유전자재조합 단백질 생산을 위해 주로 쓰이고 있는 host로는 E. coli와 S. cerevisiae 등의 yeast 그리고 동물세포인 CHO cell 들이 있으며 이들 중 yeast는 E. coli와 비교하여 몇가지 장점을 가지고 있다. 첫째로는 yeast의 세포내 환경이 생성된 단백질의 정확하게 folding하는 체계 및 subunit 조립체계가 발달되어 있다. 둘째로는 yeast는 단백질의 활성이나 안정성등에 매우 중요한 glycosylation을 행할수 있으며 셋째로는 yeast는 E. coli와 달리 유전적으로 고등생물과 동일한 진핵세포로서 고등 생물 유래의 유전자와 전사 및 번역 시스템이 유사하고, splicing을 통한 intron의 제거가 가능하며 고등 동물의 Golgi체와 유사한 분비기관을 갖추고 있어서 번역후 수식(post-translational modification)을 통해 활성화된 단백질을 생산시킬 수 있다. 또한 단백질을 생산할 때에는 의약용 단백질의 경우에 꼭 제거되어야만 하는 Endotoxin 등이 E. coli와는 다르게 문제가 되지 않는 장점을 가지고 있다. 이러한 yeast중에 대표적으로 사용하고있는 S.cerevisiae는 재조합 인간 단백질을 생산하는 경우의 최대의 장점은 S. cerevisiae 자체가 인간에게 매우 안전하다는 점이며 제과, 제빵 및 포도주 등을 비롯한 ...
유전자재조합 단백질 생산을 위해 주로 쓰이고 있는 host로는 E. coli와 S. cerevisiae 등의 yeast 그리고 동물세포인 CHO cell 들이 있으며 이들 중 yeast는 E. coli와 비교하여 몇가지 장점을 가지고 있다. 첫째로는 yeast의 세포내 환경이 생성된 단백질의 정확하게 folding하는 체계 및 subunit 조립체계가 발달되어 있다. 둘째로는 yeast는 단백질의 활성이나 안정성등에 매우 중요한 glycosylation을 행할수 있으며 셋째로는 yeast는 E. coli와 달리 유전적으로 고등생물과 동일한 진핵세포로서 고등 생물 유래의 유전자와 전사 및 번역 시스템이 유사하고, splicing을 통한 intron의 제거가 가능하며 고등 동물의 Golgi체와 유사한 분비기관을 갖추고 있어서 번역후 수식(post-translational modification)을 통해 활성화된 단백질을 생산시킬 수 있다. 또한 단백질을 생산할 때에는 의약용 단백질의 경우에 꼭 제거되어야만 하는 Endotoxin 등이 E. coli와는 다르게 문제가 되지 않는 장점을 가지고 있다. 이러한 yeast중에 대표적으로 사용하고있는 S.cerevisiae는 재조합 인간 단백질을 생산하는 경우의 최대의 장점은 S. cerevisiae 자체가 인간에게 매우 안전하다는 점이며 제과, 제빵 및 포도주 등을 비롯한 알코올 음료의 생산에 수천년 동안 사용되어 왔으며, 대장균 등에서 생산된 재조합 단백질에 불순물로 존재할 가능성이 있는 파이로젠 (pyrogen)등의 존재 가능성이 매우 낮다. 특히 철분을 보충하기 위한 음식물의 일부로 재조합 훼리틴을 섭취할 경우에 S. cerevisiae 생산된 형태는 안정성이 탁월하다. 본 연구에서는 산업적으로 중요한 훼리틴을 재조합으로 생산하기 위한 Sacchromyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris 및 Escherichia coli에서의 발현 vector 개발 및 유전자 재조합 단백질 최적발현조건을 비교하였고 Sacchromyces cerevisiae에서의 고농도 배양을 통해 훼리틴 발현의 최적화 방법을 행하였으며 scale-up을 통해 상업화에 가능성을 보여주고자 하였다. Sacchromyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris 및 Escherichia coli를 이용하여 재조합 단백질 발현 최적조건을 비교 하였는데 Sacchromyces cerevisiae 경우 플라스크 배양을 통한 훼리틴 발현량은 H-chain과 L-chain 모두 약 300mg/L 수준으로 확인 되었으며, 강력한 Methylotrophic Yeast로 알려진 Hansenula polymorpha A16과 Pichia pastoris H-chain과 L-chain 모두 약 200mg/L 수준으로 확인 되었다. Escherichia coli는 H-chain과 L-chain 모두 약 400mg/L 이상으로 높은 발현량을 보였다. Escherichia coli에서의 철(Fe2+, Fe3+, Fe2+.3+)함량이 발현에 미치는 영향에 있어서는 배지중의 철이 ferritin의 발현량을 증가시키는 것을 확인 하였으며 특히 H-chain의 경우 2가의 철이, L-chain의 경우 3가의 철이 발현량을 증가시키는 것을 확인 하였다. 재조합된 S.cerevisiae에서 발현 효율 극대화 실험에서는 Kozak sequence 조절에 의한 발현 최적화의 경우 Kozak sequence 조절에 따라서 ferritin 발현양이 50%이상 증가 됨을 확인 하였으며 O.D.15 정도에서 약 300mg/L 이상의 ferritin을 발현할 수 있었다. Leucine, Arginine의 codon usage 변경에 의한 발현량 최적화 ferritin L chain codon usage 변경으로 expression level을 높이고자 하였는데, Codon usage 변경에 의하여 발현양이 50%이상 증가됨을 확인하였으며 O.D.15 정도에서 약 400mg/L 이상의 ferritin을 발현 할수 있었다. Sacchromyces cerevisiae를 이용한 Preliminary 발효 공정 수립 및 fed-batch 방법에 따른 훼리틴 발현공정 최적화 및 고농도 배양기술을 통한 발현 효율 극대화 실험에서는 S. cerevisiae에서 철(Fe2+, Fe3+)함량이 발현에 미치는 영향 확인하였는데 배양중 배지중의 Fe2+, Fe3+철이 ferritin 발현을 증대시킴을 파악 하고 이를 이용하여 최대의 발현을 위한 배지 조성을 결정하기 위한 실험을 하였는데 아래의 gel 결과를 통하여 철을 첨가하지 않은 경우에 비해 Fe2+ 경우 철의 양이 0.5g/L에서 1g/L 그리고 2g/L까지 증가함에 따라 ferritin 발현량이 100%정도 증가함을 알수 있으며 Fe3+ 경우는 1∼2g/L가 100% 이상정도 발현 증가를 보였다. 이 경우 ferritin 발현양이 O.D. 15에서 약 400mg/L를 생성함을 확인 하였다. Codon usage 변경된 (GAL promoter) ferritin대상으로 fed-batch를 이용한 고농도 발효 실험에서는 2 stage 고농도 세포배양 방법으로 growth stage에서는 C/N ratio가 3/1인 feeding sol'n을 feeding program을 이용하여 Specific growth rate(μ) 를 0.1 hr-1로 유지하면서 O.D 90까지 성장 한 후 expression stage인 glucose, YE, galactose가 함유된 feeding sol'n으로 shift하여 Specific growth rate(μ)를 0.07 hr-1로 유지 최종 O.D.(660nm) 120까지 fed-batch를 하였으며 약 2.5g/L의 ferritin을 얻을 수 있었다. (GAP promoter) Ferritin fed-batch 발효에서는 Specific growth rate(μ)를 0.1hr-1로 유지 O.D. (660nm) 105까지 fed-batch를 진행하였으며 약 2g/L의 ferritin 을 얻을 수 있었다. 정제공정 수율향상을 위한 합성배지 개발은 배지원가 및 색소의 주원인이 되는 YE의 양을 줄이고 batch 배지 조성과 feeding sol'n의 조성을 변화시켜 ferritin 발현양을 증가시키고 minimal 배지를 사용하였을 경우 S.cerevisiae의 경우 complex를 사용한 경우의 약 80%정도까지 ferritin 발현이 이루어짐을 확인 하였다. 5L 규모에서 확립된 최적 fed-batch 발효 공정을 50L 규모로 scale-up 하여 규모확대에 따른 공정시간의 연장에 의해 생길 수 있는 부작용을 파악하고 이들의 해소책을 강구하며 또한 이 스케일업 실험을 통해 공정 재현성을 확인 하였는데, fed-batch culture는 균주의 성장과 ferritin 발현이 2단계로 이루어져 growth한 후 galactose(C-source)로 shift하여 fed-batch 진행하게 되므로 초기 투입된 C-source/N-source가 고갈되는 시점℃을 DO level로 확인하여 비성장 속도를 0.9∼1.0hr-1, 기질수율을 0.8으로 유지하면서 fed-batch를 진행하였다. C/N ratio가 3/1인 feeding sol'n을 feeding program을 이용하여 Specific growth rate(μ) 를 0.1 hr-1로 유지하면서 O.D 110까지 fed-batch를 진행하였으며 약 1.8g/L의 ferritin 을 얻을 수 있었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 S.cerevisiae를 이용한 훼리틴 재조합 단백질 생산 최적화에 관하여 모색 되어졌으며 이를 바탕으로 산업체에서 yeast를 이용한 상업화를 계획함에 있어서 host로서 균주를 선택할 수 있는 기본 자료를 제공함과 아울러 균주가 선택된 후에 그 균주를 이용한 재조합 단백질 최적화 방법을 제시하여 줄것으로 생각된다.
유전자재조합 단백질 생산을 위해 주로 쓰이고 있는 host로는 E. coli와 S. cerevisiae 등의 yeast 그리고 동물세포인 CHO cell 들이 있으며 이들 중 yeast는 E. coli와 비교하여 몇가지 장점을 가지고 있다. 첫째로는 yeast의 세포내 환경이 생성된 단백질의 정확하게 folding하는 체계 및 subunit 조립체계가 발달되어 있다. 둘째로는 yeast는 단백질의 활성이나 안정성등에 매우 중요한 glycosylation을 행할수 있으며 셋째로는 yeast는 E. coli와 달리 유전적으로 고등생물과 동일한 진핵세포로서 고등 생물 유래의 유전자와 전사 및 번역 시스템이 유사하고, splicing을 통한 intron의 제거가 가능하며 고등 동물의 Golgi체와 유사한 분비기관을 갖추고 있어서 번역후 수식(post-translational modification)을 통해 활성화된 단백질을 생산시킬 수 있다. 또한 단백질을 생산할 때에는 의약용 단백질의 경우에 꼭 제거되어야만 하는 Endotoxin 등이 E. coli와는 다르게 문제가 되지 않는 장점을 가지고 있다. 이러한 yeast중에 대표적으로 사용하고있는 S.cerevisiae는 재조합 인간 단백질을 생산하는 경우의 최대의 장점은 S. cerevisiae 자체가 인간에게 매우 안전하다는 점이며 제과, 제빵 및 포도주 등을 비롯한 알코올 음료의 생산에 수천년 동안 사용되어 왔으며, 대장균 등에서 생산된 재조합 단백질에 불순물로 존재할 가능성이 있는 파이로젠 (pyrogen)등의 존재 가능성이 매우 낮다. 특히 철분을 보충하기 위한 음식물의 일부로 재조합 훼리틴을 섭취할 경우에 S. cerevisiae 생산된 형태는 안정성이 탁월하다. 본 연구에서는 산업적으로 중요한 훼리틴을 재조합으로 생산하기 위한 Sacchromyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris 및 Escherichia coli에서의 발현 vector 개발 및 유전자 재조합 단백질 최적발현조건을 비교하였고 Sacchromyces cerevisiae에서의 고농도 배양을 통해 훼리틴 발현의 최적화 방법을 행하였으며 scale-up을 통해 상업화에 가능성을 보여주고자 하였다. Sacchromyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris 및 Escherichia coli를 이용하여 재조합 단백질 발현 최적조건을 비교 하였는데 Sacchromyces cerevisiae 경우 플라스크 배양을 통한 훼리틴 발현량은 H-chain과 L-chain 모두 약 300mg/L 수준으로 확인 되었으며, 강력한 Methylotrophic Yeast로 알려진 Hansenula polymorpha A16과 Pichia pastoris H-chain과 L-chain 모두 약 200mg/L 수준으로 확인 되었다. Escherichia coli는 H-chain과 L-chain 모두 약 400mg/L 이상으로 높은 발현량을 보였다. Escherichia coli에서의 철(Fe2+, Fe3+, Fe2+.3+)함량이 발현에 미치는 영향에 있어서는 배지중의 철이 ferritin의 발현량을 증가시키는 것을 확인 하였으며 특히 H-chain의 경우 2가의 철이, L-chain의 경우 3가의 철이 발현량을 증가시키는 것을 확인 하였다. 재조합된 S.cerevisiae에서 발현 효율 극대화 실험에서는 Kozak sequence 조절에 의한 발현 최적화의 경우 Kozak sequence 조절에 따라서 ferritin 발현양이 50%이상 증가 됨을 확인 하였으며 O.D.15 정도에서 약 300mg/L 이상의 ferritin을 발현할 수 있었다. Leucine, Arginine의 codon usage 변경에 의한 발현량 최적화 ferritin L chain codon usage 변경으로 expression level을 높이고자 하였는데, Codon usage 변경에 의하여 발현양이 50%이상 증가됨을 확인하였으며 O.D.15 정도에서 약 400mg/L 이상의 ferritin을 발현 할수 있었다. Sacchromyces cerevisiae를 이용한 Preliminary 발효 공정 수립 및 fed-batch 방법에 따른 훼리틴 발현공정 최적화 및 고농도 배양기술을 통한 발현 효율 극대화 실험에서는 S. cerevisiae에서 철(Fe2+, Fe3+)함량이 발현에 미치는 영향 확인하였는데 배양중 배지중의 Fe2+, Fe3+철이 ferritin 발현을 증대시킴을 파악 하고 이를 이용하여 최대의 발현을 위한 배지 조성을 결정하기 위한 실험을 하였는데 아래의 gel 결과를 통하여 철을 첨가하지 않은 경우에 비해 Fe2+ 경우 철의 양이 0.5g/L에서 1g/L 그리고 2g/L까지 증가함에 따라 ferritin 발현량이 100%정도 증가함을 알수 있으며 Fe3+ 경우는 1∼2g/L가 100% 이상정도 발현 증가를 보였다. 이 경우 ferritin 발현양이 O.D. 15에서 약 400mg/L를 생성함을 확인 하였다. Codon usage 변경된 (GAL promoter) ferritin대상으로 fed-batch를 이용한 고농도 발효 실험에서는 2 stage 고농도 세포배양 방법으로 growth stage에서는 C/N ratio가 3/1인 feeding sol'n을 feeding program을 이용하여 Specific growth rate(μ) 를 0.1 hr-1로 유지하면서 O.D 90까지 성장 한 후 expression stage인 glucose, YE, galactose가 함유된 feeding sol'n으로 shift하여 Specific growth rate(μ)를 0.07 hr-1로 유지 최종 O.D.(660nm) 120까지 fed-batch를 하였으며 약 2.5g/L의 ferritin을 얻을 수 있었다. (GAP promoter) Ferritin fed-batch 발효에서는 Specific growth rate(μ)를 0.1hr-1로 유지 O.D. (660nm) 105까지 fed-batch를 진행하였으며 약 2g/L의 ferritin 을 얻을 수 있었다. 정제공정 수율향상을 위한 합성배지 개발은 배지원가 및 색소의 주원인이 되는 YE의 양을 줄이고 batch 배지 조성과 feeding sol'n의 조성을 변화시켜 ferritin 발현양을 증가시키고 minimal 배지를 사용하였을 경우 S.cerevisiae의 경우 complex를 사용한 경우의 약 80%정도까지 ferritin 발현이 이루어짐을 확인 하였다. 5L 규모에서 확립된 최적 fed-batch 발효 공정을 50L 규모로 scale-up 하여 규모확대에 따른 공정시간의 연장에 의해 생길 수 있는 부작용을 파악하고 이들의 해소책을 강구하며 또한 이 스케일업 실험을 통해 공정 재현성을 확인 하였는데, fed-batch culture는 균주의 성장과 ferritin 발현이 2단계로 이루어져 growth한 후 galactose(C-source)로 shift하여 fed-batch 진행하게 되므로 초기 투입된 C-source/N-source가 고갈되는 시점℃을 DO level로 확인하여 비성장 속도를 0.9∼1.0hr-1, 기질수율을 0.8으로 유지하면서 fed-batch를 진행하였다. C/N ratio가 3/1인 feeding sol'n을 feeding program을 이용하여 Specific growth rate(μ) 를 0.1 hr-1로 유지하면서 O.D 110까지 fed-batch를 진행하였으며 약 1.8g/L의 ferritin 을 얻을 수 있었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 S.cerevisiae를 이용한 훼리틴 재조합 단백질 생산 최적화에 관하여 모색 되어졌으며 이를 바탕으로 산업체에서 yeast를 이용한 상업화를 계획함에 있어서 host로서 균주를 선택할 수 있는 기본 자료를 제공함과 아울러 균주가 선택된 후에 그 균주를 이용한 재조합 단백질 최적화 방법을 제시하여 줄것으로 생각된다.
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