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문제 정의
- 철분을 필요로 하는 세포가 훼리틴으로 부터 철분을 공급받고, 철분 결핍은 철분의 부적합한 섭취보다는 식이 철분의 생체 이용률에 의존하기 때문에 본 연구에서는 hjH 효모 가급 원이 다른 철분들과 비교하여 생체 이용률에 유용한지 알아보기 위하여 흰쥐를 사육하여 체중 증가, 사료효율, 헤모글로빈 농도, 헤마토크릿, 간과 비장의 철분농도를 비교 검토하였다.
제안 방법
- YEp352에 GAL 1 promotor, GPD pro motor 및 GAL7 terminator가 삽입되어진 YEp352-GAL, YEp 352-GPD 및 pGAL7-TER2를 전북대학교 양문식 박사로부터제공받았다. 세포배양은 Seo 등(Seo et al 2002, Seo et al 2003)의 방법에 따라 Control인 효모 숙주세포와 재조합 효소의 배양을 위한 일반배지로 영양배지인 1% 효모추출물, 유도제로 2% 과당이 함유된 2% 펩톤을 사용하여 30°C, 200 rpm으로 교반하면서 3일간 배양하였다. 5, 000 g, 10분(4 °C)에서 원심분리하여 회수하였고 세포들은 20 mM 3-(N mor pholino) propane sulfonic acid buffer(pH6.
- 7군으로 나누었다. Control 군은 정상사료로 AIN-76 사료 (Dyets Co, USA, 48 mg Fe/kg diet)를, 철분 결핍군으로는 AIN 철분 결핍사료(Dyets Co, USA, 2 mg Fe/kg diet, AIN-Fe deficient)로 28일간 먹였다. 철분 결핍으로부터 회복 효과를 비교하기 위하여 AIN-Fe deficient 사료를 14일간 먹인 후, YGH2를 비롯한 다른 급원 철분사료를 14일간 공급하면서 실험하였다.
- Control 군은 정상사료로 AIN-76 사료 (Dyets Co, USA, 48 mg Fe/kg diet)를, 철분 결핍군으로는 AIN 철분 결핍사료(Dyets Co, USA, 2 mg Fe/kg diet, AIN-Fe deficient)로 28일간 먹였다. 철분 결핍으로부터 회복 효과를 비교하기 위하여 AIN-Fe deficient 사료를 14일간 먹인 후, YGH2를 비롯한 다른 급원 철분사료를 14일간 공급하면서 실험하였다. 사료효율(Feed Efficiency)은 28일간의 흰쥐 사육 기간 동안 섭취한 총 사료무게에 대하여 증가된 체중을 백분율로 계산하였다.
- 철분 결핍으로부터 회복 효과를 비교하기 위하여 AIN-Fe deficient 사료를 14일간 먹인 후, YGH2를 비롯한 다른 급원 철분사료를 14일간 공급하면서 실험하였다. 사료효율(Feed Efficiency)은 28일간의 흰쥐 사육 기간 동안 섭취한 총 사료무게에 대하여 증가된 체중을 백분율로 계산하였다. 실험에서 분류된 실험된 군은 7개로 다음과 같다.
- 28일 동안 실험동물의 체중은 매주 측정하였고 실험 14일, 21일후에 꼬리에서(0.5 mL), 28일후에는 심장에서 채혈하였다. 해파린 처리된 시험관에 모아 헤마토크릿(Ht)는 마이크로 원심 분리 법 으로, 헤 모글로빈(Hb) 농도는 Spotchem Kit(Ar- kay Inc, Japan)를 사용하여 측정하였으며 28후에 희생시켜간, 비장의 철분 함량을 microwave sample preperation system (CEM, USA)에 의하여 70% 질산(7 mL), 30% 염산(3 mL)으로 분해시켜 원자흡광광도법 (Atomic absorption spectrometer, AAS, Spectr AA-880, Varian, USA)으로 측정하였다.
- 훼리틴내에 저장된 철분, 재조합 효모의 철분, 무기 철 복합체의 생체 유용성 차이를 알아보았다. 서 등(Seo et al 2003) 의 실험에서 hJH 효모는 14.
대상 데이터
- 사람 훼리틴 H-사슬 유전자("의 이형접합형 발현을 위해서는 숙주세포로 효모(Saccammyces. cerevisiae) 2805(A£47h pep4:HIS3 prbl-d canl GAL2 his3 ura3-52, YGT)를 사용하였다.
- 1 유mol/g (wet cell weight) 이었다. 유전자재조합 플라스미드는 효모 셔틀 벡터인 YEp 352를 사용하였다. YEp352에 GAL 1 promotor, GPD pro motor 및 GAL7 terminator가 삽입되어진 YEp352-GAL, YEp 352-GPD 및 pGAL7-TER2를 전북대학교 양문식 박사로부터제공받았다.
- 유전자재조합 플라스미드는 효모 셔틀 벡터인 YEp 352를 사용하였다. YEp352에 GAL 1 promotor, GPD pro motor 및 GAL7 terminator가 삽입되어진 YEp352-GAL, YEp 352-GPD 및 pGAL7-TER2를 전북대학교 양문식 박사로부터제공받았다. 세포배양은 Seo 등(Seo et al 2002, Seo et al 2003)의 방법에 따라 Control인 효모 숙주세포와 재조합 효소의 배양을 위한 일반배지로 영양배지인 1% 효모추출물, 유도제로 2% 과당이 함유된 2% 펩톤을 사용하여 30°C, 200 rpm으로 교반하면서 3일간 배양하였다.
- 71 /miol/ g(wet cell weight in YGH2)임을 확인하였었다(Seo et al 2003). 철분 공급은 용액상에서 +2가 상태로 더 오래 지속되기 때문에 황산철 (ferrous sulfate) 대신 황산암모늄철 (ferrous ammonium sulfote)을 사용하였고 YGT cell은 1% 효모추출물, 유도제로 2% 과당이 함유된 2% 펩톤에서 배양하였고, 증류수로 2회 세척하여 5, 000 g, 10분(4”C)간 원심분리하여 YGT 세포와 YGH2 세포 pellet 150 g(wet weight)을 회수하여 본 실험에 사용하였다.
- 생후 3주된 SD계 흰쥐 수컷을 중앙실험동물(Seoul, Korea) 에서 구입하여 1주일간 고형 배합사료로 적응시킨 뒤 8마리씩 7군으로 나누었다. Control 군은 정상사료로 AIN-76 사료 (Dyets Co, USA, 48 mg Fe/kg diet)를, 철분 결핍군으로는 AIN 철분 결핍사료(Dyets Co, USA, 2 mg Fe/kg diet, AIN-Fe deficient)로 28일간 먹였다.
데이터처리
- SPSS 프로그램을 사용하여 실험군과의 차이는 One way ANOVA(p<0.05)를, 사료군의 유의적 차이는 post hot-Tukey's test를 사용하였다.
이론/모형
- 5 mL), 28일후에는 심장에서 채혈하였다. 해파린 처리된 시험관에 모아 헤마토크릿(Ht)는 마이크로 원심 분리 법 으로, 헤 모글로빈(Hb) 농도는 Spotchem Kit(Ar- kay Inc, Japan)를 사용하여 측정하였으며 28후에 희생시켜간, 비장의 철분 함량을 microwave sample preperation system (CEM, USA)에 의하여 70% 질산(7 mL), 30% 염산(3 mL)으로 분해시켜 원자흡광광도법 (Atomic absorption spectrometer, AAS, Spectr AA-880, Varian, USA)으로 측정하였다.
성능/효과
- 오차가 크기 때문이라 여겨진다. 체중 증가량은 실험군간의 차이를 보여 HSF군이 가장 컸고 AIN-Fe deficient군, FAF (30)군, FAF(50)군, YGT군은 적었는데 AIN-Fe defi cient^, FAF(30)군, FAF(50)군은 사료효율도 유의적으로 낮아 사료효율과 체중 증가 간에 연관을 볼 수 있었다. HSF와 YGH2은 control과 체중 증가, 사료효율이 유사하였다.
- 잘 흡수되었음을 가리킨다. 또한 본 실험의 결과는 흰쥐 간의 철분 회복에서 FAS(30)이 HSF(35 mg Fe/Kg diet)와 YGH2(35 mg Fe/Kg diet) 사료보다 좋지 않아 HSF와 YGH 2에 의한 철분 공급이 조직의 철분을 재충전하는데 무기 철분인 FAS보다 효율적 임을 가리키며 hfti 효모 공급이 철분 결핍을 회복시키 는데 도움이 됨을 확인하였다. hfH 효모의 철분 결핍성 빈혈 개선에 대한 다른 연구가 아직 이루어지지 않아 본 실험의 결과를 선행 연구들과 비교하지 못하였지 만 영 양보충제로 사용되는 황산암모늄철과 비교함으로써 hfH 효모의 빈혈 개선 효과를 객관적으로 검토할 수 있었다.
- 또한 본 실험의 결과는 흰쥐 간의 철분 회복에서 FAS(30)이 HSF(35 mg Fe/Kg diet)와 YGH2(35 mg Fe/Kg diet) 사료보다 좋지 않아 HSF와 YGH 2에 의한 철분 공급이 조직의 철분을 재충전하는데 무기 철분인 FAS보다 효율적 임을 가리키며 hfti 효모 공급이 철분 결핍을 회복시키 는데 도움이 됨을 확인하였다. hfH 효모의 철분 결핍성 빈혈 개선에 대한 다른 연구가 아직 이루어지지 않아 본 실험의 결과를 선행 연구들과 비교하지 못하였지 만 영 양보충제로 사용되는 황산암모늄철과 비교함으로써 hfH 효모의 빈혈 개선 효과를 객관적으로 검토할 수 있었다. 본 실험은 hfH 효모의 빈혈 개선 기능에 대한 초기단계연구로 혈장 헤모글로빈 농도, 헤마토크릿, 간과 비장의 철분농도를 측정하여 이 4가지 지표만으로 빈혈 개선 효과를 판정하기에는 무리가 있다고 볼 수 있으므로 총 철분 결합능력 (total iron binding capasity, TIBC), 트랜스훼린 포화도 (transferrin saturation, TS), 분변의 철분 농도 등 다른 지표 물질에 대한 검토가 이루어져야 하겠다.
- 본 실험은 hfH 효모의 빈혈 개선 기능에 대한 초기단계연구로 혈장 헤모글로빈 농도, 헤마토크릿, 간과 비장의 철분농도를 측정하여 이 4가지 지표만으로 빈혈 개선 효과를 판정하기에는 무리가 있다고 볼 수 있으므로 총 철분 결합능력 (total iron binding capasity, TIBC), 트랜스훼린 포화도 (transferrin saturation, TS), 분변의 철분 농도 등 다른 지표 물질에 대한 검토가 이루어져야 하겠다. 세포내 철분흡수기 전은 아직 완전히 연구되지 않았으며 효모에서 낮은 비율로 발현 생성된 훼리틴이 비교적 많은 양의 유동성 철분을 저장하고 있어 종합적으로 hfH 효모의 생체이용성이 높아 철분 공급원으로 우수하다고 할 수 있다. 厂 .
후속연구
- 그러므로 사람 훼리틴을 효모내에서 발현시킴으로써 철분 함량이 증진된 효모를 개발하여 이를 철분 결핍성 빈혈 등에 활용할 수 있을 것으로 보여진다. 다른 연구에서(Shin et al 2001, Seo et al 2003) 효모에 사람 훼리틴 H-사슬과 L-사슬 유전자를 발현시킴으로써 철분이 증강된 훼리틴 생산 재조합 효모(human ferritin H-chain recombinant yeast, hfH 효모) 생산에 성공한 바 있는데 발현된 재조합 H-사슬 훼리틴은 in w'w에서 ferroxidase 활성이 있어 L-훼리틴보다 철분흡수율 (iron uptake)이 빠르고, L-훼리틴은 H-사슬 훼리틴보다 더욱 안정하며 core 형성에 우월함이 보고되었다.
- hfH 효모의 철분 결핍성 빈혈 개선에 대한 다른 연구가 아직 이루어지지 않아 본 실험의 결과를 선행 연구들과 비교하지 못하였지 만 영 양보충제로 사용되는 황산암모늄철과 비교함으로써 hfH 효모의 빈혈 개선 효과를 객관적으로 검토할 수 있었다. 본 실험은 hfH 효모의 빈혈 개선 기능에 대한 초기단계연구로 혈장 헤모글로빈 농도, 헤마토크릿, 간과 비장의 철분농도를 측정하여 이 4가지 지표만으로 빈혈 개선 효과를 판정하기에는 무리가 있다고 볼 수 있으므로 총 철분 결합능력 (total iron binding capasity, TIBC), 트랜스훼린 포화도 (transferrin saturation, TS), 분변의 철분 농도 등 다른 지표 물질에 대한 검토가 이루어져야 하겠다. 세포내 철분흡수기 전은 아직 완전히 연구되지 않았으며 효모에서 낮은 비율로 발현 생성된 훼리틴이 비교적 많은 양의 유동성 철분을 저장하고 있어 종합적으로 hfH 효모의 생체이용성이 높아 철분 공급원으로 우수하다고 할 수 있다.
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