본 연구는 galactosyl mannooligosaccharides에 대한 Mortierella sp. 유래의 α-galactosidase(α-D-galactoside galactohydro-lase, EC 3. 2. 1. 22)의 정제법 구축과 효소화학적 성질, enzyme system과 galactose를 포함하는 기질 및 Bacillus substilis, Trichoderma harzianum, Xylogone sphaerospora 각각의 미생물에 의해 조제된 galactosyl mannooligosaccharide에 대한 기질 ...
본 연구는 galactosyl mannooligosaccharides에 대한 Mortierella sp. 유래의 α-galactosidase(α-D-galactoside galactohydro-lase, EC 3. 2. 1. 22)의 정제법 구축과 효소화학적 성질, enzyme system과 galactose를 포함하는 기질 및 Bacillus substilis, Trichoderma harzianum, Xylogone sphaerospora 각각의 미생물에 의해 조제된 galactosyl mannooligosaccharide에 대한 기질 특이성과 정제효소의 응용법으로서 고가의 점도증가제인 locust bean gum의 대체자원으로서 생화학적 방법에 의한 guar gum의 효율적 이용법 개발을 주요 목적으로 하고 있다. Mortierella sp. 유래 조효소의 생산을 위해 1.5% Lactose, 0.5% glucose, 0.6 % (NH₄)₂SO₄, 1.0% corn steep liquor, 0.4% KH₂PO₄, 0.2% MgSO₄ · 7H₂O, 0.2% NaCl, 0.12% (NH₂)₂CO, 0.3% CaCO₃를 포함하는 효소 생성 배지 100 mL에 Mortierella sp.를 접종하여 30℃, 180 rpm에서 72시간을 진탕배양한 후 4℃, 12,000 rpm, 10분 원심분리 하여 조효소 100 mL를 생산하였다. Mortierella sp. 유래 α-galactosidase를 30% (NH₄)₂SO₄ 침전 및 투석 처리하여 CM-sephadex C-50 ion exchange column chromatography를 이용해 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)로 평형화 시켜 준 후, 0~0.3 M NaCl를 이용해 linear gradient로 단백질을 용출한 후, 용출된 단백질을 fraction number별로 단백질과 활성측정을 한 후, 단백질과 활성의 peak가 일치하는 부분을 분리하여 동일한 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)으로 평형화 시킨 Sephadex G-100 column chromatography로 정제를 수행하여, SDS전기영동에 의해 single band를 확인 하였으며, 분자량은 56 kDa으로 추정되었다. 정제된 α-galactosidase의 효소화학적 성질을 검토한 결과, 최적pH와 최적 온도는 pH 4.0, 60℃였으며, pH 3.0~5.5에서 80% 이상의 잔존활성을 나타내었고, 20~60℃에서 온도안정성을 나타낸 반면 70℃ 이상에서는 20% 이하의 낮은 잔존활성을 나타내었다. 또한 금속이온에 대한 영향에 있어서 Ag²+, Zn²+에 의해 각각 73%, 79% 활성을 저해하였으며, 특히 Hg²+에 대하여 16% 저해하였다. 정제된 α-galactosidase의 기질특이성을 규명하기 위하여 구조 동정된 세 미생물, Bacillus sp., Trichoderma harzianum, Xylogone sphaerospora 각각의 미생물 유래의 galactosyl mannooligosaccharide를 조제하였다. 우선, 세 미생물 유래의 galactosyl mannooligosaccharide의 분리는 각 효소액에 대해 0.5%씩 기질을 처리하여 가수분해해 activated carbon coulmn chromatography을 이용해 ethanol linear gradient로 당을 분리하였다. 분리 된 당용액은 phenol-H₂SO₄법을 이용하여 측정 후, TLC로 pattern을 검토한 결과, Bacillus sp. 유래 β-mannnanase에 의한 locust bean gum 가수분해 올리고당은 중합도 5(Gal³Man₄), 7(Gal²,3Man5), Trichoderma harzianum 유래 β-mannnanase에 의한 locust bean gum 가수분해 올리고당은 중합도 4(Gal²Man₃), 7(Gal²Man_(6)), Xylogone sphaerospora 유래 β-mannnanase에 의한 locust bean gum 가수분해 올리고당의 중합도 4(Gal²Man₃), 6(Gal²Man_(5))을 얻었다. 정제효소의 melibiose, raffinose 및 stachyose에 대한 가수분해산물의 동정을 TLC에 의해 확인한 결과, melibiose의 경우 24시간 반응 후 galactose, glucose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 melibiose spot가 관찰되었고, raffinose의 경우 24시간 반응 후 galactose와 sucrose로 분해되었음을 확인할 수 있었으며, stachyose의 경우 galactose와 raffinose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 stachyose spot가 관찰되었다. 세 미생물에 의해 분리 된 galactosyl mannooligosaccharide에 대한 가수분해산물의 동정을 TLC에 의해 확인한 결과, Bacillus sp. 유래의 중합도 5(Gal³Man₄), 7(Gal^(2,3)Man_(5))에 대한 결과 시간이 경과함에 따라 중합도 5(Gal3Man4)의 경우 galactose와 mannotetraose로 분리된 spot과 일부 가수분해 되지 않은 중합도 5(Gal³Man⁴)의 spot이 검출되었지만 중합도 7(Gal^(2,3)Man_(5))에 대하여 galactose spot이 유리되지 않았다. Trichoderma harzianum 유래의 중합도 4(Gal²Man₃), 7(Gal₂Man_(6))에 대한 결과 중합도 4(Gal²Man₃)의 경우 24시간 반응 후 galactose와 mannotriose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 중합도 4(Gal²Man₃)의 spot이 관찰되었다. 중합도 7(Gal²Man_(6))의 경우 24시간 반응 후에도 중합도 7의 spot만이 관찰되었다. Xylogone sphaerospora 유래의 중합도 4(Gal²Man₃), 6(Gal²Man_(5))에 대한 결과 중합도 4(Gal²Man₃)의 경우 24시간 반응 후 galactose, mannotriose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 중합도 4(Gal²Man₃)의 spot이 관찰되었다. 중합도 6의 경우 24시간 반응 후에도 중합도 6의 spot만이 관찰되었다. 정제효소의 응용법으로서 guar gum의 경우 정제효소로 가수분해되어 유도되는 gum 산물은 galactose가 제거된 1,4-mannosyl polysaccharides로서 점도력이 증가되며, 40℃에서 정제효소와 반응시킨 guar gum을 2시간, 6시간, 12시간, 24시간마다 sampling하였다. TLC에 의해 확인한 결과 시간이 지남에 따라 galactose spot이 검출되었으며, 각 시간별 sample에 0.12% xanthan gum을 처리하여 gel 형성능력을 측정하고자 Brookfield Viscometer(Model DV-Ⅱ)를 이용하여 점도를 측정한 결과 2시간에서 24시간으로 효소처리시간이 증가함에 따라 xanthan gum과의 gel 형성능력을 효소처리 하기 전보다 3배 점도증가를 보임에 따라 경제적 점도증가제의 대체자원으로서의 가능성을 시사하였다.
본 연구는 galactosyl mannooligosaccharides에 대한 Mortierella sp. 유래의 α-galactosidase(α-D-galactoside galactohydro-lase, EC 3. 2. 1. 22)의 정제법 구축과 효소화학적 성질, enzyme system과 galactose를 포함하는 기질 및 Bacillus substilis, Trichoderma harzianum, Xylogone sphaerospora 각각의 미생물에 의해 조제된 galactosyl mannooligosaccharide에 대한 기질 특이성과 정제효소의 응용법으로서 고가의 점도증가제인 locust bean gum의 대체자원으로서 생화학적 방법에 의한 guar gum의 효율적 이용법 개발을 주요 목적으로 하고 있다. Mortierella sp. 유래 조효소의 생산을 위해 1.5% Lactose, 0.5% glucose, 0.6 % (NH₄)₂SO₄, 1.0% corn steep liquor, 0.4% KH₂PO₄, 0.2% MgSO₄ · 7H₂O, 0.2% NaCl, 0.12% (NH₂)₂CO, 0.3% CaCO₃를 포함하는 효소 생성 배지 100 mL에 Mortierella sp.를 접종하여 30℃, 180 rpm에서 72시간을 진탕배양한 후 4℃, 12,000 rpm, 10분 원심분리 하여 조효소 100 mL를 생산하였다. Mortierella sp. 유래 α-galactosidase를 30% (NH₄)₂SO₄ 침전 및 투석 처리하여 CM-sephadex C-50 ion exchange column chromatography를 이용해 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)로 평형화 시켜 준 후, 0~0.3 M NaCl를 이용해 linear gradient로 단백질을 용출한 후, 용출된 단백질을 fraction number별로 단백질과 활성측정을 한 후, 단백질과 활성의 peak가 일치하는 부분을 분리하여 동일한 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)으로 평형화 시킨 Sephadex G-100 column chromatography로 정제를 수행하여, SDS 전기영동에 의해 single band를 확인 하였으며, 분자량은 56 kDa으로 추정되었다. 정제된 α-galactosidase의 효소화학적 성질을 검토한 결과, 최적pH와 최적 온도는 pH 4.0, 60℃였으며, pH 3.0~5.5에서 80% 이상의 잔존활성을 나타내었고, 20~60℃에서 온도안정성을 나타낸 반면 70℃ 이상에서는 20% 이하의 낮은 잔존활성을 나타내었다. 또한 금속이온에 대한 영향에 있어서 Ag²+, Zn²+에 의해 각각 73%, 79% 활성을 저해하였으며, 특히 Hg²+에 대하여 16% 저해하였다. 정제된 α-galactosidase의 기질특이성을 규명하기 위하여 구조 동정된 세 미생물, Bacillus sp., Trichoderma harzianum, Xylogone sphaerospora 각각의 미생물 유래의 galactosyl mannooligosaccharide를 조제하였다. 우선, 세 미생물 유래의 galactosyl mannooligosaccharide의 분리는 각 효소액에 대해 0.5%씩 기질을 처리하여 가수분해해 activated carbon coulmn chromatography을 이용해 ethanol linear gradient로 당을 분리하였다. 분리 된 당용액은 phenol-H₂SO₄법을 이용하여 측정 후, TLC로 pattern을 검토한 결과, Bacillus sp. 유래 β-mannnanase에 의한 locust bean gum 가수분해 올리고당은 중합도 5(Gal³Man₄), 7(Gal²,3Man5), Trichoderma harzianum 유래 β-mannnanase에 의한 locust bean gum 가수분해 올리고당은 중합도 4(Gal²Man₃), 7(Gal²Man_(6)), Xylogone sphaerospora 유래 β-mannnanase에 의한 locust bean gum 가수분해 올리고당의 중합도 4(Gal²Man₃), 6(Gal²Man_(5))을 얻었다. 정제효소의 melibiose, raffinose 및 stachyose에 대한 가수분해산물의 동정을 TLC에 의해 확인한 결과, melibiose의 경우 24시간 반응 후 galactose, glucose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 melibiose spot가 관찰되었고, raffinose의 경우 24시간 반응 후 galactose와 sucrose로 분해되었음을 확인할 수 있었으며, stachyose의 경우 galactose와 raffinose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 stachyose spot가 관찰되었다. 세 미생물에 의해 분리 된 galactosyl mannooligosaccharide에 대한 가수분해산물의 동정을 TLC에 의해 확인한 결과, Bacillus sp. 유래의 중합도 5(Gal³Man₄), 7(Gal^(2,3)Man_(5))에 대한 결과 시간이 경과함에 따라 중합도 5(Gal3Man4)의 경우 galactose와 mannotetraose로 분리된 spot과 일부 가수분해 되지 않은 중합도 5(Gal³Man⁴)의 spot이 검출되었지만 중합도 7(Gal^(2,3)Man_(5))에 대하여 galactose spot이 유리되지 않았다. Trichoderma harzianum 유래의 중합도 4(Gal²Man₃), 7(Gal₂Man_(6))에 대한 결과 중합도 4(Gal²Man₃)의 경우 24시간 반응 후 galactose와 mannotriose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 중합도 4(Gal²Man₃)의 spot이 관찰되었다. 중합도 7(Gal²Man_(6))의 경우 24시간 반응 후에도 중합도 7의 spot만이 관찰되었다. Xylogone sphaerospora 유래의 중합도 4(Gal²Man₃), 6(Gal²Man_(5))에 대한 결과 중합도 4(Gal²Man₃)의 경우 24시간 반응 후 galactose, mannotriose 및 가수분해 되지 않고 남은 일부 중합도 4(Gal²Man₃)의 spot이 관찰되었다. 중합도 6의 경우 24시간 반응 후에도 중합도 6의 spot만이 관찰되었다. 정제효소의 응용법으로서 guar gum의 경우 정제효소로 가수분해되어 유도되는 gum 산물은 galactose가 제거된 1,4-mannosyl polysaccharides로서 점도력이 증가되며, 40℃에서 정제효소와 반응시킨 guar gum을 2시간, 6시간, 12시간, 24시간마다 sampling하였다. TLC에 의해 확인한 결과 시간이 지남에 따라 galactose spot이 검출되었으며, 각 시간별 sample에 0.12% xanthan gum을 처리하여 gel 형성능력을 측정하고자 Brookfield Viscometer(Model DV-Ⅱ)를 이용하여 점도를 측정한 결과 2시간에서 24시간으로 효소처리시간이 증가함에 따라 xanthan gum과의 gel 형성능력을 효소처리 하기 전보다 3배 점도증가를 보임에 따라 경제적 점도증가제의 대체자원으로서의 가능성을 시사하였다.
The objective of this paper is to study some properties and substrate specificity of the α-galactosidase(α-D-galactoside galactohydrolase, EC 3. 2. 1. 22) from Mortierella sp.. Besides this paper deals with application of the purified α-galactosidase from Mortierella sp.. Mortierella sp. was culture...
The objective of this paper is to study some properties and substrate specificity of the α-galactosidase(α-D-galactoside galactohydrolase, EC 3. 2. 1. 22) from Mortierella sp.. Besides this paper deals with application of the purified α-galactosidase from Mortierella sp.. Mortierella sp. was cultured in 100 mL of medium composed of 1.5% lactose, 0.5% glucose, 0.6% (NH₄)₂SO₄, 1.0% corn steep liquor, 0.4% KH₂PO₄, 0.2% MgSO₄· 7H₂O, 0.2% NaCl, 0.12% (NH₂)₂CO, 0.3% CaCO₃ at 30℃. α-galactosidase activity from Mortierella sp. was purified by ion exchange chromatography on CM-sephadex C-50 and gel filtration chromatography on Sephadex G-100. The purified α-galactosidase showed a single protein band on SDS. The molecular mass of the purified α-galactosidase was estimated to be 56 kDa by SDS. The enzyme was purified approximately 14.57-fold with a yield of 72.54% compared with the culture filtraion. The purified galactosidase was showed maximal activity at pH 4.0 and 55℃, and was stable in the pH and temperature ranges of 3.0 to 5.5 and 20℃ to 60℃, respectively. The enzyme activity was inhibited by Ag²+, Zn²+ and. Hg²+. The enzyme activity was not affected considerably by treatment with other metal compounds. α-Galactosidase from Mortierella sp. liberated galactose from melibiose, raffinose, stachyose by TLC. Locust bean gum was hydrolyzed D.P. 5(Gal³Man₄), 7(Gal^(2,3)Man5) by β-mannnanase from Bacillus sp., D.P. 4(Gal²Man₃), 7(Gal²Man_(6)) by β-mannnanase from Trichoderma. harzianum and D.P. 4(Gal²Man₃), 6(Gal²Man_(5)) by β-mannnanase from Xylogone sphaerospora. These hydrolysates were separated by activated carbon coulmn chromatography. The enzyme acted on D.P. 4, 5 of galactosyl mannooligosaccharides from Bacillus sp., Trichoderma harzianum and Xylogone sphaerospora. But the enzyme didn't on D.P. 6, 7 of galactosyl mannooligosaccharides from Bacillus sp., Trichoderma harzianum and Xylogone sphaerospora. Gel-promoting property of enzyme-treated guar gum sample were increased as the galactose content decreased. The galactose was detected by the TLC analysis of the reaction solution. Gal/Man ratios of guar gum, locust bean gum and enzyme-treated guar gum are analyzed and summarized in table 10. Xanthan gum(0.12% w/v) were mixed at the rate of 1:1(v/v). Gelation occurred in mixed solutions of xanthan gum and locust bean gum of enzyme-treated guar gums, while in contrast, gelation did not occur in a mixed solution of xanthan gum and guar gum.
The objective of this paper is to study some properties and substrate specificity of the α-galactosidase(α-D-galactoside galactohydrolase, EC 3. 2. 1. 22) from Mortierella sp.. Besides this paper deals with application of the purified α-galactosidase from Mortierella sp.. Mortierella sp. was cultured in 100 mL of medium composed of 1.5% lactose, 0.5% glucose, 0.6% (NH₄)₂SO₄, 1.0% corn steep liquor, 0.4% KH₂PO₄, 0.2% MgSO₄· 7H₂O, 0.2% NaCl, 0.12% (NH₂)₂CO, 0.3% CaCO₃ at 30℃. α-galactosidase activity from Mortierella sp. was purified by ion exchange chromatography on CM-sephadex C-50 and gel filtration chromatography on Sephadex G-100. The purified α-galactosidase showed a single protein band on SDS. The molecular mass of the purified α-galactosidase was estimated to be 56 kDa by SDS. The enzyme was purified approximately 14.57-fold with a yield of 72.54% compared with the culture filtraion. The purified galactosidase was showed maximal activity at pH 4.0 and 55℃, and was stable in the pH and temperature ranges of 3.0 to 5.5 and 20℃ to 60℃, respectively. The enzyme activity was inhibited by Ag²+, Zn²+ and. Hg²+. The enzyme activity was not affected considerably by treatment with other metal compounds. α-Galactosidase from Mortierella sp. liberated galactose from melibiose, raffinose, stachyose by TLC. Locust bean gum was hydrolyzed D.P. 5(Gal³Man₄), 7(Gal^(2,3)Man5) by β-mannnanase from Bacillus sp., D.P. 4(Gal²Man₃), 7(Gal²Man_(6)) by β-mannnanase from Trichoderma. harzianum and D.P. 4(Gal²Man₃), 6(Gal²Man_(5)) by β-mannnanase from Xylogone sphaerospora. These hydrolysates were separated by activated carbon coulmn chromatography. The enzyme acted on D.P. 4, 5 of galactosyl mannooligosaccharides from Bacillus sp., Trichoderma harzianum and Xylogone sphaerospora. But the enzyme didn't on D.P. 6, 7 of galactosyl mannooligosaccharides from Bacillus sp., Trichoderma harzianum and Xylogone sphaerospora. Gel-promoting property of enzyme-treated guar gum sample were increased as the galactose content decreased. The galactose was detected by the TLC analysis of the reaction solution. Gal/Man ratios of guar gum, locust bean gum and enzyme-treated guar gum are analyzed and summarized in table 10. Xanthan gum(0.12% w/v) were mixed at the rate of 1:1(v/v). Gelation occurred in mixed solutions of xanthan gum and locust bean gum of enzyme-treated guar gums, while in contrast, gelation did not occur in a mixed solution of xanthan gum and guar gum.
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