과산화물에 의한 Peroxiredoxins (Prxs)의 가역적 과산화상태는 Prx-SH로 환원될 수 있는 Prx-SO₂H로 알려져 있다. 하지만 지금까지 과산화된 Prxs의 다른 형태에 대한 체계적인 연구는 되어있지 않다. 과산화된 Tsa1p (효모 Prx)를 Tsa1p-CP-SO₃H 항체를 가지고 확인해 본 결과, 나는 효모세포에 처리된 과산화수소 농도에 의존적으로 반응성의 차이가 나타남을 확인하였다. Srx 1의 재환원능력을 기초하여 나는 Tsa1p가 가역적 그리고 비가역적으로 과산화됨을 확인하였다. 전자분무법에 의한 ...
과산화물에 의한 Peroxiredoxins (Prxs)의 가역적 과산화상태는 Prx-SH로 환원될 수 있는 Prx-SO₂H로 알려져 있다. 하지만 지금까지 과산화된 Prxs의 다른 형태에 대한 체계적인 연구는 되어있지 않다. 과산화된 Tsa1p (효모 Prx)를 Tsa1p-CP-SO₃H 항체를 가지고 확인해 본 결과, 나는 효모세포에 처리된 과산화수소 농도에 의존적으로 반응성의 차이가 나타남을 확인하였다. Srx 1의 재환원능력을 기초하여 나는 Tsa1p가 가역적 그리고 비가역적으로 과산화됨을 확인하였다. 전자분무법에 의한 질량분석에 의해 비가역적으로 과산화된 Tsa1p는 Tsa1p-SO₃H임을 확인하였다. Tsa1p-SO₃H는 Tsa1p-SO₂H로부터 자가산화에 의해 생겨나는 생산물이 아니었고, 과산화수소로부터 회복된 효모세포가 두 번의 배가주기까지도 세포내에 남아있었다. Tsa1p-SO₃H는 균질적인 링모양의 구조로 자가결합된 높은 분자량을 갖는 복합체를 형성할 뿐만 아니라 Tsa1p-SH보다 약 4배정도 높은 샤페론 활성을 나타내었다. 추가적으로 효모세포에서 과산화수소에 반응하여 Tsa1p는 티오레독신 시스템이 있는 상태에서 생체외 페록시데이즈 분석조건에서보다 빠르게 Tsa1p-SO₃H로 과산화되었다. 본 연구에서 나는 다양한 레독스 상태의 Tsa1p중에서 Tsa1p-SO₃H가 가장 높은 샤페론 활성을 나타내고 이러한 Tsa1p-SO₃H는 효모세포에서 산화적 스트레스의 표지자임을 제안한다. Srx/sestrin이 Prx-SO₂H를 Prx-SH로의 환원에 관여한다는 발견이후로 효모와 포유동물에서 Prx-SO₂H의 재환원 메커니즘이 보고되고 있다. 두 종사이에 재환원에 대한 약간의 차이가 있음에도 불구하고 설피닉 포스포릴 에스터, 티오설피네이트, 그리고 설페닉 산은 공통적으로 Prx-SO₂H의 재환원 과정의 중간산물로 여겨지고 있다. 그러나 Prx-SO₂H에 대한 Srx의 재환원 메커니즘은 아지고 논란이 되고 있다. Saccharomyces cerevisiae에서 나는 Srx 1에 의한 Tsa1p-SO₂H의 재환원 활성은 비환원 PAGE 겔상의 50 kDa Tsa1p를 통하여 완료됨을 관찰하였다. 50 kDa Tsa1p에 4-acetamido-4'-maleimidylstilbene-2,2'-disulfonic acid (AMS)의 알킬화와 50 kDa Tsa1p 띠의 환원 후 SDS-PAGE 분석은 50 kDa Tsa1p에 유리된 thiol 그룹은 존재하지 않으며 산화상태는 Tsa1p-SO₂H임을 확인하였다. 비환원 2D-PAGE 분석에 의해 50 kDa Tsa1p 두 개의 독립된 Tsa1p-SO₂H간의 두 개의 resolving 시스테인 잔기사이에 이황화결합을 이루고 있음을 확인하였다. 이러한 50 kDa Tsa1p band는 resolving 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환시킨 sulfinic form의 재환원 과정에서는 나타나지 않았다. 또한 50 kDa Tsa1p는 과산화수소로부터 회복된 효모 세포에서 Srx 1 단백질의 발현증가와 상관관계가 있었고 비균질적인 고분자 복합체로부터 저분자 복합체로의 구조변화를 야기하였다. 나는 50 kDa Tsa1p가 Srx 1에 의한 Tsa1p-SO₂H의 재환원 과정으로부터 생겨나는 또하나의 중간산물이라는 것과 이러한 형태의 Tsa1p는 Tsa1p-SO₂H의 재산화 과정을 이해하는데 중요한 중간 산물임을 제안한다.
과산화물에 의한 Peroxiredoxins (Prxs)의 가역적 과산화상태는 Prx-SH로 환원될 수 있는 Prx-SO₂H로 알려져 있다. 하지만 지금까지 과산화된 Prxs의 다른 형태에 대한 체계적인 연구는 되어있지 않다. 과산화된 Tsa1p (효모 Prx)를 Tsa1p-CP-SO₃H 항체를 가지고 확인해 본 결과, 나는 효모세포에 처리된 과산화수소 농도에 의존적으로 반응성의 차이가 나타남을 확인하였다. Srx 1의 재환원능력을 기초하여 나는 Tsa1p가 가역적 그리고 비가역적으로 과산화됨을 확인하였다. 전자분무법에 의한 질량분석에 의해 비가역적으로 과산화된 Tsa1p는 Tsa1p-SO₃H임을 확인하였다. Tsa1p-SO₃H는 Tsa1p-SO₂H로부터 자가산화에 의해 생겨나는 생산물이 아니었고, 과산화수소로부터 회복된 효모세포가 두 번의 배가주기까지도 세포내에 남아있었다. Tsa1p-SO₃H는 균질적인 링모양의 구조로 자가결합된 높은 분자량을 갖는 복합체를 형성할 뿐만 아니라 Tsa1p-SH보다 약 4배정도 높은 샤페론 활성을 나타내었다. 추가적으로 효모세포에서 과산화수소에 반응하여 Tsa1p는 티오레독신 시스템이 있는 상태에서 생체외 페록시데이즈 분석조건에서보다 빠르게 Tsa1p-SO₃H로 과산화되었다. 본 연구에서 나는 다양한 레독스 상태의 Tsa1p중에서 Tsa1p-SO₃H가 가장 높은 샤페론 활성을 나타내고 이러한 Tsa1p-SO₃H는 효모세포에서 산화적 스트레스의 표지자임을 제안한다. Srx/sestrin이 Prx-SO₂H를 Prx-SH로의 환원에 관여한다는 발견이후로 효모와 포유동물에서 Prx-SO₂H의 재환원 메커니즘이 보고되고 있다. 두 종사이에 재환원에 대한 약간의 차이가 있음에도 불구하고 설피닉 포스포릴 에스터, 티오설피네이트, 그리고 설페닉 산은 공통적으로 Prx-SO₂H의 재환원 과정의 중간산물로 여겨지고 있다. 그러나 Prx-SO₂H에 대한 Srx의 재환원 메커니즘은 아지고 논란이 되고 있다. Saccharomyces cerevisiae에서 나는 Srx 1에 의한 Tsa1p-SO₂H의 재환원 활성은 비환원 PAGE 겔상의 50 kDa Tsa1p를 통하여 완료됨을 관찰하였다. 50 kDa Tsa1p에 4-acetamido-4'-maleimidylstilbene-2,2'-disulfonic acid (AMS)의 알킬화와 50 kDa Tsa1p 띠의 환원 후 SDS-PAGE 분석은 50 kDa Tsa1p에 유리된 thiol 그룹은 존재하지 않으며 산화상태는 Tsa1p-SO₂H임을 확인하였다. 비환원 2D-PAGE 분석에 의해 50 kDa Tsa1p 두 개의 독립된 Tsa1p-SO₂H간의 두 개의 resolving 시스테인 잔기사이에 이황화결합을 이루고 있음을 확인하였다. 이러한 50 kDa Tsa1p band는 resolving 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환시킨 sulfinic form의 재환원 과정에서는 나타나지 않았다. 또한 50 kDa Tsa1p는 과산화수소로부터 회복된 효모 세포에서 Srx 1 단백질의 발현증가와 상관관계가 있었고 비균질적인 고분자 복합체로부터 저분자 복합체로의 구조변화를 야기하였다. 나는 50 kDa Tsa1p가 Srx 1에 의한 Tsa1p-SO₂H의 재환원 과정으로부터 생겨나는 또하나의 중간산물이라는 것과 이러한 형태의 Tsa1p는 Tsa1p-SO₂H의 재산화 과정을 이해하는데 중요한 중간 산물임을 제안한다.
Hyperoxidation state of peroxiredoxins (Prxs) by peroxides is known to be Prx-SO₂H, which is retroreducible to Prx-SH. However, no systematic study has been performed on other forms of hyperoxidized Prxs until now. Visualizing hyperoxidized Tsa1p (yeast peroxiredoxin) with anti-Tsa1p-SO₃H antiserum,...
Hyperoxidation state of peroxiredoxins (Prxs) by peroxides is known to be Prx-SO₂H, which is retroreducible to Prx-SH. However, no systematic study has been performed on other forms of hyperoxidized Prxs until now. Visualizing hyperoxidized Tsa1p (yeast peroxiredoxin) with anti-Tsa1p-SO₃H antiserum, I observed an obvious reactivity difference depending on the hydrogen peroxide concentrations to which yeast cells were exposed. On the basis of the retroreducing capacity of Srx 1, I identified two different types: reversibly and irreversibly hyperoxidized Tsa1p. Irreversibly hyperoxidized Tsa1p was determined to be Tsa1p-SO₃H by electrospray mass spectrometry. Tsa1p-SO₃H was not an autoxidation product from Tsa1p-SO₂H and was maintained in yeast cells at least two doubling cycles after recovery form H₂O₂ exposure. Tsa1p-SO₃H not only forms self-assembled high molecular weight complexes with homogeneously ring-shaped structure, but it also has about 4-fold higher chaperone activity than Tsa1p-SH. In addition, hyperoxidation to Tsa1p-SO₃H in response to H₂O₂ in yeast cells was significantly faster than in vitro hyper-oxidation in the presence of the thioredoxin system. In this study, I identified Tsa1p-SO₃H and its function as an effective and enduring molecular chaperone, and I also identified its function as a cellular marker that retains a cell's cumulative index of oxidative stresses. Since the discovery of Srx/sestrin, which catalyzes the reduction of Prx-SO₂H to -SH, several retroreduction mechanisms of Prx-SO₂H have been studiedon yeast and mammalian systems. Despite little difference on the retroreduction process of Prx-SO₂H between two species, sulfinic phosphoryl ester, thiosulfinate, and sulfenic acid have been considered in common as intermediates derived from the retroreduction process of Prx-SO₂H. However, retroreduction mechanism of Srx on Prx-SO₂H is still controvertial. In Saccharomyces cerevisiae, I observed that the reduction catalysis of Tsa1p-SO₂H by Srx 1 had been accomplished via a prominent 50 kDa Tsa1p band on non-reducing PAGE gel. The alkylation with 4-acetamido-4'-maleimidylstilbene-2,2'-disulfonic acid (AMS) and SDS-PAGE analysis following the reduction of 50 kDa Tsa1p band determined that 50 kDa Tsa1p does not have any free cysteine thiols and its oxidation states is sulfinic acid. Non-reducing 2D-PAGE analysis revealed that 50 kDa Tsa1p is joined through a disulfide linkage between two resolving cysteine residues from two independent Tsa1p-SO₂H polypeptide chains. This 50 kDa Tsa1p band did not appear in the process of the retroreduction of C170S mutant Tsa1p-SO₂H. Also, 50 kDa Tsa1p was correlated with the increasing protein expression of Srx 1 in yeast cell recovered from H₂O₂ and triggered structural change from heterogenous higher oligomers to lower oligomers. I propose that 50 kDa Tsa1p is an additional intermediate derived from retroreduction process of Tsa1p-SO₂H by Srx 1 and it may be important for understanding the retroreduction kinetics of Tsa1p-SO₂H.
Hyperoxidation state of peroxiredoxins (Prxs) by peroxides is known to be Prx-SO₂H, which is retroreducible to Prx-SH. However, no systematic study has been performed on other forms of hyperoxidized Prxs until now. Visualizing hyperoxidized Tsa1p (yeast peroxiredoxin) with anti-Tsa1p-SO₃H antiserum, I observed an obvious reactivity difference depending on the hydrogen peroxide concentrations to which yeast cells were exposed. On the basis of the retroreducing capacity of Srx 1, I identified two different types: reversibly and irreversibly hyperoxidized Tsa1p. Irreversibly hyperoxidized Tsa1p was determined to be Tsa1p-SO₃H by electrospray mass spectrometry. Tsa1p-SO₃H was not an autoxidation product from Tsa1p-SO₂H and was maintained in yeast cells at least two doubling cycles after recovery form H₂O₂ exposure. Tsa1p-SO₃H not only forms self-assembled high molecular weight complexes with homogeneously ring-shaped structure, but it also has about 4-fold higher chaperone activity than Tsa1p-SH. In addition, hyperoxidation to Tsa1p-SO₃H in response to H₂O₂ in yeast cells was significantly faster than in vitro hyper-oxidation in the presence of the thioredoxin system. In this study, I identified Tsa1p-SO₃H and its function as an effective and enduring molecular chaperone, and I also identified its function as a cellular marker that retains a cell's cumulative index of oxidative stresses. Since the discovery of Srx/sestrin, which catalyzes the reduction of Prx-SO₂H to -SH, several retroreduction mechanisms of Prx-SO₂H have been studiedon yeast and mammalian systems. Despite little difference on the retroreduction process of Prx-SO₂H between two species, sulfinic phosphoryl ester, thiosulfinate, and sulfenic acid have been considered in common as intermediates derived from the retroreduction process of Prx-SO₂H. However, retroreduction mechanism of Srx on Prx-SO₂H is still controvertial. In Saccharomyces cerevisiae, I observed that the reduction catalysis of Tsa1p-SO₂H by Srx 1 had been accomplished via a prominent 50 kDa Tsa1p band on non-reducing PAGE gel. The alkylation with 4-acetamido-4'-maleimidylstilbene-2,2'-disulfonic acid (AMS) and SDS-PAGE analysis following the reduction of 50 kDa Tsa1p band determined that 50 kDa Tsa1p does not have any free cysteine thiols and its oxidation states is sulfinic acid. Non-reducing 2D-PAGE analysis revealed that 50 kDa Tsa1p is joined through a disulfide linkage between two resolving cysteine residues from two independent Tsa1p-SO₂H polypeptide chains. This 50 kDa Tsa1p band did not appear in the process of the retroreduction of C170S mutant Tsa1p-SO₂H. Also, 50 kDa Tsa1p was correlated with the increasing protein expression of Srx 1 in yeast cell recovered from H₂O₂ and triggered structural change from heterogenous higher oligomers to lower oligomers. I propose that 50 kDa Tsa1p is an additional intermediate derived from retroreduction process of Tsa1p-SO₂H by Srx 1 and it may be important for understanding the retroreduction kinetics of Tsa1p-SO₂H.
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