[학위논문]사람 페리틴의 발현에 의해 유도된 철 결핍에 있어서 재조합 효모의 프로테오믹 분석 : Proteomic analysis of the recombinant Saccharomyces cerevisiae upon iron deficiency induced by producing human ferritin원문보기
철 이온은 살아있는 모든 생물체에 꼭 필요한 원소이며 생명유지에 필요한 세포 작용에 있어서 다양한 cofactor로써 작용한다. 조절기작을 포함하는 철 항상성은 세포내에서 정교하게 조절되어진다. 복잡한 조절 기작에도 불구하고, 철의 이상 (철 결핍과 철 과잉)은 건강에 있어서 중요한 문제이다. 철 결핍은 세계적으로 영양학적 측면에서 일차적인 이상 현상이지만, 이 철 결핍에 있어서 세포의 반응에 대해서는 알려진 바가 없다. 대부분의 진핵세폳르에 있어서 세포내 철은 철 저장 단백질인 ferritin에 저장되어지지만, 효모인 Saccharomyces cerevisiae에서는 ferritin이 존재하지 않는다. 최근, HeLa 세포내에서 H-ferritin을 과발현 시키면 세포내 철 결핍이 유도 되고 세포내 LIP(labile iron ...
철 이온은 살아있는 모든 생물체에 꼭 필요한 원소이며 생명유지에 필요한 세포 작용에 있어서 다양한 cofactor로써 작용한다. 조절기작을 포함하는 철 항상성은 세포내에서 정교하게 조절되어진다. 복잡한 조절 기작에도 불구하고, 철의 이상 (철 결핍과 철 과잉)은 건강에 있어서 중요한 문제이다. 철 결핍은 세계적으로 영양학적 측면에서 일차적인 이상 현상이지만, 이 철 결핍에 있어서 세포의 반응에 대해서는 알려진 바가 없다. 대부분의 진핵세폳르에 있어서 세포내 철은 철 저장 단백질인 ferritin에 저장되어지지만, 효모인 Saccharomyces cerevisiae에서는 ferritin이 존재하지 않는다. 최근, HeLa 세포내에서 H-ferritin을 과발현 시키면 세포내 철 결핍이 유도 되고 세포내 LIP(labile iron pool)을 감소시킴이 확인되어졌다. 본 연구에서는 효모 S, cerevisiae에서 인간 ferritin H-chain과 H/L-chain 그리고 H-chain 변이체의 발현과 철을 포집하는 H-ferritin의 세포내 영항을 단백질 차원에서 확인하고자 하였다. 그 결과 S cerevisia에서 생산된 재조합 H-ferritin 동형집합체와 이형집합체는 in vivo에서 기능적으로 철을 축적하는 활성을 보였지만 H-ferritin 변이체 H2-KG는 활성을 보이지 않았다. 이렇게 효보에서 생산된 재조합 인간 ferritin들은 철을 축적하는 초기 반응 속도(iron uptake)와 재치환율 (reconstitution)에 있어서 서로 다른 분자적 특성을 가짐을 확인하였다. Isoelectric focusing을 통해 효모에서 생산된 H-ferritin는 N-glycosylation이 일어났음을 확인하였고, 반면 L-ferritin는 다른 post-translation modification이 일어 났음을 알 수 있었다. 그리하여 이런 modification은 iron uptake와 reconstitution yield에 영향을 주었음을 유추할 수 있었다. 효모 세포내 철 농도는 ferritin 유전자의 발현에 의해 증가하였다. 14.3mM Fe^(2+)를 첨가했을 때,H-ferritin과 ferritin 이형집합체를 생산하는 재조합 효모에 있어서 대조균주에 비해 각각 1.2배와 2배 증가함을 확인하였다. H-ferritin을 생산하는 재조합 효모는 발현된 ferritin내에 철을 축적함과 동시에 세포생장의 저해를 보였다. 이러한 세포 생장 속도는 배양 배지에 철을 첨가시킴으로써 회복되었다. 더욱이, 철 결핍시 유도되어지는 FIR1과 FIT3 유전자가 ferritin의 발현과 함께 초기에 발현되었고, H₂O₂를 처리하여 ROS의 형성을 비교한 결과 그 양이 크게 감소되었음을 확인하였다. 따라서 H-ferritin의 발현은 세포질내 처감소를 초래한 것으로 유츄되어진다. 철 결핍하에서 유진자 발현의 변화를 YGT와 YGH2 그리고 YGH2-KG 균주의 수용성 단백질들과 비수용성 단백질들의 2-DE를 이용하여 실험하였다. YGH2-KG 균주에서 생산된 H-ferritin 변이체는 세포내에서 비활성을 보였다. 따라서 YGH2-KG 균주의 2-DE gel은 YGH2에서의 외부유전자의 발현에 따른 영향과 H-ferritin의 또 다른 기능을 배제하기 위하여 사용되었다. YGH2의 수용성 분획에 2-DE gel에서 330개 이상의 단백질 spot들을 확인하였다. YGT 그리고 YGH2-KG와 비교하여 철 결핍이 유도된 YGH의 2-DE에서 증가되고 감소된 단백질 spot들을 확인한 결과, 철 결핍에의해 31개의 단백질이 증가하였고 43개의 다른 단백질들은 감소하였다. 이들 중 증가된 20개의 단백질과 감소된 19개의 단백질을 nano-LC/MS/MS를 이용하여 확인하였다. 철 결핍에서 증가된 단백질들은 주로 heat shock protein과 NADH를 생산하는 단백질들 이였다. 반면 sulfur와 amino acid 그리고 nucleotide 합성에 관여하는 단백질들과 기능을 알 수 없는 단백질들이 감소되었다. 또한 YGH2의 비수용성 분획에서의 2-DE gel에서 420개의 단백질들이 확인되어졌다. 그중 native form에서는 수용성인 단백질들인 10개의 spot들은 YGH2-KG와 비교하여 증가되었다. 특히 ribosomal assembly에 관련된 단백질들과 N-terminal이 절단된 단백질 fragment들이 비수용성 분획에서 확인되어졌다. 이것은 세포내 철 결핍이 비수용성 분획에서 확인되 많은 단백질들의 분완전한 translation을 야기시켰음을 유추할 수 있다. 세포의 철 결핍은 세포 생장을 저해시키고 세포를 죽음에 이르게 한다. 따라서 이런 발현 시스템은 철 결핍에서 세포내 활동에 영향을 줄 수 있는 조절 네트워크와 경로의 새로운 정보를 제공할 수 있다. 또한 이연구는 in vivo에서 생물학적 기능이 아직 알려져 있지 않는 두 subunit오의 ferritin기능을 밝히는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
철 이온은 살아있는 모든 생물체에 꼭 필요한 원소이며 생명유지에 필요한 세포 작용에 있어서 다양한 cofactor로써 작용한다. 조절기작을 포함하는 철 항상성은 세포내에서 정교하게 조절되어진다. 복잡한 조절 기작에도 불구하고, 철의 이상 (철 결핍과 철 과잉)은 건강에 있어서 중요한 문제이다. 철 결핍은 세계적으로 영양학적 측면에서 일차적인 이상 현상이지만, 이 철 결핍에 있어서 세포의 반응에 대해서는 알려진 바가 없다. 대부분의 진핵세폳르에 있어서 세포내 철은 철 저장 단백질인 ferritin에 저장되어지지만, 효모인 Saccharomyces cerevisiae에서는 ferritin이 존재하지 않는다. 최근, HeLa 세포내에서 H-ferritin을 과발현 시키면 세포내 철 결핍이 유도 되고 세포내 LIP(labile iron pool)을 감소시킴이 확인되어졌다. 본 연구에서는 효모 S, cerevisiae에서 인간 ferritin H-chain과 H/L-chain 그리고 H-chain 변이체의 발현과 철을 포집하는 H-ferritin의 세포내 영항을 단백질 차원에서 확인하고자 하였다. 그 결과 S cerevisia에서 생산된 재조합 H-ferritin 동형집합체와 이형집합체는 in vivo에서 기능적으로 철을 축적하는 활성을 보였지만 H-ferritin 변이체 H2-KG는 활성을 보이지 않았다. 이렇게 효보에서 생산된 재조합 인간 ferritin들은 철을 축적하는 초기 반응 속도(iron uptake)와 재치환율 (reconstitution)에 있어서 서로 다른 분자적 특성을 가짐을 확인하였다. Isoelectric focusing을 통해 효모에서 생산된 H-ferritin는 N-glycosylation이 일어났음을 확인하였고, 반면 L-ferritin는 다른 post-translation modification이 일어 났음을 알 수 있었다. 그리하여 이런 modification은 iron uptake와 reconstitution yield에 영향을 주었음을 유추할 수 있었다. 효모 세포내 철 농도는 ferritin 유전자의 발현에 의해 증가하였다. 14.3mM Fe^(2+)를 첨가했을 때,H-ferritin과 ferritin 이형집합체를 생산하는 재조합 효모에 있어서 대조균주에 비해 각각 1.2배와 2배 증가함을 확인하였다. H-ferritin을 생산하는 재조합 효모는 발현된 ferritin내에 철을 축적함과 동시에 세포생장의 저해를 보였다. 이러한 세포 생장 속도는 배양 배지에 철을 첨가시킴으로써 회복되었다. 더욱이, 철 결핍시 유도되어지는 FIR1과 FIT3 유전자가 ferritin의 발현과 함께 초기에 발현되었고, H₂O₂를 처리하여 ROS의 형성을 비교한 결과 그 양이 크게 감소되었음을 확인하였다. 따라서 H-ferritin의 발현은 세포질내 처감소를 초래한 것으로 유츄되어진다. 철 결핍하에서 유진자 발현의 변화를 YGT와 YGH2 그리고 YGH2-KG 균주의 수용성 단백질들과 비수용성 단백질들의 2-DE를 이용하여 실험하였다. YGH2-KG 균주에서 생산된 H-ferritin 변이체는 세포내에서 비활성을 보였다. 따라서 YGH2-KG 균주의 2-DE gel은 YGH2에서의 외부유전자의 발현에 따른 영향과 H-ferritin의 또 다른 기능을 배제하기 위하여 사용되었다. YGH2의 수용성 분획에 2-DE gel에서 330개 이상의 단백질 spot들을 확인하였다. YGT 그리고 YGH2-KG와 비교하여 철 결핍이 유도된 YGH의 2-DE에서 증가되고 감소된 단백질 spot들을 확인한 결과, 철 결핍에의해 31개의 단백질이 증가하였고 43개의 다른 단백질들은 감소하였다. 이들 중 증가된 20개의 단백질과 감소된 19개의 단백질을 nano-LC/MS/MS를 이용하여 확인하였다. 철 결핍에서 증가된 단백질들은 주로 heat shock protein과 NADH를 생산하는 단백질들 이였다. 반면 sulfur와 amino acid 그리고 nucleotide 합성에 관여하는 단백질들과 기능을 알 수 없는 단백질들이 감소되었다. 또한 YGH2의 비수용성 분획에서의 2-DE gel에서 420개의 단백질들이 확인되어졌다. 그중 native form에서는 수용성인 단백질들인 10개의 spot들은 YGH2-KG와 비교하여 증가되었다. 특히 ribosomal assembly에 관련된 단백질들과 N-terminal이 절단된 단백질 fragment들이 비수용성 분획에서 확인되어졌다. 이것은 세포내 철 결핍이 비수용성 분획에서 확인되 많은 단백질들의 분완전한 translation을 야기시켰음을 유추할 수 있다. 세포의 철 결핍은 세포 생장을 저해시키고 세포를 죽음에 이르게 한다. 따라서 이런 발현 시스템은 철 결핍에서 세포내 활동에 영향을 줄 수 있는 조절 네트워크와 경로의 새로운 정보를 제공할 수 있다. 또한 이연구는 in vivo에서 생물학적 기능이 아직 알려져 있지 않는 두 subunit오의 ferritin기능을 밝히는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
Iron is an element which is essential to the survival of most living organisms, and functions as a cofactor for a wide variety of vital cellular processes. Iron homeostasis, including its relevant regulatory mechanisms, should be tightly controlled. Despite the presence of a complex regulatory syste...
Iron is an element which is essential to the survival of most living organisms, and functions as a cofactor for a wide variety of vital cellular processes. Iron homeostasis, including its relevant regulatory mechanisms, should be tightly controlled. Despite the presence of a complex regulatory system in most organisms, iron disorders (both iron deficiency and iron overload) can result in severe health problems. Although iron deficiency is the principal nutritional disorder found worldwide, the cellular responses to iron deprivation remain rather poorly understood. In most eukaryotes, intracellular iron is stored in the major iron storage protein, ferritin. However, Saccharomyces cerevisiae does not produce this protein. It has previously been reported that transfectant HeLa cells which generate human H-ferritin exhibit an iron-deficiency phenotype, as well as the reduction of the labile iron pool. In this study, we have established the heterologous expression of the human ferritin H-chain, H/L-chain, and H-chain variant, and also attempted to characterize the cellular effects of H-ferritin in yeasts, via proteomic profiling analyses. We determined that the recombinant H-ferritin homopolymers and H/L-ferritin heteropolymers generated by S. cerevisiae were functionally active in vivo, whereas the H-ferritin variant, H2-KG, was not. In our observations of the yeast-derived recombinant human ferritins, we detected some variations in the chemical properties of the respective ferritins, including differences in iron uptake kinetics and core reconstitution characteristics. These proteins were then analyzed further via isoelectric focusing, in which yeast-derived rLF was not N-glycosylated but that yeast-derived rHF was. This suggests that other post-translational modifications are involved in the L-ferritin. It is thus assumed that such modifications may affect the uptake kinetics and the reconstitution yields. Cellular iron concentrations in S. cerevisiae expressing genes for ferritin were found to have increased. When cultured cells were incubated with 14.3 mM Fe2+, the recombinant yeasts which expressed hfH and hfH/hfL were found to harbor a cellular iron concentration of 1.2 times and 2 times that of the control strain, respectively. The YGH2 cells which generated H-ferritin also exhibited a pattern of impaired growth, which occurred in a direct fashion with ferritin expression and the formation of the core minerals. Growth rates recovered after iron was added to the culture medium. Moreover, two genes (FIR1 and FIT3) induced under iron deprivation conditions were expressed at earlier times than normal, according to the degree to which ferritin expression and reactive oxygen species (ROS) production by H2O2 were reduced. Therefore, it is assumed that heterologous expression of H-ferritin induced cytosolic iron depletion. We attempted to characterize the changes in gene expression responsible for this iron deletion via the performance of comparative two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) of both the water-soluble and insoluble proteins of YGT, YGH2 and YGH2-KG. The H-ferritin mutant, H2-KG, was inactivated in vivo. The 2-DE gel of the YGH2-KG strain was utilized in the removal of the effects of foreign gene expression in YGH2, as well as other functions of H-ferritin. We detected both increased and decreased protein spots on the 2-DE gel of the YGH2 strain, in which the iron deficiency was comparatively more severe than in the YGT and YGH2-KG strains. We detected more than 330 protein spots via 2-DE from the soluble fraction of YGH2. The levels of expression of 31 proteins were determined to have increased, whereas 43 other proteins were decreased as the result of iron deficiency. 20 increased and 19 decreased proteins were identified via nano-LC/MS/MS. The proteins which were increased under iron depletion conditions included major heat shock proteins, proteins involved in the regeneration of NADH. On the other hand, the levels of expression of proteins involved with the metabolism of sulfur, amino acids, and nucleotides, as well as proteins of unknown function, were shown to have been reduced. In addition, 420 protein spots were detected in the insoluble fraction of YGH2. Among these, 10 protein spots, which were otherwise soluble in their native forms, exhibited increased expression in this strain, as compared to YGH-KG. Interestingly, we identified the N-terminal truncated protein fragments of Idh1 and Pgk1, as well as several ribosomal assembly-related proteins, in the insoluble fractions. This would appear to suggest that intracellular iron depletion induces the imperfect translation of many of the proteins identified in the insoluble fractions. Cellular iron deficiency conditions tend to result in the arrest of cell growth, and eventually culminate in cell death. Therefore, our study into the expression systems induced iron deficiency have provided us with new insight into the regulatory network and pathways, in terms of their effects on cellular activities under iron depletion conditions. Additionally, the results of this study will facilitate the eventual elucidation of the biological functions of ferritin subunits, as the ferritins of the two subunits in vivo remain a matter of some controversy.
Iron is an element which is essential to the survival of most living organisms, and functions as a cofactor for a wide variety of vital cellular processes. Iron homeostasis, including its relevant regulatory mechanisms, should be tightly controlled. Despite the presence of a complex regulatory system in most organisms, iron disorders (both iron deficiency and iron overload) can result in severe health problems. Although iron deficiency is the principal nutritional disorder found worldwide, the cellular responses to iron deprivation remain rather poorly understood. In most eukaryotes, intracellular iron is stored in the major iron storage protein, ferritin. However, Saccharomyces cerevisiae does not produce this protein. It has previously been reported that transfectant HeLa cells which generate human H-ferritin exhibit an iron-deficiency phenotype, as well as the reduction of the labile iron pool. In this study, we have established the heterologous expression of the human ferritin H-chain, H/L-chain, and H-chain variant, and also attempted to characterize the cellular effects of H-ferritin in yeasts, via proteomic profiling analyses. We determined that the recombinant H-ferritin homopolymers and H/L-ferritin heteropolymers generated by S. cerevisiae were functionally active in vivo, whereas the H-ferritin variant, H2-KG, was not. In our observations of the yeast-derived recombinant human ferritins, we detected some variations in the chemical properties of the respective ferritins, including differences in iron uptake kinetics and core reconstitution characteristics. These proteins were then analyzed further via isoelectric focusing, in which yeast-derived rLF was not N-glycosylated but that yeast-derived rHF was. This suggests that other post-translational modifications are involved in the L-ferritin. It is thus assumed that such modifications may affect the uptake kinetics and the reconstitution yields. Cellular iron concentrations in S. cerevisiae expressing genes for ferritin were found to have increased. When cultured cells were incubated with 14.3 mM Fe2+, the recombinant yeasts which expressed hfH and hfH/hfL were found to harbor a cellular iron concentration of 1.2 times and 2 times that of the control strain, respectively. The YGH2 cells which generated H-ferritin also exhibited a pattern of impaired growth, which occurred in a direct fashion with ferritin expression and the formation of the core minerals. Growth rates recovered after iron was added to the culture medium. Moreover, two genes (FIR1 and FIT3) induced under iron deprivation conditions were expressed at earlier times than normal, according to the degree to which ferritin expression and reactive oxygen species (ROS) production by H2O2 were reduced. Therefore, it is assumed that heterologous expression of H-ferritin induced cytosolic iron depletion. We attempted to characterize the changes in gene expression responsible for this iron deletion via the performance of comparative two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) of both the water-soluble and insoluble proteins of YGT, YGH2 and YGH2-KG. The H-ferritin mutant, H2-KG, was inactivated in vivo. The 2-DE gel of the YGH2-KG strain was utilized in the removal of the effects of foreign gene expression in YGH2, as well as other functions of H-ferritin. We detected both increased and decreased protein spots on the 2-DE gel of the YGH2 strain, in which the iron deficiency was comparatively more severe than in the YGT and YGH2-KG strains. We detected more than 330 protein spots via 2-DE from the soluble fraction of YGH2. The levels of expression of 31 proteins were determined to have increased, whereas 43 other proteins were decreased as the result of iron deficiency. 20 increased and 19 decreased proteins were identified via nano-LC/MS/MS. The proteins which were increased under iron depletion conditions included major heat shock proteins, proteins involved in the regeneration of NADH. On the other hand, the levels of expression of proteins involved with the metabolism of sulfur, amino acids, and nucleotides, as well as proteins of unknown function, were shown to have been reduced. In addition, 420 protein spots were detected in the insoluble fraction of YGH2. Among these, 10 protein spots, which were otherwise soluble in their native forms, exhibited increased expression in this strain, as compared to YGH-KG. Interestingly, we identified the N-terminal truncated protein fragments of Idh1 and Pgk1, as well as several ribosomal assembly-related proteins, in the insoluble fractions. This would appear to suggest that intracellular iron depletion induces the imperfect translation of many of the proteins identified in the insoluble fractions. Cellular iron deficiency conditions tend to result in the arrest of cell growth, and eventually culminate in cell death. Therefore, our study into the expression systems induced iron deficiency have provided us with new insight into the regulatory network and pathways, in terms of their effects on cellular activities under iron depletion conditions. Additionally, the results of this study will facilitate the eventual elucidation of the biological functions of ferritin subunits, as the ferritins of the two subunits in vivo remain a matter of some controversy.
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#Saccharomyces cerevisiae iron deficiency ferritin
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