. 그러나, KM-110 및 F-KM-110의 macrophagc유래 cytokine 유도능 조사 결과, 두물질은 모두 유효한 활성이 있었다. 이 결과는 KM-110내에 KML-1이외에 다른 활성물질의 존재를 암시하였고, 그 물질은 KML-C의 C-chain과 관련된 물질로 사료되었다. KM-110 및 KML-1에 의한 여러가지 생물학적 활성을 도식화 하면 다음과 같다.
Mistletoe (Viscum album) has been used widely for therapeutic purposes in Europe and as well in Korea. To investigate an immune modulatory activity and anti-cancer activity of Korean mistletoe (Viscum album coloratum), it was extracted with water (KM-110) and its main component was purified (KML-1) ...
Mistletoe (Viscum album) has been used widely for therapeutic purposes in Europe and as well in Korea. To investigate an immune modulatory activity and anti-cancer activity of Korean mistletoe (Viscum album coloratum), it was extracted with water (KM-110) and its main component was purified (KML-1) from the KM-110 and characterized. The results obtained were summarized as follow; 1. The cytotoxic effect of KM-110 on various tumor cell lines was investigated. The growth of tumor cell lines were markedly inhibited by KM-110 treatment: ED_(50) to colon26-M3.1, L5178Y-ML25 and B16-BL6 is 20, 35 and 40 ㎍/ml, respectiveluy. The mice, however, injected with KM-110 did not show any influence in vivo system. 2. For the purification of lectin from KM-110 and development of immunoassay system for the measurement of specific lectin, monoclonal antibody (mAb) was produced with KML-C. Various hybridoma producing mAb with different characteristics were obtained and produced mAbs were subjected to further characterization in terms of specificity, isotype and neutralizing activity of various preparation of Korean mistletoe such as KM-110, KML-C and KML-1: some mAb from 9H7-D10 hybridoma reacted specifically with only Korean mistletoe lectin (e.g., KML-1) while 8B11-2C5 mAb reacted both Korean and European mistletoe lectins. 3. An immuno-affinity column was prepare with 9H7-D10 mAb. Using this column, KML-1 which is composed of two subunits, A-chain and B-chain, was purified from KML-C isolated from KM-110 by hydrolyzed sepharose 4B-column. The molecular weight of KML-1 was about 60 KD in which A-chain was 29 KD and B-chain was 33 KD. The amino acid sequence of 30 residues from N-terminal of A-chain of KML-1 was determined and showed 80% homology with that of EML-1, -Ⅱ and -Ⅲ. 4. Two-sites sandwich ELISA was developed using 5E10-F1 mAb for coating and 9H7-D10 mAb for detection of HRP enzyme. The standard curve ranging from 39 ng/ml to 2000 ng/ml was obtained with 39 ng/ml of sensitivity. According to standard curve, the concentration of KML-1 was determined and was found to be 500 ng in 10 mg of KM-110. 5. The inhibitory effect of the KM-110 on tumor metastasis produced by highly metastatic murine tumor cells, B16-BL6 melanoma, colon 26-M3.1 carcinoma and L5178Y-ML25 lymphoma cells was examined using experimental and spontaneous metastasis models with syngeneic mice. In experimental metastasis of B16-BL6 and colon 26-M3.1 cells, the intravenous (i.v.) administration of KM-110 (100 ㎍/mouse) or KML-1 (50 ng/mouse) 1 day after tumor inoculation inhibited significantly lung metastasis of both tumor cells. The administration of KM-110 or KML-1 also exhibited therapeutic effect on liver and spleen metastasis of L5178Y-ML25 lymphoma cells. Administration of KM-110 or KML-1 augmented cytolytic activities of NK-cell and macrophage against tumor cells, and induced various cytokines such as TNF-α, IL-1, IL-6, IFN-γ, The analysis of the signals related to activation of KML-1-treated macrophages rovealed that KML-1 induced thyrosine-dependent phosphorylation of 65, 80, 95 and 120 kDa proteins of macrophages in the early period of KML-1 treatment. In in vivo analysis for tumor-induced angiogenesis, KM-110 could also suppress tumor growth and inhibited the number of blood vessels oriented toward tumor mass. These results suggest that KM-110 and KML-1 had anti-tumor activity to inhibit tumor metastasis through activation of immune response. 6. Immunoadjuvant activity of the KM-110 or KML-1 was also investigated. Administration of antigen, keyhole limpet hemocyanim (KLH) with KM-110 or KML-1 showed higher titer of antibody than those of the group injected with antigen alone by more than 1000 times. In a tumor vaccine model using X-ray irradiated B16-BL6 tumor cells, the mice immunized with tumor vaccine with KM-110 exhibited a significant inhibition of lung metastasis produced by B16-BL6 melanoma cells. This results that KM-110 and KML-1 have an adjuvant activity to enhance non-specific resistance against tumor cells and to augment specific immunity such as activating B cells and T cells. 7. In order to investigate the other components rather than the lectin portion (KML-1) in Korean mistletoe extract (KM-110), KML-1-free KM-110 fraction (F-KM-110) was prepared using immune-affinity chromatography from KM-110. It showed the cytotoxicity to tumor cells but this activity was not neutralized by 9H7-D10 mAb, and partially by 8B11-2C5 mAb. While the activity of KML-C was partially neutralized both mAbs, but was completely neutralized by the mixture of two mAbs. These results may indicate that KM-110 contains other components including C-chain in addition to KML-1, which has an cytotoxic activity to tumor cells as well as various immunological activities such as induction of cytokines, etc.
Mistletoe (Viscum album) has been used widely for therapeutic purposes in Europe and as well in Korea. To investigate an immune modulatory activity and anti-cancer activity of Korean mistletoe (Viscum album coloratum), it was extracted with water (KM-110) and its main component was purified (KML-1) from the KM-110 and characterized. The results obtained were summarized as follow; 1. The cytotoxic effect of KM-110 on various tumor cell lines was investigated. The growth of tumor cell lines were markedly inhibited by KM-110 treatment: ED_(50) to colon26-M3.1, L5178Y-ML25 and B16-BL6 is 20, 35 and 40 ㎍/ml, respectiveluy. The mice, however, injected with KM-110 did not show any influence in vivo system. 2. For the purification of lectin from KM-110 and development of immunoassay system for the measurement of specific lectin, monoclonal antibody (mAb) was produced with KML-C. Various hybridoma producing mAb with different characteristics were obtained and produced mAbs were subjected to further characterization in terms of specificity, isotype and neutralizing activity of various preparation of Korean mistletoe such as KM-110, KML-C and KML-1: some mAb from 9H7-D10 hybridoma reacted specifically with only Korean mistletoe lectin (e.g., KML-1) while 8B11-2C5 mAb reacted both Korean and European mistletoe lectins. 3. An immuno-affinity column was prepare with 9H7-D10 mAb. Using this column, KML-1 which is composed of two subunits, A-chain and B-chain, was purified from KML-C isolated from KM-110 by hydrolyzed sepharose 4B-column. The molecular weight of KML-1 was about 60 KD in which A-chain was 29 KD and B-chain was 33 KD. The amino acid sequence of 30 residues from N-terminal of A-chain of KML-1 was determined and showed 80% homology with that of EML-1, -Ⅱ and -Ⅲ. 4. Two-sites sandwich ELISA was developed using 5E10-F1 mAb for coating and 9H7-D10 mAb for detection of HRP enzyme. The standard curve ranging from 39 ng/ml to 2000 ng/ml was obtained with 39 ng/ml of sensitivity. According to standard curve, the concentration of KML-1 was determined and was found to be 500 ng in 10 mg of KM-110. 5. The inhibitory effect of the KM-110 on tumor metastasis produced by highly metastatic murine tumor cells, B16-BL6 melanoma, colon 26-M3.1 carcinoma and L5178Y-ML25 lymphoma cells was examined using experimental and spontaneous metastasis models with syngeneic mice. In experimental metastasis of B16-BL6 and colon 26-M3.1 cells, the intravenous (i.v.) administration of KM-110 (100 ㎍/mouse) or KML-1 (50 ng/mouse) 1 day after tumor inoculation inhibited significantly lung metastasis of both tumor cells. The administration of KM-110 or KML-1 also exhibited therapeutic effect on liver and spleen metastasis of L5178Y-ML25 lymphoma cells. Administration of KM-110 or KML-1 augmented cytolytic activities of NK-cell and macrophage against tumor cells, and induced various cytokines such as TNF-α, IL-1, IL-6, IFN-γ, The analysis of the signals related to activation of KML-1-treated macrophages rovealed that KML-1 induced thyrosine-dependent phosphorylation of 65, 80, 95 and 120 kDa proteins of macrophages in the early period of KML-1 treatment. In in vivo analysis for tumor-induced angiogenesis, KM-110 could also suppress tumor growth and inhibited the number of blood vessels oriented toward tumor mass. These results suggest that KM-110 and KML-1 had anti-tumor activity to inhibit tumor metastasis through activation of immune response. 6. Immunoadjuvant activity of the KM-110 or KML-1 was also investigated. Administration of antigen, keyhole limpet hemocyanim (KLH) with KM-110 or KML-1 showed higher titer of antibody than those of the group injected with antigen alone by more than 1000 times. In a tumor vaccine model using X-ray irradiated B16-BL6 tumor cells, the mice immunized with tumor vaccine with KM-110 exhibited a significant inhibition of lung metastasis produced by B16-BL6 melanoma cells. This results that KM-110 and KML-1 have an adjuvant activity to enhance non-specific resistance against tumor cells and to augment specific immunity such as activating B cells and T cells. 7. In order to investigate the other components rather than the lectin portion (KML-1) in Korean mistletoe extract (KM-110), KML-1-free KM-110 fraction (F-KM-110) was prepared using immune-affinity chromatography from KM-110. It showed the cytotoxicity to tumor cells but this activity was not neutralized by 9H7-D10 mAb, and partially by 8B11-2C5 mAb. While the activity of KML-C was partially neutralized both mAbs, but was completely neutralized by the mixture of two mAbs. These results may indicate that KM-110 contains other components including C-chain in addition to KML-1, which has an cytotoxic activity to tumor cells as well as various immunological activities such as induction of cytokines, etc.
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