Type II 제한 효소는 단백질과 DNA 이중 나선상 에서 특이적인 염기 서열 간에 상호작용에 대한 연구를 위한 모델시스템을 제공한다. 본 실험에서는 Eco RI 제한 효소와 기질간의 상호작용의 특징적인 방식을 조사하였다. 본 연구에서 효소 반응의 정도는 agarose 에 의해 산물을 분리한 후에 flim ...
Type II 제한 효소는 단백질과 DNA 이중 나선상 에서 특이적인 염기 서열 간에 상호작용에 대한 연구를 위한 모델시스템을 제공한다. 본 실험에서는 Eco RI 제한 효소와 기질간의 상호작용의 특징적인 방식을 조사하였다. 본 연구에서 효소 반응의 정도는 agarose 에 의해 산물을 분리한 후에 flim scanning technique으로 자사되었다. 초 나선형과 직선형 pBR 322 DNA 모두는 pH 7.5, $37\,^\circ\!C$ 에서 최적의 활성도를 나타내었으며, 활성화 에너지 ($E_a$) 는 8.5 Kcal/mole 로 동일 하였다. 기질의 형태 차이는 pH 나 온도에 대한 효소의 최적 활성 상태를 갖는 조건에 영향을 미치지 못했다. 또한 $Mg^{++}$ 이온은 5 mM 에서 최적 활성도를 보였으며 기질의 형태 차이에 관계 없었다. 두 기질은 50 mM NaCl농도에서 모두 최적 활성도를 보였다. 기질의 형태와 인식 자리 근처의 비 특이적인 결합 부위가 효소기질 상호 작용에 관계가 있는 가에 대해 조사하였다. 초 나선형과 직선형 pBR 322 DNA 와 $\lambda$ DNA 의 $K_M$ 값은 각각 5.8 nM, 8.1nM그리고 3.2 nM 이었다. $K_M$ 값으로 부터 초 나선형 기질은 직선형 기질보다 효소에 대해 더 친화력이 있는 것으로 dhづ립돛만 }$\lambda$ DNA 가 직선형 pBR 322 DNA 보다 효소에 대해 더 친화력이 있는 것으로 나타났다. Eco RI 제한 효소의 활성 부위에 있는 prototropic group 의 pK 값은 Dixon-Webb 도면을 사용하여 기울기 1/s 과 $V_{\max_{app}}$ 의 pH-의존성을 측정 함으로써 결정 되었다. 그 도면으로 부터 $V_{\max = 1 nM,\; pKes_1 = 5.5$, 그리고 $pKes_2 = 9.0$의 값을 얻었다. pKes_1$ 값은 Histidine 의 imidazolium 의 값으로 나타났으며, $pKes_2$ 의 값은 시스테인의 sulfhydryl 혹은 세린의 hydroxyl 의 값으로 나타났다. 따라서 일련의 kinetic실험에 기초하여 Eco RI 제한 효소에 의한 phosphatiesterase 작용의 모델 기작이 제안 되었다.
Type II 제한 효소는 단백질과 DNA 이중 나선상 에서 특이적인 염기 서열 간에 상호작용에 대한 연구를 위한 모델시스템을 제공한다. 본 실험에서는 Eco RI 제한 효소와 기질간의 상호작용의 특징적인 방식을 조사하였다. 본 연구에서 효소 반응의 정도는 agarose 에 의해 산물을 분리한 후에 flim scanning technique으로 자사되었다. 초 나선형과 직선형 pBR 322 DNA 모두는 pH 7.5, $37\,^\circ\!C$ 에서 최적의 활성도를 나타내었으며, 활성화 에너지 ($E_a$) 는 8.5 Kcal/mole 로 동일 하였다. 기질의 형태 차이는 pH 나 온도에 대한 효소의 최적 활성 상태를 갖는 조건에 영향을 미치지 못했다. 또한 $Mg^{++}$ 이온은 5 mM 에서 최적 활성도를 보였으며 기질의 형태 차이에 관계 없었다. 두 기질은 50 mM NaCl농도에서 모두 최적 활성도를 보였다. 기질의 형태와 인식 자리 근처의 비 특이적인 결합 부위가 효소기질 상호 작용에 관계가 있는 가에 대해 조사하였다. 초 나선형과 직선형 pBR 322 DNA 와 $\lambda$ DNA 의 $K_M$ 값은 각각 5.8 nM, 8.1nM그리고 3.2 nM 이었다. $K_M$ 값으로 부터 초 나선형 기질은 직선형 기질보다 효소에 대해 더 친화력이 있는 것으로 dhづ립돛만 }$\lambda$ DNA 가 직선형 pBR 322 DNA 보다 효소에 대해 더 친화력이 있는 것으로 나타났다. Eco RI 제한 효소의 활성 부위에 있는 prototropic group 의 pK 값은 Dixon-Webb 도면을 사용하여 기울기 1/s 과 $V_{\max_{app}}$ 의 pH-의존성을 측정 함으로써 결정 되었다. 그 도면으로 부터 $V_{\max = 1 nM,\; pKes_1 = 5.5$, 그리고 $pKes_2 = 9.0$의 값을 얻었다. pKes_1$ 값은 Histidine 의 imidazolium 의 값으로 나타났으며, $pKes_2$ 의 값은 시스테인의 sulfhydryl 혹은 세린의 hydroxyl 의 값으로 나타났다. 따라서 일련의 kinetic실험에 기초하여 Eco RI 제한 효소에 의한 phosphatiesterase 작용의 모델 기작이 제안 되었다.
Type II restriction endonucleases provide a system for the study on the interaction between proteins and specific nucleotide sequences on DNA molecules. We investigated a characteristic mode of the interaction between EcoRI endonuclease and substrates. In the study, the degree of the enzymic reactio...
Type II restriction endonucleases provide a system for the study on the interaction between proteins and specific nucleotide sequences on DNA molecules. We investigated a characteristic mode of the interaction between EcoRI endonuclease and substrates. In the study, the degree of the enzymic reaction was monitored by film scanning technique after separation of the resulting products by agarose. Both superhelical and linear pBR322 DNA showed maximal activity at pH7.5. Therefore, shape difference of substrate did not affect the optimal activity of enzyme as a function of pH. The rate of DNA cleavage by the enzyme was maximal at $37\,^\circ\!C$ and the activation energy ($E_a$) was 8.5 Kcal/mole at pH 7.5 irrespective of superhelical or linear form. The optimal concentration of $Mg^{++}$ for the enzyme activity was found to be 5 mM. Although a little activity difference was exhibited, both substrates showed the same optimal activity at 5 mM $MgCl_2$ concentration. Also both substrates showed same maximal activity at 50 mM NaCl concentration. It was investigated whether or not the shapes of substrates and non-specific binding sites near the recognition site were related to the enzyme-substrate interaction. $K_m$ value of superhelical and linear pBR322 DNA and $\lambda$ DNA was 5.8 nM, 8.1 nM, and 3.2 nM, respectively. It was shown that superhelical form had the more affinity than linear form to enzyme, and that $\lambda$ DNA had the more affinity than linear pBR322 DNA to enzyme. The pK values of the prototropic groups at the active site of EcoRI endonuclease were determined by measuring the pH-dependence of slope$_{1/s}$ and $\mbox{V_{max_{app}}}$ using Dixon-Webb plots. The plot was shown for $\mbox{V_{max}}=1$ nM, $\mbix{pK_{es1}}=5.5$, and $\mbox{pK_{es2}}=9.0$. $\mbox{pK_{es1}}$ value was contained to imidazolium (of histidine) pK value range. $\mbox{pK_{es2}}$ value was similar to sulfhydryl (of cysteine) and hydroxyl (of serine) pK value. Based on a series of kinetic experiment, a model mechanism of phosphodiesterase action by EcoRI endonuclease was suggested.
Type II restriction endonucleases provide a system for the study on the interaction between proteins and specific nucleotide sequences on DNA molecules. We investigated a characteristic mode of the interaction between EcoRI endonuclease and substrates. In the study, the degree of the enzymic reaction was monitored by film scanning technique after separation of the resulting products by agarose. Both superhelical and linear pBR322 DNA showed maximal activity at pH7.5. Therefore, shape difference of substrate did not affect the optimal activity of enzyme as a function of pH. The rate of DNA cleavage by the enzyme was maximal at $37\,^\circ\!C$ and the activation energy ($E_a$) was 8.5 Kcal/mole at pH 7.5 irrespective of superhelical or linear form. The optimal concentration of $Mg^{++}$ for the enzyme activity was found to be 5 mM. Although a little activity difference was exhibited, both substrates showed the same optimal activity at 5 mM $MgCl_2$ concentration. Also both substrates showed same maximal activity at 50 mM NaCl concentration. It was investigated whether or not the shapes of substrates and non-specific binding sites near the recognition site were related to the enzyme-substrate interaction. $K_m$ value of superhelical and linear pBR322 DNA and $\lambda$ DNA was 5.8 nM, 8.1 nM, and 3.2 nM, respectively. It was shown that superhelical form had the more affinity than linear form to enzyme, and that $\lambda$ DNA had the more affinity than linear pBR322 DNA to enzyme. The pK values of the prototropic groups at the active site of EcoRI endonuclease were determined by measuring the pH-dependence of slope$_{1/s}$ and $\mbox{V_{max_{app}}}$ using Dixon-Webb plots. The plot was shown for $\mbox{V_{max}}=1$ nM, $\mbix{pK_{es1}}=5.5$, and $\mbox{pK_{es2}}=9.0$. $\mbox{pK_{es1}}$ value was contained to imidazolium (of histidine) pK value range. $\mbox{pK_{es2}}$ value was similar to sulfhydryl (of cysteine) and hydroxyl (of serine) pK value. Based on a series of kinetic experiment, a model mechanism of phosphodiesterase action by EcoRI endonuclease was suggested.
주제어
#Enzyme kinetics Restriction enzymes DNA 엔도뉴클레아제 효소 반응 속도론 효소
학위논문 정보
저자
Park, Hae-Joon
학위수여기관
한국과학기술원
학위구분
국내석사
학과
생물공학과
발행연도
1985
총페이지
52 p.
키워드
Enzyme kinetics Restriction enzymes DNA 엔도뉴클레아제 효소 반응 속도론 효소
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