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문제 정의
- 본 연구에서는 H. polymorpha로부터 알코올 산화효소를 대량 발현을 유도하였으며, 발현된 효소를 간단히 정제할 수 있는 정제법과 정제된 효소의 기질특이성 및 안정성을 상세히 조사하였다.
제안 방법
- 6에 나타내었다. 4 ℃와 25 ℃에서 각각 2가지의 보관 조건으로 7주간 보관하면서 활성을 측정하였다. 그 결과, 4 ℃에서 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.
- 단백질 농도는 Bradford 방법12에 의해 측정하였다. Bovine serum albumin을 표준단백질로 사용하여 595 nm에서의 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 계산하였다.
- Crude extract는 DEAE-Sephacel 컬럼 크로마토그래피법과 Mono Q 컬럼 크로마토그래피법에 의하여 정제하였다. DEAE-Sephacel 음이온 교환수지를 컬럼 (16×400 mm)에 충진 시킨 후, 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.5)으로 여러 번 세척하고 평형을 시켰다. 평형시킨 컬럼에 원심 분리한 조효소를 흡착시켰다.
- H. polymorpha 알코올 산화효소의 에탄올 산화반응에 대한 pH의 효과를 조사하였다 (Fig. 3). H.
- Methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, isoamyl alcohol, crotyl alcohol 및 2,2,2-trichloroethanol을 기질로 사용하여 효소의 기질 특이성을 조사하였다. 표준 활성 반응 혼합물에 각각의 최종농도가 4 mM이 되게 하여 표준활성 측정방법에 따라 정제된 효소에 대한 활성을 측정하였다.
- 또한 효소를 장기간에 걸쳐 보관하면서 안정성을 조사하였다. 효소를 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.
- 5% 메탄올을 이용하여 세포 단백질의 50%까지 대량 유도 발현시켰다. 발현된 H. polymorpha 알코올 산화효소는 DEAE-Sphacel 과 Mono Q 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 30%의 높은 수율로 정제법을 확립하였다. 정제한 효소는 에탄올에 상대적으로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 이 효소는 열과 변성제에도 안정하였으며, 7주간의 비교적 장기간 보관에도 안정하였다.
- 효소의 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 효소 액을 30 ℃에서 80 ℃까지 각각의 온도에서 30분 동안 가열하고 얼음에서 1분 동안 냉각한 후, 표준활성 반응조건에서 효소의 남아 있는 활성을 측정하였다. 변성 시약에 대한 효소의 영향을 조사하기 위해 urea, guanidine hydrochloride를 사용하여 이 들 시약들에 대한 효소의 안정성을 조사하였다. 효소 액에 각각의 농도로 제조한 변성시약을 첨가하여 1시간이 경과한 후, 표준 활성 반응 조건으로 효소에 남아 있는 활성을 측정하였다.
- 평형시킨 컬럼에 원심 분리한 조효소를 흡착시켰다. 불필요한 단백질을 제거하기 위해 같은 완충용액으로 충분히 세척한 다음, 1 M NaCl을 이용하여 linear gradient 방식으로 용출하였다. 이 때 유출속도는 0.
- 75 mL/min으로 하였고, 용출액은 5 mL씩 100개의 시험관에 받았다. 용출된 분획 중 알코올 산화효소 활성을 갖는 분획을 모아서 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.5)에 3회 투석하였다. 투석한 활성 분획을 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.
- 이렇게 정제된 효소는 효소학적 특성 실험에 사용되었다. 정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE로 확인하였다. 모든 정제과정은 4 ℃ 또는 얼음 위에서 실시하였다.
- 표준 활성 반응 혼합물에 ethanol의 최종농도를 0.5 mM부터 50 mM까지 변화시켜, 정제된 효소에 대한 기질 농도의 영향을 조사하였다. Michaelis-Menten 상수 (Km)와 최대속도 (Vmax)는 Lineweaver-Burk plot에 의하여 결정하였다.
- Methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, isoamyl alcohol, crotyl alcohol 및 2,2,2-trichloroethanol을 기질로 사용하여 효소의 기질 특이성을 조사하였다. 표준 활성 반응 혼합물에 각각의 최종농도가 4 mM이 되게 하여 표준활성 측정방법에 따라 정제된 효소에 대한 활성을 측정하였다.
- 에 따라 실시하였다. 표준 활성 반응물인 2 mM ABTS, 0.003% hydrogen peroxide, 1% methanol, 250 U peroxidase를 포함한 100 mM potassium phophate 완충용액 (pH 7.5)과 정제한 효소를 넣어 1 mL가 되도록 하였다. 효소 활성 반응의 생성물인 H2O2의 양을 UV/VIS Spectrophotometer를 이용하여 405 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 5 범위는 sodium carbonate-bicarbonate 완충용액을 조제하여 사용하였다. 표준활성 반응조건에서 100 mM potassium phosphate (pH 7.5) 완충용액 대신에 각각의 pH의 완충용액을 최종 농도가 20 mM이 되도록 가하여 활성을 측정하였다. 효소 활성에 대한 온도의 효과를 알아보기 위하여 표준활성 반응조건에서 항온기를 이용하여 온도를 30 ℃에서 80 ℃까지 변화시키면서 활성을 측정하였다.
- 5 ml/min의 속도로 용출하였다. 활성 분획만을 모아 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.5)으로 투석하였다. 이렇게 정제된 효소는 효소학적 특성 실험에 사용되었다.
- 변성 시약에 대한 효소의 영향을 조사하기 위해 urea, guanidine hydrochloride를 사용하여 이 들 시약들에 대한 효소의 안정성을 조사하였다. 효소 액에 각각의 농도로 제조한 변성시약을 첨가하여 1시간이 경과한 후, 표준 활성 반응 조건으로 효소에 남아 있는 활성을 측정하였다.
- 5)과 정제한 효소를 넣어 1 mL가 되도록 하였다. 효소 활성 반응의 생성물인 H2O2의 양을 UV/VIS Spectrophotometer를 이용하여 405 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. ABTS의 molar absorbance coefficient는 36,800 M-1·cm-1 이며, 알코올 산화효소 활성의 1 unit은 표준 활성 반응 조건에서 분당 1 μmol의 H2O2 생성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다.
- 5) 완충용액 대신에 각각의 pH의 완충용액을 최종 농도가 20 mM이 되도록 가하여 활성을 측정하였다. 효소 활성에 대한 온도의 효과를 알아보기 위하여 표준활성 반응조건에서 항온기를 이용하여 온도를 30 ℃에서 80 ℃까지 변화시키면서 활성을 측정하였다.
- 효소 활성에 미치는 pH의 변화의 영향을 측정하기 위하여 pH 3.5～5.5 범위는 sodium acetate 완충용액을, pH 5.5～7.5 범위는 potassium phosphate 완충용액을, pH 7.5～8.5 범위는 tris-HCl 완충용액을, 그리고 pH 8.5～10.5 범위는 sodium carbonate-bicarbonate 완충용액을 조제하여 사용하였다. 표준활성 반응조건에서 100 mM potassium phosphate (pH 7.
- 또한 효소를 장기간에 걸쳐 보관하면서 안정성을 조사하였다. 효소를 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.5)에 각각 20% glycerol을 넣은 것을 장기간 보관하면서 남아 있는 효소의 활성을 측정하였다. 동일한 효소를 준비하여 4 ℃와 25 ℃에 같은 조건으로 보관하면서 남아 있는 활성을 측정하였다.
- 효소의 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 효소 액을 30 ℃에서 80 ℃까지 각각의 온도에서 30분 동안 가열하고 얼음에서 1분 동안 냉각한 후, 표준활성 반응조건에서 효소의 남아 있는 활성을 측정하였다. 변성 시약에 대한 효소의 영향을 조사하기 위해 urea, guanidine hydrochloride를 사용하여 이 들 시약들에 대한 효소의 안정성을 조사하였다.
대상 데이터
- Louis, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. DEAE (Diethylaminoethyl)-Sephacel 음이온 교환수지와 Mono Q HR 5/5는 Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)의 제품을 사용하였으며, Coomassie brilliant blue R-250는 Polyscience Inc. (Warrington, USA)의 제품을 사용하였다. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 분자량 marker는 Bio-Rad사 (Richmond, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- H. polymorpha (ATCC 26012)는 한국 미생물 보존센터로부터 동결 건조된 상태의 분말상태로 분양 받아 사용하였다. Yeast extract와 Bacto® peptone은 Difco Laboratoriesa (Detroit, USA)의 제품을, 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), horseradish peroxidase (1000 U), DL-dithiothreitol은 Sigma사 (St.
- (Warrington, USA)의 제품을 사용하였다. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 분자량 marker는 Bio-Rad사 (Richmond, USA)에서 구입하여 사용하였다. 그 외 모든 시약들은 일급 및 특급 시약을 사용하였다.
- polymorpha (ATCC 26012)는 한국 미생물 보존센터로부터 동결 건조된 상태의 분말상태로 분양 받아 사용하였다. Yeast extract와 Bacto® peptone은 Difco Laboratoriesa (Detroit, USA)의 제품을, 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), horseradish peroxidase (1000 U), DL-dithiothreitol은 Sigma사 (St. Louis, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. DEAE (Diethylaminoethyl)-Sephacel 음이온 교환수지와 Mono Q HR 5/5는 Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)의 제품을 사용하였으며, Coomassie brilliant blue R-250는 Polyscience Inc.
- 불필요한 단백질을 제거하기 위해 같은 완충용액으로 충분히 세척한 다음, 1 M NaCl을 이용하여 linear gradient 방식으로 용출하였다. 이 때 유출속도는 0.25～0.75 mL/min으로 하였고, 용출액은 5 mL씩 100개의 시험관에 받았다. 용출된 분획 중 알코올 산화효소 활성을 갖는 분획을 모아서 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.
이론/모형
- 효소 (zymolyase)로 처리한 용액을 초음파 파쇄기를 이용하여 30～40 watts, 12% amplitude의 실험조건으로 4 ℃에서 15～20분간 세포막을 파괴한 다음, 4 ℃에서 20,000 rpm으로 60분 동안 원심분리하여 그 상층액을 얻어 crude extract로 하였다. Crude extract는 DEAE-Sephacel 컬럼 크로마토그래피법과 Mono Q 컬럼 크로마토그래피법에 의하여 정제하였다. DEAE-Sephacel 음이온 교환수지를 컬럼 (16×400 mm)에 충진 시킨 후, 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.
- Laemmli의 방법13에 따라 12.5% SDS-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동을 하였으며, Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma, St. Louis, USA)으로 염색하였다. 이 때 분자량 marker 단백질로 phosphorylase B (92.
- 5 mM부터 50 mM까지 변화시켜, 정제된 효소에 대한 기질 농도의 영향을 조사하였다. Michaelis-Menten 상수 (Km)와 최대속도 (Vmax)는 Lineweaver-Burk plot에 의하여 결정하였다.
- ABTS의 molar absorbance coefficient는 36,800 M-1·cm-1 이며, 알코올 산화효소 활성의 1 unit은 표준 활성 반응 조건에서 분당 1 μmol의 H2O2 생성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법12에 의해 측정하였다. Bovine serum albumin을 표준단백질로 사용하여 595 nm에서의 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 계산하였다.
- 알코올 산화효소의 활성도 측정은 Tani 등의 방법11에 따라 실시하였다. 표준 활성 반응물인 2 mM ABTS, 0.
- polymorpha 알코올 산화효소 활성에 대한 기질농도의 효과는 상온에서 조사되었다. 에탄올에 대한 H. polymorpha 알코올 산화효소의 Michaelis-Menten 상수와 최대 속도는 Lineweaver-Burk plot에 의해 결정하였다 (Fig. 2). 에탄올에 대한 H.
성능/효과
- 5A에 나타내었다. 0～0.1 M의 urea를 첨가한 경우 효소 활성에 영향을 미치지 않을 정도로 90%이상의 효소 활성을 보였으나, 0.1 M보다 높은 농도의 urea에서는 효소 활성이 급격히 감소하더니, 약 0.32 M에서는 본래 활성의 50% 정도였다. 한편 H.
- 00 U/mg)의 비활성과 유사하였다.2 정제한 효소의 분자량은 SDS-polyacrylamide 겔 전기영동에서 75 kDa으로 확인되었다 (Fig. 1).
- polymorpha 알코올 산화효소의 정제 결과를 Table 1에 나타내었다. Crude extract는 DEAE-Sephacel 컬럼 크로마토그래피와 Mono Q 컬럼 크로마토그래피로 전기영동에서 단일밴드로 정제하였으며 비활성은 10.23 U/mg으로 약 9배 증가하였으며, 수율은 약 30%를 나타내었다 (Table 1). 정제한 효소의 알코올에 대한 비활성은 Kloeckera에서 정제한 알코올 산화효소 (11.
- 25 ℃에서 20% glycerol을 첨가한 완충용액에서 보관한 효소는 2주가 넘자 이미 50%정도의 활성을 보였고, 5주 째부터는 12% 이하의 활성을 보이며 더 이상 감소하지 않았다. 결론적으로 상온에서보다는 4 ℃에서 보관하는 것이 더 안정하며 glycerol을 첨가하지 않은 완충용액에 효소를 보관했을 때가 장기간 안정하였다.
- 4 ℃와 25 ℃에서 각각 2가지의 보관 조건으로 7주간 보관하면서 활성을 측정하였다. 그 결과, 4 ℃에서 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7.5)에 효소를 보관한 경우에는 7주 후에도 80% 이상의 활성을 보여주었다 (Fig. 6A). 그러나, 20% glycerol을 첨가한 완충용액에서 보관한 효소는 1주 째의 활성이 80% 이하로 떨어졌으며, 7주 째는 약 60%정도의 활성을 유지하였다.
- Veenhuis 등의 발표된 논문14에 의하면 알코올 산화효소는 발현 유도에 의해 세포 단백질의 30～40% 이상을 차지할 정도로 발현될 수 있다고 하였다. 따라서 본 연구의 유도 발현 결과는 유도 발현의 최적 조건을 검토함으로써 지금까지의 연구들보다 10～20% 정도 알코올 산화효소를 더 많이 발현하였다. 대량 발현된 균체를 zymolase로 처리 후, 세포파쇄기 (30～40 watt, 12% amplitude)로 4 ℃에서 15～20분 동안 세포막을 파괴하였다.
- 5 이하에는 활성이 나타나지 않았으며, pH 10에서도 최대 효소 활성의 80%를 나타내었다. 따라서 이 효소는 낮은 pH에서 보다는 높은 pH에서 활성이 높게 나타남을 알 수 있었다. 이 효소의 최적 pH는 Kloeckera 알코올 산화효소 (pH 8.
- 5%의 에탄올로 배양시킨 균주에서 알코올 산화효소가 가장 높게 유도되었다. 발현 유도된 H. polymorpha 알코올 산화효소는 SDS-PAGE와 활성 측정으로 판단할 때, 세포 단백질의 약 50% 이상을 차지할 정도로 매우 높게 발현되었다. Veenhuis 등의 발표된 논문14에 의하면 알코올 산화효소는 발현 유도에 의해 세포 단백질의 30～40% 이상을 차지할 정도로 발현될 수 있다고 하였다.
- 65 ℃에서도 10% 정도의 활성이 남아있었으며, 75 ℃에서 조차도 완전히 활성을 잃지 않았다. 이상의 결과로부터 H. polymorpha 알코올 산화효소는 비교적 열에 안정하다는 사실을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로부터 본 연구에서는 효모 균주인 Hansenula polymorpha로부터 알코탄소원으로 0.5% 메탄올을 이용하여 세포 단백질의 50%까지 대량 유도 발현시켰다. 발현된 H.
- polymorpha를 YNB배지에 37 ℃에서 약 16～24시간 전배양하였다. 전배양한 1%의 균주와 0.5～2%의 메탄올로 유도하여 대량 발현의 조건을 조사한 결과 0.5%의 에탄올로 배양시킨 균주에서 알코올 산화효소가 가장 높게 유도되었다. 발현 유도된 H.
- polymorpha 알코올 산화효소는 DEAE-Sphacel 과 Mono Q 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 30%의 높은 수율로 정제법을 확립하였다. 정제한 효소는 에탄올에 상대적으로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 이 효소는 열과 변성제에도 안정하였으며, 7주간의 비교적 장기간 보관에도 안정하였다. H.
- polymorpha 알코올 산화효소는 에탄올과 메탄올에 대해서 높은 활성을 보인 반면, 다른 알코올에 대한 활성은 매우 낮거나 측정되지 않았다. 즉 H. polymorpha 알코올 산화효소는 사슬이 짧은 일차 알코올에 대해 높은 활성을 보인 반면에, 긴 사슬의 일차 알코올이나 불포화 알코올에서는 낮은 활성을 보였으며 가지 사슬 알코올이나 이차 알코올은 기질이 되지 못한다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 사실은 H.
후속연구
- 정제한 효소는 에탄올에 상대적으로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 이 효소는 열과 변성제에도 안정하였으며, 7주간의 비교적 장기간 보관에도 안정하였다. H. polymorpha 알코올 산화효소는 알코올 바이오 센서 및 알코올과 알데히드의 공업적 생산에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 11 그러나 생합성 과정의 주체인 알코올 산화 효소의 가격이 비싸며 효소자체가 안정하지 못해 쉽게 활성을 잃어버리는 중대한 문제점이 있다. 따라서 각종 알코올 및 알데히드의 생공업적 생산과 알코올 바이오센서에 알코올 산화 효소를 적용하기 위해서는 효소의 발현 양을 최대로 할 수 있는 발현조건과 정제 방법을 설정하는 연구 및 효소에 대한 기질특이성과 안정성 조사는 필요하다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.