우리나라의 양돈산업은 1970년대까지만 하여도 소규모, 부업농의 형태였으나 지속적인 발전을 통하여 현재는 대규모, 전문화 되었다. 그러나 이러한 사육형태의 긍정적인 발전과 반비례하여 각종 질병, 특히 호흡기 질병에 의한 피해는 양돈산업에 많은 경제적 손실을 주고 있다. 돼지의 주요 호흡기질병은 위축성 비염, 흉막 폐렴, mycoplama성 폐렴 및 파스튜렐라성 폐렴 등이 주종을 이룬다. 그리고 이외에 전신성 소모성 증후군 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS) 감염증의 원인체로 porcine circovirus ...
우리나라의 양돈산업은 1970년대까지만 하여도 소규모, 부업농의 형태였으나 지속적인 발전을 통하여 현재는 대규모, 전문화 되었다. 그러나 이러한 사육형태의 긍정적인 발전과 반비례하여 각종 질병, 특히 호흡기 질병에 의한 피해는 양돈산업에 많은 경제적 손실을 주고 있다. 돼지의 주요 호흡기질병은 위축성 비염, 흉막 폐렴, mycoplama성 폐렴 및 파스튜렐라성 폐렴 등이 주종을 이룬다. 그리고 이외에 전신성 소모성 증후군 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS) 감염증의 원인체로 porcine circovirus type 2 (PCV2)가 1997년 캐나다에서 최초 보고된 이후, 국내에서도 1997년부터 발생보고 되었다. 이 질병은 이유자돈에서 호흡기질환, 설사, 그리고 위축등을 일으키는 돼지의 중요 질병으로, 국내는 물론 세계적으로 발생되며 치료와 예방이 어려운 질병으로 인식되고 있다. 특히 이 PCV2는 여러 가지 폐렴, 예로 흉막 폐렴의 원인균인 Actinobacillus pleuropneumoniae와 복합 감염되어 심한 증상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 하지만 아직까지 PCV2 감염에 대한 예방백신은 없는 상태이며 그 연구가 진행중이다. A. pleuropneumoniae에 의해 발생하는 흉막폐렴은 급만성으로 전염성, 섬유소성, 출혈성 폐렴증상을 유발하며 양돈산업에 심각한 피해를 주고 있다. 일반적으로 흉막 폐렴의 백신으로 A. pleuropneumoniae 사균 백신이 주로 사용되고 있으나 완벽한 방어효과를 보이지는 못하고 있다. Mycoplasma hyopneumoniae에 의해 발병되는 mycoplasma성 폐렴은 돼지의 증체율저하 및 사료효율 감소등을 장기적으로 유발하는 소모성 질환이다. 현재까지 이 질병에 대한 예방 역시 사균백신을 이용한 방법이 이용되고 있다. 하지만 이러한 사균백신은 일반적으로 면역원성의 부족으로 인한 불완전한 방어효과와 근육주사 접종으로 인한 접종 스트레스는 돼지 자체의 면역기능까지도 떨어뜨릴 수 있는 단점이 있다. 이런 실정을 감안하여 본 연구는 돼지 호흡기 질병의 원인체인 PCV2의 capsid protein 및 A. pleuropneumoniae의 독소인 Apx I과 Apx II, 그리고 균체외막 단백질인 Transferrin-binding protein A와 B (Tbp A와 Tbp B)를, 그리고 M. hyopneumoniae의 adhesin protein인 P97의 30kDa 및 50kDa fragment를 E. coli expression system을 이용하여 재조합 단백질을 생산하고 이것을 점막백신의 carrier로써 연구되고 있는 chitosan과 함께 기도 점막에 분무를 실시하여 항원단백질에 대한 점막면역을 유도하고자 하였다. PCV2의 재조합 capsid 단백질, A. pleuropneumoniae의 toxin인 Apx I과 Apx II, 그리고 iron-uptake에 관여하는 막단백질인 Tbp A 및 Tbp B, 그리고 점막부착과 관련된 M. hyopneumoniae의 P97단백질의 30kDa 및 50kDa 분획을 재조합 단백질로 발현시켜서 denaturing condition에서 발현 여부 확인 및 순수분리를 실시하였다. 순수분리된 PCV2 capsid 단백질을 접종하여 생산된 mouse 항체는 PCV2에 감염된 돼지의 호흡기 조직내의 viral particle과 반응함으로써 재조합 단백질과 viral protein 사이에 공통항원성이 있음을 보여 주었다. 마찬가지로 각각 준비된 A. pleuropneumoniae 및 M. hyopneumoniae의 재조합 단백질들을 mouse에 접종하여 준비한 항체들은 원래의 균체단백질과 반응함으로써 모두가 공통항원성을 띄고 있음을 알 수 있었다. Chitosan의 점막부착성을 확인하기 위해 chitosan 농도를 설정하는 실험에서 2% chitosan이 가장 부착성 및 침투성이 좋은 것으로 나타나 이 농도를 이용하여 면역실험을 실시하였다. 한편 tracheal route를 통해 항원을 직접투여 하더라도 오연성 폐렴과 같은 부작용이 일어나지 않음을 육안 및 조직학적으로 확인 할 수 있었다. Chitosan과 혼합된 재조합 단백질 항원을 tracheal route를 통하여 접종하였을 경우 항원 특이적인 IgA 및 IgG가 생성됨을 Western blot assay를 통하여 알 수 있었다. 한편 항원 특이적 IgA 및 IgG의 생성 유도 여부를 알아보기 위해 실시한 ELISA 실험 결과, chitosan 혼합제재를 tracheal route를 통해 투여한 실험군은 PBS와 혼합하여 투여한 비교군에 비해 항원특이적 IgA는 pulmonary lavage 시료에서는 비교군에 비해 통계적으로 유의성 있게 약 4배, 그리고 lung tissue grind supernatant에서는 약 3배의 흡광도 수치를 나타내었다 (P<0.01). 특히 tracheal route를 통하여 유도된 IgG의 수치는 IM route를 통해 유도된 IgG titer와 거의 유사한 수치를 나타내었다. 또한 IM route를 통한 IgG 생성 유도 실험의 결과, chitosan 혼합 제재를 투여한 경우 PBS 혼합 투여 비교군에 비해 통계적으로 유의성 있게 약 2배의 흡광도 수치를 나타내었다 (P<0.01). 위의 결과들을 종합해본 결과, chitosan 혼합제를 tracheal route를 통하여 투여하면 효과적으로 IgA 및 IgG 생성 유도가 이루어지고 이로 인한 병원균의 침입에 대한 방어효과가 기대된다.
우리나라의 양돈산업은 1970년대까지만 하여도 소규모, 부업농의 형태였으나 지속적인 발전을 통하여 현재는 대규모, 전문화 되었다. 그러나 이러한 사육형태의 긍정적인 발전과 반비례하여 각종 질병, 특히 호흡기 질병에 의한 피해는 양돈산업에 많은 경제적 손실을 주고 있다. 돼지의 주요 호흡기질병은 위축성 비염, 흉막 폐렴, mycoplama성 폐렴 및 파스튜렐라성 폐렴 등이 주종을 이룬다. 그리고 이외에 전신성 소모성 증후군 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS) 감염증의 원인체로 porcine circovirus type 2 (PCV2)가 1997년 캐나다에서 최초 보고된 이후, 국내에서도 1997년부터 발생보고 되었다. 이 질병은 이유자돈에서 호흡기질환, 설사, 그리고 위축등을 일으키는 돼지의 중요 질병으로, 국내는 물론 세계적으로 발생되며 치료와 예방이 어려운 질병으로 인식되고 있다. 특히 이 PCV2는 여러 가지 폐렴, 예로 흉막 폐렴의 원인균인 Actinobacillus pleuropneumoniae와 복합 감염되어 심한 증상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 하지만 아직까지 PCV2 감염에 대한 예방백신은 없는 상태이며 그 연구가 진행중이다. A. pleuropneumoniae에 의해 발생하는 흉막폐렴은 급만성으로 전염성, 섬유소성, 출혈성 폐렴증상을 유발하며 양돈산업에 심각한 피해를 주고 있다. 일반적으로 흉막 폐렴의 백신으로 A. pleuropneumoniae 사균 백신이 주로 사용되고 있으나 완벽한 방어효과를 보이지는 못하고 있다. Mycoplasma hyopneumoniae에 의해 발병되는 mycoplasma성 폐렴은 돼지의 증체율저하 및 사료효율 감소등을 장기적으로 유발하는 소모성 질환이다. 현재까지 이 질병에 대한 예방 역시 사균백신을 이용한 방법이 이용되고 있다. 하지만 이러한 사균백신은 일반적으로 면역원성의 부족으로 인한 불완전한 방어효과와 근육주사 접종으로 인한 접종 스트레스는 돼지 자체의 면역기능까지도 떨어뜨릴 수 있는 단점이 있다. 이런 실정을 감안하여 본 연구는 돼지 호흡기 질병의 원인체인 PCV2의 capsid protein 및 A. pleuropneumoniae의 독소인 Apx I과 Apx II, 그리고 균체외막 단백질인 Transferrin-binding protein A와 B (Tbp A와 Tbp B)를, 그리고 M. hyopneumoniae의 adhesin protein인 P97의 30kDa 및 50kDa fragment를 E. coli expression system을 이용하여 재조합 단백질을 생산하고 이것을 점막백신의 carrier로써 연구되고 있는 chitosan과 함께 기도 점막에 분무를 실시하여 항원단백질에 대한 점막면역을 유도하고자 하였다. PCV2의 재조합 capsid 단백질, A. pleuropneumoniae의 toxin인 Apx I과 Apx II, 그리고 iron-uptake에 관여하는 막단백질인 Tbp A 및 Tbp B, 그리고 점막부착과 관련된 M. hyopneumoniae의 P97단백질의 30kDa 및 50kDa 분획을 재조합 단백질로 발현시켜서 denaturing condition에서 발현 여부 확인 및 순수분리를 실시하였다. 순수분리된 PCV2 capsid 단백질을 접종하여 생산된 mouse 항체는 PCV2에 감염된 돼지의 호흡기 조직내의 viral particle과 반응함으로써 재조합 단백질과 viral protein 사이에 공통항원성이 있음을 보여 주었다. 마찬가지로 각각 준비된 A. pleuropneumoniae 및 M. hyopneumoniae의 재조합 단백질들을 mouse에 접종하여 준비한 항체들은 원래의 균체단백질과 반응함으로써 모두가 공통항원성을 띄고 있음을 알 수 있었다. Chitosan의 점막부착성을 확인하기 위해 chitosan 농도를 설정하는 실험에서 2% chitosan이 가장 부착성 및 침투성이 좋은 것으로 나타나 이 농도를 이용하여 면역실험을 실시하였다. 한편 tracheal route를 통해 항원을 직접투여 하더라도 오연성 폐렴과 같은 부작용이 일어나지 않음을 육안 및 조직학적으로 확인 할 수 있었다. Chitosan과 혼합된 재조합 단백질 항원을 tracheal route를 통하여 접종하였을 경우 항원 특이적인 IgA 및 IgG가 생성됨을 Western blot assay를 통하여 알 수 있었다. 한편 항원 특이적 IgA 및 IgG의 생성 유도 여부를 알아보기 위해 실시한 ELISA 실험 결과, chitosan 혼합제재를 tracheal route를 통해 투여한 실험군은 PBS와 혼합하여 투여한 비교군에 비해 항원특이적 IgA는 pulmonary lavage 시료에서는 비교군에 비해 통계적으로 유의성 있게 약 4배, 그리고 lung tissue grind supernatant에서는 약 3배의 흡광도 수치를 나타내었다 (P<0.01). 특히 tracheal route를 통하여 유도된 IgG의 수치는 IM route를 통해 유도된 IgG titer와 거의 유사한 수치를 나타내었다. 또한 IM route를 통한 IgG 생성 유도 실험의 결과, chitosan 혼합 제재를 투여한 경우 PBS 혼합 투여 비교군에 비해 통계적으로 유의성 있게 약 2배의 흡광도 수치를 나타내었다 (P<0.01). 위의 결과들을 종합해본 결과, chitosan 혼합제를 tracheal route를 통하여 투여하면 효과적으로 IgA 및 IgG 생성 유도가 이루어지고 이로 인한 병원균의 침입에 대한 방어효과가 기대된다.
This study describes the cloning and expression of 7 recombinant proteins, porcine circovirus type 2 (PCV2) capsid protein, Actibobacillus pleuropneumoniae Apx Ⅰ, Apx Ⅱ, Tbp A, and Tbp B, and 30kDa and 50kDa fragments of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin protein in an Escherichia coli expression ...
This study describes the cloning and expression of 7 recombinant proteins, porcine circovirus type 2 (PCV2) capsid protein, Actibobacillus pleuropneumoniae Apx Ⅰ, Apx Ⅱ, Tbp A, and Tbp B, and 30kDa and 50kDa fragments of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin protein in an Escherichia coli expression system to produce a fusion protein for subsequent immunological studies. The genes encoding each protein were amplified from the genomic DNA of original pathogens by PCR and cloned into a pRSET prokaryotic expression vector, which is under the control of the T7 promoter, downstream of a 6X histidine sequence tag. The presence of each insert was confirmed by restriction analysis and by sequencing after the propagation of recombinant DNA in E. coli JM109. Two new nucleotide sequences of the PCV2 capsid gene were found (GenBank accession numbers: AY672600 and AY672601). E.coli BL21(DE3)pLysS was transformed with constructs containing each protein gene sequence. Recombinant proteins were expressed by the addition of IPTG and the expression was visualized by SDS-PAGE. Each protein was purified under denaturing condition using a Ni^(2+)-resin affinity column. Mouse polyclonal antibody raised against purified recombinant PCV2 capsid protein reacted with viral particles in a frozen section of lung on immunofluorescence assay (IFA). And the antibody from the pig with PCV2 infection reacted with the recombinant protein on a Western blot assay. These results indicate that the recombinant protein can induce an immunological response and possess the common antigenicity with the viral capsid protein. Mouse antisera raised against the 30kDa and 50kDa fragments of M. hyopneumoniae adhesin protein, P97, reacted with the mycoplasmal 97kDa protein each, indicating those two fragments are both immunogenic and can induce immune responses. Bacterial toxins (Apx Ⅰ and Apx Ⅱ) and membrane-bound proteins (Tbp A and Tbp B) of A. pleuropneumoniae were reacted with polyclonal antibodies raised against each recombinant protein, indicating that those recombinant proteins share the common antigen properties with the bacterial proteins. Chitosan formulation was found to be the most effective in adherence and infiltration into the respiratory tract when prepared with 2% concentration. In addition, no side-effect such as inhalation pneumonia was observed though the antigen was administrated directly to the respiratory tract. Antigen-specific IgA production was induced 4 times more when conjugated with chitosan than with PBS by the administration via tracheal route. Also, when administrated via tracheal route, high titer of antigen-specific IgG was induced, even as much as that of intramuscular route. These findings suggest that the tracheal administration of recombinant protein antigen conjugated with chitosan can induce antigen-specific immune responses by the production of both IgA and IgG.
This study describes the cloning and expression of 7 recombinant proteins, porcine circovirus type 2 (PCV2) capsid protein, Actibobacillus pleuropneumoniae Apx Ⅰ, Apx Ⅱ, Tbp A, and Tbp B, and 30kDa and 50kDa fragments of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin protein in an Escherichia coli expression system to produce a fusion protein for subsequent immunological studies. The genes encoding each protein were amplified from the genomic DNA of original pathogens by PCR and cloned into a pRSET prokaryotic expression vector, which is under the control of the T7 promoter, downstream of a 6X histidine sequence tag. The presence of each insert was confirmed by restriction analysis and by sequencing after the propagation of recombinant DNA in E. coli JM109. Two new nucleotide sequences of the PCV2 capsid gene were found (GenBank accession numbers: AY672600 and AY672601). E.coli BL21(DE3)pLysS was transformed with constructs containing each protein gene sequence. Recombinant proteins were expressed by the addition of IPTG and the expression was visualized by SDS-PAGE. Each protein was purified under denaturing condition using a Ni^(2+)-resin affinity column. Mouse polyclonal antibody raised against purified recombinant PCV2 capsid protein reacted with viral particles in a frozen section of lung on immunofluorescence assay (IFA). And the antibody from the pig with PCV2 infection reacted with the recombinant protein on a Western blot assay. These results indicate that the recombinant protein can induce an immunological response and possess the common antigenicity with the viral capsid protein. Mouse antisera raised against the 30kDa and 50kDa fragments of M. hyopneumoniae adhesin protein, P97, reacted with the mycoplasmal 97kDa protein each, indicating those two fragments are both immunogenic and can induce immune responses. Bacterial toxins (Apx Ⅰ and Apx Ⅱ) and membrane-bound proteins (Tbp A and Tbp B) of A. pleuropneumoniae were reacted with polyclonal antibodies raised against each recombinant protein, indicating that those recombinant proteins share the common antigen properties with the bacterial proteins. Chitosan formulation was found to be the most effective in adherence and infiltration into the respiratory tract when prepared with 2% concentration. In addition, no side-effect such as inhalation pneumonia was observed though the antigen was administrated directly to the respiratory tract. Antigen-specific IgA production was induced 4 times more when conjugated with chitosan than with PBS by the administration via tracheal route. Also, when administrated via tracheal route, high titer of antigen-specific IgG was induced, even as much as that of intramuscular route. These findings suggest that the tracheal administration of recombinant protein antigen conjugated with chitosan can induce antigen-specific immune responses by the production of both IgA and IgG.
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