기존의 프로모터 시스템에서는 induction을 위해서 tryptophan starvation이나 IPTG와 같이 다른 물질을 첨가해 주어야 하는 경우가 대부분이었다. 그러나 산소 의존형 프로모터를 사용할 경우, DO를 낮추어 주는 간단한 조작을 통한 경제적인 induction 이 가능하다. Bacillus subtilis 내에서의 산소 의존형 hmp 프로모터를 이용한 재조합 단백질의 효율적인 생산 방법과 대량 생산의 가능성을 알아보기 위하여, 다양한 조건에서의 cell 성장과 beta-galactosidase 의 발현을 살펴 보았다. 혐기 조건에서 생성되는 nitrate reductase 가 첨가하여 준 nitrate를 nitrite로 환원시키며, 이렇게 만들어진 nitrite 가 hmp 프로모터를 induction 하는 물질로 사용된다. 본 연구에서는 Bacillus subtilis의 chromosomal DNA에 삽입된 lacZ 유전자로부터 발현되는 $\beta$-galactosidase의 활성도를 측정하여 이 시스템의 유도 발현 특성을 살펴보았다. 배지를 선택하기 위한 실험에서, 다양한 배지에 대하여 글루코오스의 농도를 변화시켜 보았을 때, 2YT 배지에 초기 1%의 글루코오스를 첨가한 경우 미생물의 성장과 발현이 가장 양호하였다. 또한 pH의 값이 7.0보다 낮아질 경우, 발현을 크게 저해할 수 있으므로, 이를 조절하여 값을 유지하도록 하였다. 다음으로 산소의 농도를 변화시키면서 실험 하였을 때, 완전 혐기성 조건에서 발현은 최대 수준으로 나타났지만, 미생물의 성장이 매우 미약하였고, 반대로 산소 농도가 높아지면, 미생물의 성장은 향상되나, 발현이 크게 감소하는 현상이 나타났다. 그러므로 산소 농도를 1-2%정도로 유지하여 줌으로써 미생물의 성장을 완전 혐기성 조건보다 향상시키면서, 최대 수준의 발현을 유도할 수 있었다. 그러나 앞의 실험 조건을 이용한 fed-batch 실험에서, 발현이 최대값에 도달한 이후 급격하게 감소하는 경향을 나타내었고, cell의 성장도 일정 수준이 되면 더 이상 일어나지 않는 현상이 발견되었다. 이 경우 acetic acid는 3 g/L 이하로 축적되어 미생물의 성장을 크게 저해할 정도의 수준이 아니므로, 여러 가지 실험을 통하여 원인을 확인하여 보았다. 그 결과, 이러한 현상이 nitrate 가 환원되어 생성된 nitrite의 농도와 밀접한 연관이 있다는 사실을 확인하였다. 그러므로 hmp 프로모터 시스템을 이용한 고농도 배양 및 다량의 ...
기존의 프로모터 시스템에서는 induction을 위해서 tryptophan starvation이나 IPTG와 같이 다른 물질을 첨가해 주어야 하는 경우가 대부분이었다. 그러나 산소 의존형 프로모터를 사용할 경우, DO를 낮추어 주는 간단한 조작을 통한 경제적인 induction 이 가능하다. Bacillus subtilis 내에서의 산소 의존형 hmp 프로모터를 이용한 재조합 단백질의 효율적인 생산 방법과 대량 생산의 가능성을 알아보기 위하여, 다양한 조건에서의 cell 성장과 beta-galactosidase 의 발현을 살펴 보았다. 혐기 조건에서 생성되는 nitrate reductase 가 첨가하여 준 nitrate를 nitrite로 환원시키며, 이렇게 만들어진 nitrite 가 hmp 프로모터를 induction 하는 물질로 사용된다. 본 연구에서는 Bacillus subtilis의 chromosomal DNA에 삽입된 lacZ 유전자로부터 발현되는 $\beta$-galactosidase의 활성도를 측정하여 이 시스템의 유도 발현 특성을 살펴보았다. 배지를 선택하기 위한 실험에서, 다양한 배지에 대하여 글루코오스의 농도를 변화시켜 보았을 때, 2YT 배지에 초기 1%의 글루코오스를 첨가한 경우 미생물의 성장과 발현이 가장 양호하였다. 또한 pH의 값이 7.0보다 낮아질 경우, 발현을 크게 저해할 수 있으므로, 이를 조절하여 값을 유지하도록 하였다. 다음으로 산소의 농도를 변화시키면서 실험 하였을 때, 완전 혐기성 조건에서 발현은 최대 수준으로 나타났지만, 미생물의 성장이 매우 미약하였고, 반대로 산소 농도가 높아지면, 미생물의 성장은 향상되나, 발현이 크게 감소하는 현상이 나타났다. 그러므로 산소 농도를 1-2%정도로 유지하여 줌으로써 미생물의 성장을 완전 혐기성 조건보다 향상시키면서, 최대 수준의 발현을 유도할 수 있었다. 그러나 앞의 실험 조건을 이용한 fed-batch 실험에서, 발현이 최대값에 도달한 이후 급격하게 감소하는 경향을 나타내었고, cell의 성장도 일정 수준이 되면 더 이상 일어나지 않는 현상이 발견되었다. 이 경우 acetic acid는 3 g/L 이하로 축적되어 미생물의 성장을 크게 저해할 정도의 수준이 아니므로, 여러 가지 실험을 통하여 원인을 확인하여 보았다. 그 결과, 이러한 현상이 nitrate 가 환원되어 생성된 nitrite의 농도와 밀접한 연관이 있다는 사실을 확인하였다. 그러므로 hmp 프로모터 시스템을 이용한 고농도 배양 및 다량의 protein 생산을 위해, 이 실험의 결과로 얻어진 데이터를 기반으로 한 nitrite 농도의 조절이 필요할 것이다.
기존의 프로모터 시스템에서는 induction을 위해서 tryptophan starvation이나 IPTG와 같이 다른 물질을 첨가해 주어야 하는 경우가 대부분이었다. 그러나 산소 의존형 프로모터를 사용할 경우, DO를 낮추어 주는 간단한 조작을 통한 경제적인 induction 이 가능하다. Bacillus subtilis 내에서의 산소 의존형 hmp 프로모터를 이용한 재조합 단백질의 효율적인 생산 방법과 대량 생산의 가능성을 알아보기 위하여, 다양한 조건에서의 cell 성장과 beta-galactosidase 의 발현을 살펴 보았다. 혐기 조건에서 생성되는 nitrate reductase 가 첨가하여 준 nitrate를 nitrite로 환원시키며, 이렇게 만들어진 nitrite 가 hmp 프로모터를 induction 하는 물질로 사용된다. 본 연구에서는 Bacillus subtilis의 chromosomal DNA에 삽입된 lacZ 유전자로부터 발현되는 $\beta$-galactosidase의 활성도를 측정하여 이 시스템의 유도 발현 특성을 살펴보았다. 배지를 선택하기 위한 실험에서, 다양한 배지에 대하여 글루코오스의 농도를 변화시켜 보았을 때, 2YT 배지에 초기 1%의 글루코오스를 첨가한 경우 미생물의 성장과 발현이 가장 양호하였다. 또한 pH의 값이 7.0보다 낮아질 경우, 발현을 크게 저해할 수 있으므로, 이를 조절하여 값을 유지하도록 하였다. 다음으로 산소의 농도를 변화시키면서 실험 하였을 때, 완전 혐기성 조건에서 발현은 최대 수준으로 나타났지만, 미생물의 성장이 매우 미약하였고, 반대로 산소 농도가 높아지면, 미생물의 성장은 향상되나, 발현이 크게 감소하는 현상이 나타났다. 그러므로 산소 농도를 1-2%정도로 유지하여 줌으로써 미생물의 성장을 완전 혐기성 조건보다 향상시키면서, 최대 수준의 발현을 유도할 수 있었다. 그러나 앞의 실험 조건을 이용한 fed-batch 실험에서, 발현이 최대값에 도달한 이후 급격하게 감소하는 경향을 나타내었고, cell의 성장도 일정 수준이 되면 더 이상 일어나지 않는 현상이 발견되었다. 이 경우 acetic acid는 3 g/L 이하로 축적되어 미생물의 성장을 크게 저해할 정도의 수준이 아니므로, 여러 가지 실험을 통하여 원인을 확인하여 보았다. 그 결과, 이러한 현상이 nitrate 가 환원되어 생성된 nitrite의 농도와 밀접한 연관이 있다는 사실을 확인하였다. 그러므로 hmp 프로모터 시스템을 이용한 고농도 배양 및 다량의 protein 생산을 위해, 이 실험의 결과로 얻어진 데이터를 기반으로 한 nitrite 농도의 조절이 필요할 것이다.
A gene, hmp, which encodes a ubiquitous protein homologous to hemoglobin was isolated among genes from Bacillus subtilis that are induced under anaerobic conditions. The expression of hmp is strongly induced upon oxygen limitation, and the induction is dependent on a two-component regulatory pair, R...
A gene, hmp, which encodes a ubiquitous protein homologous to hemoglobin was isolated among genes from Bacillus subtilis that are induced under anaerobic conditions. The expression of hmp is strongly induced upon oxygen limitation, and the induction is dependent on a two-component regulatory pair, ResD and ResE, an anaerobic regulator, FNR, and respiratory nitrate reductase, NarGHJI. The objective of this study is to find the optimal Culture system of the hmp promoter to obtain high level of recombinant protein, and characterize the hmp promoter system to test whether this promoter can be used as inducible promoter. To find the culture conditions for Bacillus subtilis LAB1886, effects of cell density, glucose concentration, pH, DO level and nitrate, nitrite concentration on the cell growth and the expression of $\beta$-galactosidase were studied. From the experiments, the optimal cultivation strategy was found to grow cells in the presence of nitrate to $OD_{600}$ = 0.2 at high DO level (80%), and then to induce the hmp promoter by lowering the DO level to 1-2% with alternating microaerobic and aerobic conditions. Under these conditions, the maximum specific beta-galactosidase activity increased continuously to the maximal value of 1750 Miller units at $OD_{600}$ = 2.5. The best growth medium for culture of B. subtilis LAB1886 among LB, 2YT, and modified R media was 2YT. To maximize induction of the hmp promoter, it was necessary to lower DO levels during induction. In microaerobic condition (DO =1-2%), the expression level of beta-galactosidase was as high as the expression level of beta-galactosidase in completely anaerobic condition. And the cell growth was enhanced in microaerobic condition. In these experiments, accumulation of acetic acid could be kept below 3 g/L. Therefore, acetic acid produced during cultivation might not be a serious problem in this case. However, both of fed-batch and batch cultivation, after the specific beta-galactosidase activity reached to the maximal value, it decreased sharply, and the cell growth represented very low level. To find the reason for these results, effect of nitrite concentration was studied. From the experiments, it was showed that nitrite concentration could affect the expression of beta-galactosidase and the cell growth. When nitrite concentration reached about to 1g/L, the specific beta-galactosidase activity started to decrease, and it reached over to 1.5 g/L, the cell growth was seriously inhibited. Therefore, nitriteconcentration must be controlled to enhance the cell growth and the expression of $\beta$-galactosidase in B. subtilis LAB1886.
A gene, hmp, which encodes a ubiquitous protein homologous to hemoglobin was isolated among genes from Bacillus subtilis that are induced under anaerobic conditions. The expression of hmp is strongly induced upon oxygen limitation, and the induction is dependent on a two-component regulatory pair, ResD and ResE, an anaerobic regulator, FNR, and respiratory nitrate reductase, NarGHJI. The objective of this study is to find the optimal Culture system of the hmp promoter to obtain high level of recombinant protein, and characterize the hmp promoter system to test whether this promoter can be used as inducible promoter. To find the culture conditions for Bacillus subtilis LAB1886, effects of cell density, glucose concentration, pH, DO level and nitrate, nitrite concentration on the cell growth and the expression of $\beta$-galactosidase were studied. From the experiments, the optimal cultivation strategy was found to grow cells in the presence of nitrate to $OD_{600}$ = 0.2 at high DO level (80%), and then to induce the hmp promoter by lowering the DO level to 1-2% with alternating microaerobic and aerobic conditions. Under these conditions, the maximum specific beta-galactosidase activity increased continuously to the maximal value of 1750 Miller units at $OD_{600}$ = 2.5. The best growth medium for culture of B. subtilis LAB1886 among LB, 2YT, and modified R media was 2YT. To maximize induction of the hmp promoter, it was necessary to lower DO levels during induction. In microaerobic condition (DO =1-2%), the expression level of beta-galactosidase was as high as the expression level of beta-galactosidase in completely anaerobic condition. And the cell growth was enhanced in microaerobic condition. In these experiments, accumulation of acetic acid could be kept below 3 g/L. Therefore, acetic acid produced during cultivation might not be a serious problem in this case. However, both of fed-batch and batch cultivation, after the specific beta-galactosidase activity reached to the maximal value, it decreased sharply, and the cell growth represented very low level. To find the reason for these results, effect of nitrite concentration was studied. From the experiments, it was showed that nitrite concentration could affect the expression of beta-galactosidase and the cell growth. When nitrite concentration reached about to 1g/L, the specific beta-galactosidase activity started to decrease, and it reached over to 1.5 g/L, the cell growth was seriously inhibited. Therefore, nitriteconcentration must be controlled to enhance the cell growth and the expression of $\beta$-galactosidase in B. subtilis LAB1886.
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