식품에 관한 제반분야와 생리학적 응용성을 가지고 있는 E. colistrain B 의 $\beta$-D-galactosidase (E.C.3.2.1. 23) 을 분리하여 이 효소의 반응 기작에 관한 실험을 하고저 Anionexchange column chromatography 와 granulated hydroxyapatite column ...
식품에 관한 제반분야와 생리학적 응용성을 가지고 있는 E. colistrain B 의 $\beta$-D-galactosidase (E.C.3.2.1. 23) 을 분리하여 이 효소의 반응 기작에 관한 실험을 하고저 Anionexchange column chromatography 와 granulated hydroxyapatite column chromatography 에 의하여 부분적 정제를 시도 하였다. 정제결과의 사항을 그 일반적 성질과 더불어 일별하여 보면, o-nitrophenol-$\beta$-D-galactoside 를 기질로 할 때 15배의 비활성도 증가를 나타내었고, 최적 pH 6.8 - 7.2, 최적온도 $40\,^\circ\!C$, Km 값 $1.01 - 1.14 \times 10^{-3}M$ 의 결과를 보였고, Sulfhydryl 기의 변성제 및 2가의 금속이온 Chelate agent 에 의하여 저해효과를 나타내었다. 현재까지의 다른 보고들을 종합하여 효소 활성 부위의 imidazole 기와 sulfhydryl 기의 관련하에 galactose 의 $C_1-C_2$ epoxide 를 중간단계로 하는 효소반응의 가수분해 기작의 유형을 제시하였으며 이 유형에 대하여 보명제적, 간접적 실험으로써 Carboxylate 기가 galactose 의 $C_4-OH$ 에 대하여 Binding 에 관여하며 따라서 위의 유형에서와 같이 Catalysis 기능에 직접 참여하지 않는다는 가정하의 실험에서 pH 에 따른 반응속도론적 계수의 변화 이외에는 대체로 긍정적 결과를 나타내었다. 그 내용으로는 Carboxylate 기의 변성제로 보고된 hydroxylamine에 의하여 효소의 활성은 non-competitive 저해효과를 나타내며 그것으로 처리된 효소는 p-nitrophenol-$\beta$-Dglucoside 의 가수분해능력에는 처리전과 비교하여 큰 변화가 없다는 것과 처리된 효소의 o-nitrophenol-$\beta$-D-galactoside 가수분해 활성은 p-nitrophenol-$\beta$-D-galactoside 에 의하여 non-competitive 저해 효과를 나타낸다는 결과에서 그리고 이 효소는 $\beta$-D-glucoside 에 의하여 uncompetitive 저해효과를 나타낸다는 결과와 더불어 Carboxylate 기가 galactose 의 $C_4-OH$ 에 대한 binding 에 관련되고 이 관련은 $Mg^{++}$ ion 에 의한 그 저해 효과의 회복에서 Meganesium 이 보조역활을 한다고 유추 하였으며 이와같은 추정은 제시된 기능기 및 그 기능기와 expoxide 중간체의 기작을 지지한다고 보여진다. 위와같은 유형은 위에서 언급된 응용성에 대하여 뿐만아니라 효소단백질의 직접적인 산업적 응용에서 활성부위의 역활에 대한 정보를 제공할 수 있다는 대서 의의가 있다고 간주된다.
식품에 관한 제반분야와 생리학적 응용성을 가지고 있는 E. coli strain B 의 $\beta$-D-galactosidase (E.C.3.2.1. 23) 을 분리하여 이 효소의 반응 기작에 관한 실험을 하고저 Anionexchange column chromatography 와 granulated hydroxyapatite column chromatography 에 의하여 부분적 정제를 시도 하였다. 정제결과의 사항을 그 일반적 성질과 더불어 일별하여 보면, o-nitrophenol-$\beta$-D-galactoside 를 기질로 할 때 15배의 비활성도 증가를 나타내었고, 최적 pH 6.8 - 7.2, 최적온도 $40\,^\circ\!C$, Km 값 $1.01 - 1.14 \times 10^{-3}M$ 의 결과를 보였고, Sulfhydryl 기의 변성제 및 2가의 금속이온 Chelate agent 에 의하여 저해효과를 나타내었다. 현재까지의 다른 보고들을 종합하여 효소 활성 부위의 imidazole 기와 sulfhydryl 기의 관련하에 galactose 의 $C_1-C_2$ epoxide 를 중간단계로 하는 효소반응의 가수분해 기작의 유형을 제시하였으며 이 유형에 대하여 보명제적, 간접적 실험으로써 Carboxylate 기가 galactose 의 $C_4-OH$ 에 대하여 Binding 에 관여하며 따라서 위의 유형에서와 같이 Catalysis 기능에 직접 참여하지 않는다는 가정하의 실험에서 pH 에 따른 반응속도론적 계수의 변화 이외에는 대체로 긍정적 결과를 나타내었다. 그 내용으로는 Carboxylate 기의 변성제로 보고된 hydroxylamine에 의하여 효소의 활성은 non-competitive 저해효과를 나타내며 그것으로 처리된 효소는 p-nitrophenol-$\beta$-Dglucoside 의 가수분해능력에는 처리전과 비교하여 큰 변화가 없다는 것과 처리된 효소의 o-nitrophenol-$\beta$-D-galactoside 가수분해 활성은 p-nitrophenol-$\beta$-D-galactoside 에 의하여 non-competitive 저해 효과를 나타낸다는 결과에서 그리고 이 효소는 $\beta$-D-glucoside 에 의하여 uncompetitive 저해효과를 나타낸다는 결과와 더불어 Carboxylate 기가 galactose 의 $C_4-OH$ 에 대한 binding 에 관련되고 이 관련은 $Mg^{++}$ ion 에 의한 그 저해 효과의 회복에서 Meganesium 이 보조역활을 한다고 유추 하였으며 이와같은 추정은 제시된 기능기 및 그 기능기와 expoxide 중간체의 기작을 지지한다고 보여진다. 위와같은 유형은 위에서 언급된 응용성에 대하여 뿐만아니라 효소단백질의 직접적인 산업적 응용에서 활성부위의 역활에 대한 정보를 제공할 수 있다는 대서 의의가 있다고 간주된다.
$\beta$-D-Galactosidase (E.C.2.2.1.23) of E. coli strain B was partially purified and characterized for the further study of the enzymic reaction mechanism. The increase of the specific activity by the subsequent purification thru the granulated hydroxy-apatite column chromatography was 15 folds of ...
$\beta$-D-Galactosidase (E.C.2.2.1.23) of E. coli strain B was partially purified and characterized for the further study of the enzymic reaction mechanism. The increase of the specific activity by the subsequent purification thru the granulated hydroxy-apatite column chromatography was 15 folds of its crude fraction and it was shown that the general characteristics were in accord with the results of the other reports: catalytic specificity on some $\beta$-D-galactosides, and 6.8-7.2 as optimum $p^H$, 40$^\circ$C as the optimum temperature, 1.01 - 1.14mM for Km, inhibitory effects by the chelate agents such as ethylenediamine tetracetate and citrate and by para-chloromercuribenzoate and iodoacetamide known as the compounds modifying sulfhydryl groups. For the purpose of verifying the role of carboxylate group supposed to be in the active site, the results, of the treatment by hydroxylamine, the chemical reagent modifying carboxylate group in protein, demonstrated non-competitive inhibition caused by the irreversible modification of carboxylate group, the reduction of hydryxylamine-inhibitory effect by magnesium (II) ion seemed to be protective against the hydroxylamine action to the carboxylate group non-significant deviation of the hydrolytic activity of $\mbox{\underline{para}}$-nitrophenol- $\beta$ -D-glucoside ($C_4$ -epimer of the correspondent substrate)by the treatment in comparing before the treatment, and the non-competivity in the inhibition by para-nitrophenol-$\beta$-D-glucoside for the treated-enzymatic catalysis of orthonitrophenol-$\beta$-D-glucoside. By the above results with the uncompetitive inhibition by cellobiose for this native enzyme, it is postulated that the carboxylate group in the active site be involved in the binding with $C_4$-hydroxyl group of glycon of this enzyme substrate-$\beta$-D-galactoside. In conclusion, the above results of the indirect and bindingcharacteristical involvement of carboxylate group can be a powerful support for the model of mechanism of this enzyme catalysis to be $\mbox{\underline{via}}$ epoxide intermediate with C2-hydroxyl group participation, to be specific for C1-$\beta$-anomeric glycoside having correspondences with the imidazole and the sulfhydryl groups in the catalytic site with those above accordances of this enzyme properties in comparison to other $\mbox{\underline{E}}$ $\mbox{\underline{coli}}$ enzymes, and to be proper to the mechanismic models containing other substep procedures reported previously.
$\beta$-D-Galactosidase (E.C.2.2.1.23) of E. coli strain B was partially purified and characterized for the further study of the enzymic reaction mechanism. The increase of the specific activity by the subsequent purification thru the granulated hydroxy-apatite column chromatography was 15 folds of its crude fraction and it was shown that the general characteristics were in accord with the results of the other reports: catalytic specificity on some $\beta$-D-galactosides, and 6.8-7.2 as optimum $p^H$, 40$^\circ$C as the optimum temperature, 1.01 - 1.14mM for Km, inhibitory effects by the chelate agents such as ethylenediamine tetracetate and citrate and by para-chloromercuribenzoate and iodoacetamide known as the compounds modifying sulfhydryl groups. For the purpose of verifying the role of carboxylate group supposed to be in the active site, the results, of the treatment by hydroxylamine, the chemical reagent modifying carboxylate group in protein, demonstrated non-competitive inhibition caused by the irreversible modification of carboxylate group, the reduction of hydryxylamine-inhibitory effect by magnesium (II) ion seemed to be protective against the hydroxylamine action to the carboxylate group non-significant deviation of the hydrolytic activity of $\mbox{\underline{para}}$-nitrophenol- $\beta$ -D-glucoside ($C_4$ -epimer of the correspondent substrate)by the treatment in comparing before the treatment, and the non-competivity in the inhibition by para-nitrophenol-$\beta$-D-glucoside for the treated-enzymatic catalysis of orthonitrophenol-$\beta$-D-glucoside. By the above results with the uncompetitive inhibition by cellobiose for this native enzyme, it is postulated that the carboxylate group in the active site be involved in the binding with $C_4$-hydroxyl group of glycon of this enzyme substrate-$\beta$-D-galactoside. In conclusion, the above results of the indirect and bindingcharacteristical involvement of carboxylate group can be a powerful support for the model of mechanism of this enzyme catalysis to be $\mbox{\underline{via}}$ epoxide intermediate with C2-hydroxyl group participation, to be specific for C1-$\beta$-anomeric glycoside having correspondences with the imidazole and the sulfhydryl groups in the catalytic site with those above accordances of this enzyme properties in comparison to other $\mbox{\underline{E}}$ $\mbox{\underline{coli}}$ enzymes, and to be proper to the mechanismic models containing other substep procedures reported previously.
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