[논문]Spot Assay를 통한 Human Cytomegalovirus의 UL97 단백질 인산화 효소의 기질 특이성

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[국내논문] Spot Assay를 통한 Human Cytomegalovirus의 UL97 단백질 인산화 효소의 기질 특이성
Substrate Specificity of UL97 Protein Kinase from Human Cytomegalovirus using Spot Assay 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.50 no.4, 2006년, pp.268 - 271

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Protein kinase UL97 is an unusual protein kinase that can phosphorylate nucleoside analogs as well as protein/peptide. Previously we found a H2B-derived peptide, KESYSVYVYKV and reported that the P+5 position (K) is important. To further understand the substrate specificity at the P+5 position, we introduced spot assay system and showed that a peptide containing K residue among other amino acids at the P+5 position is the best substrate. Also other residues such as M, I, L, or G are good enough to be substrate of UL97. This result may aid the discovery of a new antiviral inhibitor.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 spot assay를 통해 P+5 위치에 여러가지 아미노산으로 치환시켜 얻어진 합성 펩타이드들을 이용하여 UL97 단백질 인산화 효소의 기질 특이성을 더 자세히 밝혀내고자 한다.
GST-UL97을 순수하게 분리 정제하는 단계에 있어서 다른 단백질 인산화 효소의 혼입 가능성을 배제하기 위하여, GST-UL97K355Q라는 돌연변이 단백질을 이용하였고, 그 결과 순수한 GST-UL97이 분리정제 되었음을 알게 되었다*4)GST-UL97 은 histone H₂B> 인산화 시킬 수 있었고, 인산화 된 잔기 주위로부터 합성된 펩타드가 인산화 됨을 보고하였다亨 합성된 펩타이드 들은 P+5 위치가 UL97에 의해 인산화 되는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보여 졌다. 따라서 본 연구에서는. P+5 위치를 다른 19개 아미노산 잔기로 치환된 19개 펩타이드를 포함하는 spot paper를 이용하여 U凡97의 기질 특이성을 더 연구하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는. P+5 위치를 다른 19개 아미노산 잔기로 치환된 19개 펩타이드를 포함하는 spot paper를 이용하여 U凡97의 기질 특이성을 더 연구하고자 하였다.
본 연구자는 UL97에 의해 안t蝸 되는 펩타이드 KESYSVYVYKV (S : 인산화 되는 위치)를 보고 하였다.分 이 펩타이드는 히스톤 H2B에 존재하는 것으로써, 합성 펩타이드가 UL97에 의해 in vitro에서 인산화 됨을 보였고, 인산화 되는 Ser으로부터 C 말단 쪽으로 다섯 번째 (P+5) 떨어져 있는 K가 중요함을 보고하였다.

제안 방법

Baculoviurs에 의해 발현된 GST-UL97과 GST-UL 97K 355Q는 전에 보고한 방법처럼 정제되었다.分 간략히, 먼저 glutathione-Sepharose affinity 칼럼을 이용하고, 다음으로 Q-Sepharose 칼럼과 phenyl-Sepharose 칼럼을 이용하였고, 이를 Centricon-30 을 이용하여 농축하고 투석을 흐】였다. 최종 얻어진 단백질은 SDS-啓GE를 통하여 순수하게 분리되었음을 확인하였고, amino acid analysis를 통하여 단백질 농도를 결정하였다.
잔기인 KASYSVYVYK를 이용하였다. Research and Genetics内에 의뢰하여 P+5 위치(K)를 Ser을 제외한 모든 가능한 아미노산(19개)으로 치환된 합성 펩타이드를 포함한 spot paper를 제조하였다. cellulose paper위에 nanomolar의 양으로 펩타이드를 직접 합성하는 방식으로 이 membrane sheet는 일반적인 효소 반응이나 동위원소를 이용한 방식에 이용할 수 있으며, positive reaction을 갖는 펩타이드를 chromogenic, fluorometric 또는 autoradiography 방식을 이용해서 찾을 수 있다.

대상 데이터

Spodoptera frugiperda 9 cells(Sf9) 은 American Type Culture Collection으로부터 구입하였고, 10% fetal bovine serum (Atlanta Biologicals), 100 units/m/ penicillin, 100 ug/m/ streptomycin B를 포함하는 Grace's insect medium(Invitrogen)에서 배양흐)였다. Glutathione S-transferase(GST)-UI97을 발현시키는 baculovirus는 일반적인 방법에 따라 배양 및 이용을 하였다.
기본이 되는 펩타이드는 UL97에 의해 인산화 되는 histone H2B의 잔기인 KASYSVYVYK를 이용하였다. Research and Genetics内에 의뢰하여 P+5 위치(K)를 Ser을 제외한 모든 가능한 아미노산(19개)으로 치환된 합성 펩타이드를 포함한 spot paper를 제조하였다.

이론/모형

각각의 펩E이드는 nanomole 양으로 안정한 hydrophilic membrane sheet의 표면에서 직접 합성되었다. 펩타이드는 전형적인 Fmoc 방식을 이용하여 합성되었다.

성능/효과

p data-page="1">UL97은 바이러스 감염시 아주 중요한 역할을 하며 항바이러스제의 작용점이 된다.12)이 효소는 완전히 필수적이지는 않지만 세포 배양시에 human cytomegalovirus(HCMV) 복제에 있어서는 필수적이다.3)U几97은 바이러스의 DNA 합성, 바이러스 assembly 그리고 핵으로부터 assemble된 nucleocapsid의 egress 시에 중요한 역할을 한다는 보고들이 있다.
分 간략히, 먼저 glutathione-Sepharose affinity 칼럼을 이용하고, 다음으로 Q-Sepharose 칼럼과 phenyl-Sepharose 칼럼을 이용하였고, 이를 Centricon-30 을 이용하여 농축하고 투석을 흐】였다. 최종 얻어진 단백질은 SDS-啓GE를 통하여 순수하게 분리되었음을 확인하였고, amino acid analysis를 통하여 단백질 농도를 결정하였다.
IB). 예상한 것처럼 K가 가장 효율적으로 인산화가 되었고, 그 다음으로 M, L, I, G가 비슷한 정도로 인산화 효율이 좋았다. 이들은 G를 제외하고는 상대적으로 hydrophobic 아미노산 잔기들이 좋은 효율을 나타내었다.
예상하기로는 positive charge를 띄고 있는 R 잔 기도 인산화 효율이 K와 유사할 것으로 기대되었으나 상대적으로 낮게 나왔다. 본 연구 결과는 기존에 보고한 UL97에 의해 인산화되는 펩타이드 들의 P+5 위치에 K가 중요하다는 결과와 일치하였고, A로 치환하였을 경우 그 활성이 거의 사라진다는 것과도 부합하였다. 대부분의 단백질 인산화 효소는 P-3에서 P+3 위치의 특정 아미노산 잔기들이 기질 특이성에 중요한 것으로 보고되었으나 본 연구결과와 기존의 결과에서는 U几97에 의해서 인산화 되는 펩타이드는 P+5 위치에 K를 포함하고 있는 경우 인산화가 잘 되는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구 결과는 기존에 보고한 UL97에 의해 인산화되는 펩타이드 들의 P+5 위치에 K가 중요하다는 결과와 일치하였고, A로 치환하였을 경우 그 활성이 거의 사라진다는 것과도 부합하였다. 대부분의 단백질 인산화 효소는 P-3에서 P+3 위치의 특정 아미노산 잔기들이 기질 특이성에 중요한 것으로 보고되었으나 본 연구결과와 기존의 결과에서는 U几97에 의해서 인산화 되는 펩타이드는 P+5 위치에 K를 포함하고 있는 경우 인산화가 잘 되는 것을 확인할 수 있었다. P+5 위치가 중요하다는 것은 기존에 알려져 있는 인산화 효소에 이미 존재하는 특정 subdomain이 포함 되어 있지 않은 것과 관계가 있을 것이다.

참고문헌 (16)

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Hanks, S. K. and Hunter, T. : Protein kinases 6. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. FASEB J. 9, 576 (1995)

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