호열성 박테리아인 Thermus caldophilus GK24 (Tca)에 있는 해당과정의 in vitro 효소연구를 위해서 유전체 분석이 이루어졌으며 여러가지 해당과정 관련 유전자들이 결정되었다. 생체에 에너지 획득에 필수적인 이러한 유전자들은 선택적으로 대장균에 클로닝 및 발현시켰으며, 간단한 열처리와 칼럼통과에 의해서 효율적으로 정제되였다. 13C를 표지한 포도당 균체성장 연구에 의해, 이 호열성 균주의 주요한 ...
호열성 박테리아인 Thermus caldophilus GK24 (Tca)에 있는 해당과정의 in vitro 효소연구를 위해서 유전체 분석이 이루어졌으며 여러가지 해당과정 관련 유전자들이 결정되었다. 생체에 에너지 획득에 필수적인 이러한 유전자들은 선택적으로 대장균에 클로닝 및 발현시켰으며, 간단한 열처리와 칼럼통과에 의해서 효율적으로 정제되였다. 13C를 표지한 포도당 균체성장 연구에 의해, 이 호열성 균주의 주요한 대사경로는 Entner-Doudoroff 경로가 아닌 Embden-Meyerhof (EM) 경로로 판명되었으며 L-alanine을 세포외로 생산한다. 또한, 포도당은 carotenoid 계열의 주황색 색소를 유도하는 것으로 여겨지며, 여러 금속이온들은 포도당의 세포내 유입에 필수적인 역할을 한다. 초기 해당과정효소들 (hexokinase, phosphohexose isomerase, phosphofructokinase)의 in vitro 반응에서 다양한 단당류들이 (glucose, mannose, glucosamine, fructose) 액상 이온 크로마토그래피를 통해 해당과정의 기질로서 이용되는 것이 분석되었다. 그러나, 모든 기질들은 위의 대사경로를 통해 fructose-1,6-bisphosphate로 전환되는 특징을 보인다. 여기서phosphohexose isomerse는 glucose-6-phosphate와 mannose-6-phosphate와 같은 2가지 기질에 대한 활성뿐만 아니라 hexokinase, ATP 및 Mg2+의 존재하에서 glucosamine-6-phosphate deaminase 기능을 수행한다는 것을 처음으로 밝혀내었다. 또 다른 중요한 효소로서, class II fructose-1,6-bisphosphate aldolase는 부분입체이성질체인 fructose-1,6-bisphosphate와 tagatose-1,6-bisphosphate를 둘다 합성하는 특성을 지닌다. 이러한 현상은 지금까지 자연에서 발견된 유일한 fructose-1,6-bisphosphate aldolase로 호열성 미생물 효소의 중요한 산업적 가치를 나타낸다. 그리고, C3 기질들의 농도와 triosephosphate isomerase의 첨가에 의해 C6 생성물 비율의 조절이 가능하였다. Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase는 모든 해당과정 효소들 중에서 가장 낮은 활성을 지닌 효소로서 phosphatase 기능을 수행하므로써 phosphate가 없는 조건에서도 낮은 활성으로 glyceraldehyde-3-phosphate에서 3-phosphoglycerate로 합성이 가능하다. 그러나, 이효소와 그 기질들은 전체 해당과정효소반응속도를 낮추는 결정적인 요인이다. 정리하면, in vitro 해당과정 효소반응연구를 통해서 복잡한 in vivo 당대사를 이해할 수 있는 실질적인 대사모델이 확립되었고 산업적으로 중요한 화합물의 효소합성에 중요한 기여를 할 것으로 기대된다.
호열성 박테리아인 Thermus caldophilus GK24 (Tca)에 있는 해당과정의 in vitro 효소연구를 위해서 유전체 분석이 이루어졌으며 여러가지 해당과정 관련 유전자들이 결정되었다. 생체에 에너지 획득에 필수적인 이러한 유전자들은 선택적으로 대장균에 클로닝 및 발현시켰으며, 간단한 열처리와 칼럼통과에 의해서 효율적으로 정제되였다. 13C를 표지한 포도당 균체성장 연구에 의해, 이 호열성 균주의 주요한 대사경로는 Entner-Doudoroff 경로가 아닌 Embden-Meyerhof (EM) 경로로 판명되었으며 L-alanine을 세포외로 생산한다. 또한, 포도당은 carotenoid 계열의 주황색 색소를 유도하는 것으로 여겨지며, 여러 금속이온들은 포도당의 세포내 유입에 필수적인 역할을 한다. 초기 해당과정효소들 (hexokinase, phosphohexose isomerase, phosphofructokinase)의 in vitro 반응에서 다양한 단당류들이 (glucose, mannose, glucosamine, fructose) 액상 이온 크로마토그래피를 통해 해당과정의 기질로서 이용되는 것이 분석되었다. 그러나, 모든 기질들은 위의 대사경로를 통해 fructose-1,6-bisphosphate로 전환되는 특징을 보인다. 여기서phosphohexose isomerse는 glucose-6-phosphate와 mannose-6-phosphate와 같은 2가지 기질에 대한 활성뿐만 아니라 hexokinase, ATP 및 Mg2+의 존재하에서 glucosamine-6-phosphate deaminase 기능을 수행한다는 것을 처음으로 밝혀내었다. 또 다른 중요한 효소로서, class II fructose-1,6-bisphosphate aldolase는 부분입체이성질체인 fructose-1,6-bisphosphate와 tagatose-1,6-bisphosphate를 둘다 합성하는 특성을 지닌다. 이러한 현상은 지금까지 자연에서 발견된 유일한 fructose-1,6-bisphosphate aldolase로 호열성 미생물 효소의 중요한 산업적 가치를 나타낸다. 그리고, C3 기질들의 농도와 triosephosphate isomerase의 첨가에 의해 C6 생성물 비율의 조절이 가능하였다. Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase는 모든 해당과정 효소들 중에서 가장 낮은 활성을 지닌 효소로서 phosphatase 기능을 수행하므로써 phosphate가 없는 조건에서도 낮은 활성으로 glyceraldehyde-3-phosphate에서 3-phosphoglycerate로 합성이 가능하다. 그러나, 이효소와 그 기질들은 전체 해당과정효소반응속도를 낮추는 결정적인 요인이다. 정리하면, in vitro 해당과정 효소반응연구를 통해서 복잡한 in vivo 당대사를 이해할 수 있는 실질적인 대사모델이 확립되었고 산업적으로 중요한 화합물의 효소합성에 중요한 기여를 할 것으로 기대된다.
As a part of the genome studies of a thermophilic aerobic bacterium, Thermus caldophilus GK24 (Tca), the genome sequencing is partially completed by the shot-gun sequencing method. The essential glycolysis-derived genes are identified from the genome sequences for in vitro enzymatic study on glycoly...
As a part of the genome studies of a thermophilic aerobic bacterium, Thermus caldophilus GK24 (Tca), the genome sequencing is partially completed by the shot-gun sequencing method. The essential glycolysis-derived genes are identified from the genome sequences for in vitro enzymatic study on glycolytic pathway, and selectively cloned, overexpressed, and purified to a homogeneity over 95% in Escherichia coli. The 13C-isotope experiments indicated that the Embden-Meyer (EM) pathway, rather than the Entner-Doudoroff pathway, was a central route for the glucose metabolism in T. caldophilus. The Tca growth studies showed that metal ions were absolutely required for the glucose influx, and that glucose induces the orange-red pigmentation. Based on the in vitro experiments of sugar metabolism, I functionally characterized the 10 glycolytic enzymes in the EM pathway and -glucan-phosphorylase. The in vitro Tca (hexokinase, phosphohexose isomerase, phosphofructokinase) coupled reactions showed that various sugars (glucose, mannose, glucosamine, and fructose) were effectively converted to fructose-1,6-bisphosphate as a single product, while other sugars did not. Such a facile and flexible utility of the enzymes by the initial EM pathway might give T. caldophilus a high adaptability toward diverse sugars, but show a low threshold of the sugar metabolic influx into FBP. I strikingly found that the bifunctional phosphohexose isomerse has phosphoglucose/phosphomannose although it is constituted in PGI family, moreover, and glucosamine-6-phosphate deaminase activity is exhibited in the presence of hexosekinae, ATP and Mg2+. In addition, I found that the thermostable fructose-1,6-bisphosphate aldolase has dual stereospecificity for the synthesis of (3S,4R)-fructose-1,6-bisphosphate and (3S,4S)-tagatose-1,6-bisphosphate for the first time. By these in vitro EM pathway studies, it is evident that sugar catabolism in T. caldophilus proceeds via novel pathways that are significantly different from the established EM pathways. The themophilic glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase with the lowest Vmax value is mildly oxidized and has phosphatase activity. It is probably suggested that the enzyme is an critical bottleneck in glycolytic flux in vitro. As a result, the practical glycolytic model system suggests that the pathway has the complexity of the sugar metabolism and major breakthroughs are still remained concerning the details of its regulation and its bioenergetics.
As a part of the genome studies of a thermophilic aerobic bacterium, Thermus caldophilus GK24 (Tca), the genome sequencing is partially completed by the shot-gun sequencing method. The essential glycolysis-derived genes are identified from the genome sequences for in vitro enzymatic study on glycolytic pathway, and selectively cloned, overexpressed, and purified to a homogeneity over 95% in Escherichia coli. The 13C-isotope experiments indicated that the Embden-Meyer (EM) pathway, rather than the Entner-Doudoroff pathway, was a central route for the glucose metabolism in T. caldophilus. The Tca growth studies showed that metal ions were absolutely required for the glucose influx, and that glucose induces the orange-red pigmentation. Based on the in vitro experiments of sugar metabolism, I functionally characterized the 10 glycolytic enzymes in the EM pathway and -glucan-phosphorylase. The in vitro Tca (hexokinase, phosphohexose isomerase, phosphofructokinase) coupled reactions showed that various sugars (glucose, mannose, glucosamine, and fructose) were effectively converted to fructose-1,6-bisphosphate as a single product, while other sugars did not. Such a facile and flexible utility of the enzymes by the initial EM pathway might give T. caldophilus a high adaptability toward diverse sugars, but show a low threshold of the sugar metabolic influx into FBP. I strikingly found that the bifunctional phosphohexose isomerse has phosphoglucose/phosphomannose although it is constituted in PGI family, moreover, and glucosamine-6-phosphate deaminase activity is exhibited in the presence of hexosekinae, ATP and Mg2+. In addition, I found that the thermostable fructose-1,6-bisphosphate aldolase has dual stereospecificity for the synthesis of (3S,4R)-fructose-1,6-bisphosphate and (3S,4S)-tagatose-1,6-bisphosphate for the first time. By these in vitro EM pathway studies, it is evident that sugar catabolism in T. caldophilus proceeds via novel pathways that are significantly different from the established EM pathways. The themophilic glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase with the lowest Vmax value is mildly oxidized and has phosphatase activity. It is probably suggested that the enzyme is an critical bottleneck in glycolytic flux in vitro. As a result, the practical glycolytic model system suggests that the pathway has the complexity of the sugar metabolism and major breakthroughs are still remained concerning the details of its regulation and its bioenergetics.
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