초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
유당분해효소를 생산하는 고온성 미생물을 ATCC로부터 구입한 10개의 균주, 일본 및 뉴질랜드의 화산지역에서 채취한 mud 및 물 시료로부터 분리하였다.
ATCC균주중 Thermus sp. IB-57 (ATCC4314), Thermus sp. IB21(ATCC43815), Thermus aquaticus AT-62(ATCC33923), Thermus aquaticus YT-1, Thermus auaticus HB8, Thermus filiformis wai

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
유당분해효소를 생산하는 고온성 미생물을 ATCC로부터 구입한 10개의 균주, 일본 및 뉴질랜드의 화산지역에서 채취한 mud 및 물 시료로부터 분리하였다.
ATCC균주중 Thermus sp. IB-57 (ATCC4314), Thermus sp. IB21(ATCC43815), Thermus aquaticus AT-62(ATCC33923), Thermus aquaticus YT-1, Thermus auaticus HB8, Thermus filiformis wai 33A1 등 6종을 선발하였다.
일본 및 뉴질랜드의 화산지역에서 채취한 시료로부터 유당분해효소를 생산하는 것으로 인정되는 colony를 29개 분리하였고 이들이 생산하는 조효소의 pH와 온도가 활성에 미치는 영향과 내열성에 근거하여 KNOUC104, KNOUC105, KNOUC110, KNOUC111, KNOUC112, KNOUC114, KNOUC202, KNOUC209 등 8균주를 선발하였다. KNOUC105는 Geobacillus로 동정되었고 그 외의 균주들은 모두 Thermus로서 생화학적 특성이 다른 상이한 미생물이었다. 이들을 Thermus sp. KNOUC104, Thermus sp. KNOUC105, Thermus sp. KNOUC110, Thermus sp. KNOUC111, Thermus sp. KNOUC112, Thermus sp. KNOUC114, Thermus sp. KNOUC202, Geobacillus sp. KNOUC105로 명명하였다.
선발된 균주의 chromosome을 분리하여 PCR과 chromosomal DNA의 부분분해 방법에 의해 유당분해효소 유전자를 분리하였다.
PCR법에 의해 Thermus sp. KNOUC112, Thermus sp. KNOUC114로부터 β
-galactosidase 유전자 (KNOUC112β-gal, KNOUC114β-gal)를 분리하였으며 각기 deoxyribonuleotide 1938쌍으로 구성되고 이들의 β-galactosidase는 645개의 아미노산으로 구성되고 분자량은 각기 72,896 dalton, 72784 dalton이다.
Chromosomal DNA의 부분분해에 의해 Geobacillus KNOUC105, Thermus sp. IB-21(ATCC43815)로부터 β-galactosidase 유전자 KNOUC105β-gal, tib5β-gal을 분리하였고 이들을 각기 2,019쌍의 deoxyribonucleotide, 1,938쌍의 deoxyribonucleotide로 구성되어 있으며 이들의 β-galactosidase는 각기 672개, 645개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자량은 78,048 dalton, 72,710 dalton이다.
Chromosomal DNA의 부분분해에 의해 Thermus sp. KNOUC202, Thermus filiformis wai. 33A1(ATCC43280), Thermus sp. AT-62(ATCC33923), Thermus sp. IB-21(ATCC43815)로부터 β-glycosidase 유전자 KNOUC202β-gly, tfiβ-gly, tatβ-gly, tib2β-gly를 분리하였다. KNOUC202β-gly는 1,176쌍의 deoxyribonucleotide로 구성되어 있으며 이유전자의β-glycosidase는 391개의 아미노산으로 구성되고 분자량은 41,880 dalton이다. tfiβ-gly는 1296쌍의 deoxyribonucleotide 1296쌍으로 구성되어 있고 이유전자의 β-glycosidase는 아미노산 431개로 구성되고 분자량은 48,679 dalton이다. tib2β-gly는 deoxyribonucleotide 1311쌍으로 구성되어 있으며 이유전자의 β-glycosidase는 분자량이 49,065 dalton이고, 436개의 아미노산으로 구성되어 있다.
분리한 유전자를 Pichia pastoris 혹은 E. Coli에 전이, 발현하여 유당분해효소를 생산하고 부분정제 혹은 정제후 온도 및 pH가 활성에 미치는 영향과 내열성을 조사하였다. KNOUC112β-gal은 Pichia pastoris에, tib5β-gal, tfiβ-gly, tatβ-gly 및 tib2β-gly는 E. Coli에 전이, 발현 후 정제하였고, KNOUC114β-gal, KNOUC105β-gal 및 KNOUC202β-gly는 E. Coli에 전이, 발현 후 부분정제하여 특성을 조사하였다. 이들 4종의 β-galactosidase와 4종의 β-glycosidase의 적정pH는 5.0∼7.0으로서 우유의 pH에서 모두 70%이상의 상당수준의 활성을 가지고 있으며, 적정온도는 70∼80℃이고, 60℃이상의 온도에서 매우 우수한 내열성을 가지고 있다.
KNOUC112β-gal의 활성자리 부근 11곳의 구조를 변화시켜 돌연변이 β
-galactosidase를 제조하여 특성의 개선을 시도했으나 성과가 없었다.
원유에 유당분해효소들을 ONPG활성으로 표준화된 양을 첨가하고 우유의 살균온돈인 63℃와 73℃에서 반응하여 원유유당분해정도를 조사하여 유당분해우유생산 실용성을 조사하였다. tfiβ-glyβ-glycosidase, tib2β-glyβ-glycosidase, tatβ-glyβ-glycosidase의 우유유당분해력이 KNOUC112β-galβ-galactosidase, KNOUC114β-galβ-galactosidase, KNOUC105β-galβ-galactosidase, tib5β-galβ-galactosidase, KNOUC202β-glyβ
-glycosidase들보다 매우 우수하였고 실용성이 있는 것으로 판단된다.
본 연구는 내열성 β-galactosidase를 목표로 하였으나 실험과정 중에 내열성 β
-glycosidase도 함께 분리, 생산하였고 β-glycosidase의 우유유당분해력이 획득한 β
-galactosidase보다 더 우수하였다.
2. 활용에 대한 건의
유당분해우유를 제조함에 있어 위생적 품질의 확보와 분해되지 않은 유당이 상당량 존재토록 하는 것에 유념해야 한다.
본 연구에서 획득한 tfiβ-glyβ-glycosidase, tib2β-glyβ-glycosidase, tatβ-glyβ-glycosidase 3종의 β-glycosidase의 원유유당 분해력이 우수하여 실용성이 있다. 이들 효소를 우유의 저온장시간 살균 (LTLT, 63℃ 30분)과정에서 반응시켜 원유유당의 40∼60%를 분해한 유당분해우유를 생산할 수 있다. 살균과 동시에 유당을 분해하기 때문에 처리공정이 단순하고 별도의 효소처리과정중에 야기되는 위생적 품질이 저하할 염려가 없으며, 우유의 유당을 부분적으로 분해함으로써 유당소화장애를 해결하여 우유소비를 배가하면서 분해되지 않은 유당에 의한 Ca흡수촉진 및 대장건강증진효과를 유지할 수 있을 것이다.
효소를 지지체에 고정화하므로서 효소를 장기간 반복사용하여 경비를 더욱 절감할 수 있으므로 유가공장에서 실용화할 때 고정하여 이용할 것을 권고한다. 유전자를 Pichia pastoris에 전이하므로써 좀 더 안정한 효소생산체계를 확보할 수 있을 것이다.
상기 3종의 β-glycosidase 유전자는 특허출원 중에 있다.

Abstract ▼

This study was performed to find thermostable enzymes hydrolysing lactose in milk during pasteurization to solve lactose intolerance. By hydrolysing lactose in milk during the process of pasteurization, lactose hydrolyzed milk of highly hygienic quality can be produced, and production cost can be cu

This study was performed to find thermostable enzymes hydrolysing lactose in milk during pasteurization to solve lactose intolerance. By hydrolysing lactose in milk during the process of pasteurization, lactose hydrolyzed milk of highly hygienic quality can be produced, and production cost can be cut down because additional process for lactose hydrolysis is not needed. We selected thermophilic microorganisms producing lactose hydrolyzing enzyme, isolated gene of those enzymes, cloned and expressed in Esherichia Coli or Pichia pastoris, purified those enzymes and characterized properties of those enzymes, tried to improve properties of a enzyme by site directed mutation of gene, and investigated hydrolysability of lactose in raw milk at pasteurization temperature of market milk.
We chose Thermophilic microorganisms as the source of thermostable lactose hydrolysing enzyme. Based on crude lactose hydrolyzing enzyme's properties on pH and temperature, eight thermophilic microorganisms were selected from water and mud sampled from volcanic regions of Japan and New Zealand, and 6 strains of Thermus sp. from ATCC to isolate the gene of lactose hydrolyzing enzyme. Seven microorganisms from volcanic region were identified as Thermus sp. and one as Geobacillus sp.
Genes of lactose hydrolyzing enzyme were isolated from those selected 14 microorganisms by PCR method and partial hydrolysis of chromosomal DNA, and could get four β-galactosidase genes and four β-glysosidase genes. Those genes of β-galactosidase were named as KNOUC112β-gal(isolated from Thermus sp. KNOUC112), KNOUC114β-gal(isolated from Thermus sp. KNOUC114), KNOUC105β-gal(from Geobacillus sp. KNOUC105) and tib5β-gal(isolated from Thermus sp. IB-21, ATCC43815). Those genes of β-glycosidases were named as tfiβ-gly(isolated from Thermus filiformis wai 33A1, ATCC 43280), tatβ-gly(isolated from Thermus flavus AT-62, ATCC 33923), tib2β-gly(isolated from Thermus sp. IB-21, ATCC 43815) and KNOUC202 β-gly(isolated from Thermus sp. KNOUC202).
KNOUC112β-gal is composed of 1938bp coding 645 amino acids and Mw of it's β-galactosidase is 72,896 dalton. KNOUC114β-gal is composed of 1938bp and Mw of its β-galactosidase composed by 645 amino acids is 72,784 dalton. The base pair's number of KNOUC105β-gal is 2016 coding 672 amino acids, and Mw of it's β-galactosidase is 78,048 dalton. tib5β-gal is composed of 1938 bp coding 645 amino acids and Mw of it's β-galactosidase is 72,710. tfiβ-gly is composed of 1296 bp coding 431 amino acids and it's β-glycosidase has Mw of 48,630 dalton. 1296 bp is composing tatβ-gly coding 431 amino acids of β-glycosidase, and Mw of it's β-glycosidase is 48,679. tib2β-gly is composed of 1311 bp coding 436 amino acids and it's β-glycosidase has Mw of 49,065 dalton. KNOUC202β-gly is made of 1176 bp coding 391 amino acids and Mw of it's β-glycosidase is 41880 dalton.
Those β-galactosidase genes and β-glycosidase genes were introduced into Esherichia coli or Pichia pastoris cloned and expressed. Two β-galactosidases and three β-glycosidases were purified, and 2 β-galactosidases and one β-glycosidase were partially purified. They showed optimum pH of 5.0 - 7.0, and at the pH of raw milk they have good activity. Their optimum temperature were 70 - 80 ℃, and at pasteurization temperature of 63℃ and 73℃ they showed good activity. They were stable at those two pasteurization temperatures.
KNOUC112β-gal was site directed mutated at eleven position around active site to improve optimum pH, optimum temperature and thermostability, but we could not find any change on those properties.
Those enzymes' hydrolysability of lactose in raw milk at 63℃ and 73℃ were investigated. β-glycosidases of tfiβ-gly, tib2β-gly and tatβ-gly hydrolyzed lactose well, especially at 63℃ they showed practicality by hydrolyzing 40 - 60 % of lactose in raw milk for 30 min. There have to be certain amount of unhydrolyzed lactose in lactose hydrolyzed milk because lactose enhances the absorbtion of Ca and the health of large intestine.
It is recommended to produce lactose hydrolyzed milk by hydrolyzing 40 - 60 % of lactose in raw milk by β-glycosidase of tfiβ-gly, tib2β-gly or tatβ-gly during pasteurization of LTLT. The lactose hysrolyzed milk will have good hygienic quality, will let lactose intolerant persons drink much more milk without lactose intolerant symptom, will still keep the value of lactose enhancing absorbtion of Ca and health of large intestine, and there is no additional facility and time for hydrolysis of lactose.
At the beginning of this research we aimed to get thermostable β-galactosidase good for practical use, but we abtained β-glycosidases better than β-galactosidase.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• Summary ... 8
• Contents ... 10
• 목 차 ... 13
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 16
• 제 1 절 목적 ... 16
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 16
• 제 2 장 관련기술의 현황과 문제점 ... 19
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
• 제 1 절 내열성 유당분해효소 생산 미생물의 선발 ... 20
• 1. 서론 ... 20
• 2. 재료 및 방법 ... 20
• 1) 미생물의 확보 ... 20
• 2) 미생물 동정 ... 23
• 3) β-galactosidase 특성 조사 ... 23
• 3. 결과 및 고찰 ... 24
• 1) 미생물 선발 ... 24
• 2) 선발미생물 동정 ... 31
• 제 2 절 내열성 유당분해효소 유전자의 분리 ... 40
• 1. 서론 ... 40
• 2. 재료 및 방법 ... 40
• 1) 유전자의 분리 ... 40
• 2) 유전자의 DNA sequencing ... 43
• 3. 결과 및 고찰 ... 43
• 1) β-galactosidase ... 43
• 2) β-glycosidase ... 51
• 제 3 절 β-galactosidase 유전자의 Pichia pastoris에 전이 및 발현 ... 64
• 1. 서론 ... 64
• 2. 재료 및 방법 ... 64
• 1) Pichia pastoris 전이 및 발현 ... 64
• 2) β-galactosidase 생산최적화 ... 65
• 3. 결과 및 고찰 ... 65
• 1) β-galactosidase 유전자의 Pichia pastoris로 전이 ... 65
• 2) β-galactosidase 유전자의 Pichia pastoris에서의 발현 ... 67
• 3) Pichia pastoris X-33에서의 β-galactosidase 생산 적정화 ... 67
• 제 4 절 내열성 유당분해효소 특성 ... 74
• 1. 서론 ... 74
• 2. 재료 및 방법 ... 74
• 1) 정제 ... 74
• 2) 특성조사 ... 76
• 3. 결과 및 고찰 ... 76
• 1) β-galactosidase ... 76
• 2) β-glycosidase ... 86
• 제 5 절 β-galactosidase 돌연변이 ... 96
• 1. 서론 ... 96
• 2. 재료 및 방법 ... 96
• 1) 돌연변이 위치 ... 96
• 2) 돌연변이 유전자제조 ... 96
• 3) 돌연변이유전자의 발현 ... 98
• 4) 돌연변이 β-galactosidase 특성 조사 ... 99
• 3. 결과 및 고찰 ... 99
• 제 6 절 유당분해효소의 유당분해 ... 104
• 1. 서론 ... 104
• 2. 재료 및 방법 ... 104
• 1) 유당분해효소 ... 104
• 2) 유당분해력 조사 ... 105
• 3. 결과 및 고찰 ... 105
• 1) β-galactosidase ... 105
• 2) β-glycosidase ... 111
• 제 7 절 유당분해시유 생산체계 ... 116
• 1. 유당분해효소의 선발 ... 116
• 2. 유당분해효소의 생산 ... 117
• 3. 유당분해시유 생산체계 ... 117
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 120
• 제 1 절 연도별 연구목표 및 달성도 ... 120
• 제 2 절 관련분야에의 기여 ... 125
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 126
• 제 1 절 활용계획 ... 126
• 제 2 절 추가연구의 필요성 ... 126
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 127
• 제 7 장 참 고 문 헌 ... 128
• 끝페이지 ... 132