본 연구는 돼지 등 가축 사육시 문제가 되는 설사병에 대한 백신 효과를 갖는 사료용 벼를 개발하고자 장내 독소 대장균 유래 LTB 유전자와 Vibrio cholerae 유래 CTB 유전자를 벼 종자에서 발현하도록 형질전환하였다. 설사병에 백신작용을 하는 LTB와 CTB를 고발현하는 벼 형질전환 벡터를 제작하여, 제한효소 절단 및 PCR 증폭으로 확인하였다. pMJ103 벡터에 LTB와 CTB 유전자가 복합 삽입된 ‘일미벼’에서 유래한 25개 이벤트 104개 계통을 획득하여 LTB, CTB와 bar 유전자 primer를 이용한 PCR 검정으로 형질전환체를 확인하였다. 형질전환 개체의 ...
본 연구는 돼지 등 가축 사육시 문제가 되는 설사병에 대한 백신 효과를 갖는 사료용 벼를 개발하고자 장내 독소 대장균 유래 LTB 유전자와 Vibrio cholerae 유래 CTB 유전자를 벼 종자에서 발현하도록 형질전환하였다. 설사병에 백신작용을 하는 LTB와 CTB를 고발현하는 벼 형질전환 벡터를 제작하여, 제한효소 절단 및 PCR 증폭으로 확인하였다. pMJ103 벡터에 LTB와 CTB 유전자가 복합 삽입된 ‘일미벼’에서 유래한 25개 이벤트 104개 계통을 획득하여 LTB, CTB와 bar 유전자 primer를 이용한 PCR 검정으로 형질전환체를 확인하였다. 형질전환 개체의 게놈 DNA에 유전자가 안정적으로 삽입되었음을 Southern blot 분석으로 확인하였으며, T-DNA 주변 염기서열 분석을 통하여 형질전환 벼의 염색체 특정 부위에 삽입되었음을 확인하였다. Southern blot 분석과 T-DNA 주변 염기서열 분석을 통하여 형질전환 벼에 binary vector RB와 LB 사이의 T-DNA 유전자가 1개 또는 2개 이상이 삽입 되었으며, 일부는 T-DNA 외의 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. Bar strip을 이용하여 확인된 T0 형질전환 25개 이벤트는 격리온실 내에서 이앙과 재배 후 제초제(0.3%, 상표명 바스타) 처리에 의한 생물검정을 통하여 형질전환체를 확인하였을 때, 22개 이벤트는 다량의 종자(T1)를 획득하였고, 3개의 이벤트는 불임으로 종자를 얻지 못했다. 형질전환 T1 이벤트의 정상종자 형성율은 대조구 82%에 비하여 T23 이벤트(90.7%)를 제외하고 평균 48.8%로 낮은 경향이었으며, 발아율은 대조구 87.5%에 비하여 T13 이벤트(62%)가 가장 낮았지만 대부분의 이벤트가 80% 이상이었다. 선발 마커로 사용하는 제초제(0.3%, 상표명 바스타)로 형질전환체를 선발한 고정율은 평균 75.7%이었으며, 특히 T22 이벤트는 98.3%의 높은 고정율을 보였다. T1 형질전환 22개 이벤트에 대하여 LTB, CTB와 bar 유전자들의 primer를 이용한 PCR 검정과 reverse transcriptase PCR 검정으로 DNA의 삽입과 RNA의 발현을 확인하였으며, Bar strip으로 선발하고, 격리온실 내에서 이앙과 재배 후 제초제(0.3%, 상표명 바스타) 처리에 의한 생물검정을 통하여 T1 이벤트가 형질전환체로 유지되었음을 확인하였다. LTB 단백질은 세포막 항원 결합 수용체인 GM1-ganglioside와 결합함을 확인하였다. 한편 T05 이벤트는 3번 염색체의 protein kinase-like domain containing protein 유전자 exon 부위에 LTB와 CTB 융합 단백질 유전자가 1개 삽입되었고, 정상종자 형성율은 67.6%, 발아율은 64.6%, 형질전환 고정율은 69.1%이며, 특히 T05-6 이벤트는 전체 용해 단백질(TSP, total soluble proteins) 중에 0.63%의 LTB 단백질이 발현되었다. T07 이벤트는 6번 염색체의 Os06g0101800 유전자와 Os06g0102100 유전자 사이에 LTB와 CTB 유전자 1개가 벼의 다른 유전자를 방해하지 않고 삽입되었고, 정상종자 형성율은 63.9%, 발아율은 92.5%, 형질전환 고정율은 83.3%이며, TSP 중에 0.07%의 LTB 단백질이 발현되었다. T10 이벤트는 2번 염색체의 Os02g0100800 유전자와 Os02g0101000 유전자 사이에 LTB와 CTB 유전자 1개가 삽입되었고, 정상종자 형성율은 70.3%, 발아율은 81.3%, 형질전환 고정율은 80.0%이며, TSP 중에 0.09%의 LTB 단백질이 발현되었다. T14 이벤트는 복제 수가 2개인 이벤트로 정상종자 형성율은 60.0%, 발아율은 81.3%, 형질전환 고정율은 89.9%이며, TSP 중에 0.18%의 LTB 단백질이 발현되었다. 따라서, 가축의 설사병을 예방하고자 LTB와 CTB 유전자를 형질전환한 T1 22개 이벤트 중에서 LTB 백신 단백질 함량이 높으며 다른 유전자를 방해하지 않고 벼 염색체에 안정적으로 삽입된 2 계통(T07, T10)을 선발하였다.
본 연구는 돼지 등 가축 사육시 문제가 되는 설사병에 대한 백신 효과를 갖는 사료용 벼를 개발하고자 장내 독소 대장균 유래 LTB 유전자와 Vibrio cholerae 유래 CTB 유전자를 벼 종자에서 발현하도록 형질전환하였다. 설사병에 백신작용을 하는 LTB와 CTB를 고발현하는 벼 형질전환 벡터를 제작하여, 제한효소 절단 및 PCR 증폭으로 확인하였다. pMJ103 벡터에 LTB와 CTB 유전자가 복합 삽입된 ‘일미벼’에서 유래한 25개 이벤트 104개 계통을 획득하여 LTB, CTB와 bar 유전자 primer를 이용한 PCR 검정으로 형질전환체를 확인하였다. 형질전환 개체의 게놈 DNA에 유전자가 안정적으로 삽입되었음을 Southern blot 분석으로 확인하였으며, T-DNA 주변 염기서열 분석을 통하여 형질전환 벼의 염색체 특정 부위에 삽입되었음을 확인하였다. Southern blot 분석과 T-DNA 주변 염기서열 분석을 통하여 형질전환 벼에 binary vector RB와 LB 사이의 T-DNA 유전자가 1개 또는 2개 이상이 삽입 되었으며, 일부는 T-DNA 외의 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. Bar strip을 이용하여 확인된 T0 형질전환 25개 이벤트는 격리온실 내에서 이앙과 재배 후 제초제(0.3%, 상표명 바스타) 처리에 의한 생물검정을 통하여 형질전환체를 확인하였을 때, 22개 이벤트는 다량의 종자(T1)를 획득하였고, 3개의 이벤트는 불임으로 종자를 얻지 못했다. 형질전환 T1 이벤트의 정상종자 형성율은 대조구 82%에 비하여 T23 이벤트(90.7%)를 제외하고 평균 48.8%로 낮은 경향이었으며, 발아율은 대조구 87.5%에 비하여 T13 이벤트(62%)가 가장 낮았지만 대부분의 이벤트가 80% 이상이었다. 선발 마커로 사용하는 제초제(0.3%, 상표명 바스타)로 형질전환체를 선발한 고정율은 평균 75.7%이었으며, 특히 T22 이벤트는 98.3%의 높은 고정율을 보였다. T1 형질전환 22개 이벤트에 대하여 LTB, CTB와 bar 유전자들의 primer를 이용한 PCR 검정과 reverse transcriptase PCR 검정으로 DNA의 삽입과 RNA의 발현을 확인하였으며, Bar strip으로 선발하고, 격리온실 내에서 이앙과 재배 후 제초제(0.3%, 상표명 바스타) 처리에 의한 생물검정을 통하여 T1 이벤트가 형질전환체로 유지되었음을 확인하였다. LTB 단백질은 세포막 항원 결합 수용체인 GM1-ganglioside와 결합함을 확인하였다. 한편 T05 이벤트는 3번 염색체의 protein kinase-like domain containing protein 유전자 exon 부위에 LTB와 CTB 융합 단백질 유전자가 1개 삽입되었고, 정상종자 형성율은 67.6%, 발아율은 64.6%, 형질전환 고정율은 69.1%이며, 특히 T05-6 이벤트는 전체 용해 단백질(TSP, total soluble proteins) 중에 0.63%의 LTB 단백질이 발현되었다. T07 이벤트는 6번 염색체의 Os06g0101800 유전자와 Os06g0102100 유전자 사이에 LTB와 CTB 유전자 1개가 벼의 다른 유전자를 방해하지 않고 삽입되었고, 정상종자 형성율은 63.9%, 발아율은 92.5%, 형질전환 고정율은 83.3%이며, TSP 중에 0.07%의 LTB 단백질이 발현되었다. T10 이벤트는 2번 염색체의 Os02g0100800 유전자와 Os02g0101000 유전자 사이에 LTB와 CTB 유전자 1개가 삽입되었고, 정상종자 형성율은 70.3%, 발아율은 81.3%, 형질전환 고정율은 80.0%이며, TSP 중에 0.09%의 LTB 단백질이 발현되었다. T14 이벤트는 복제 수가 2개인 이벤트로 정상종자 형성율은 60.0%, 발아율은 81.3%, 형질전환 고정율은 89.9%이며, TSP 중에 0.18%의 LTB 단백질이 발현되었다. 따라서, 가축의 설사병을 예방하고자 LTB와 CTB 유전자를 형질전환한 T1 22개 이벤트 중에서 LTB 백신 단백질 함량이 높으며 다른 유전자를 방해하지 않고 벼 염색체에 안정적으로 삽입된 2 계통(T07, T10)을 선발하였다.
We constructed an over-expression binary vector producing the functional heat-labile enterotoxin (LTB) subunit of Escherichia coli and cholera toxin of Vibrio cholerae (CTB) in transgenic rice seeds. We confirmed the insertion of two genes in the binary vector for rice transformation by restriction ...
We constructed an over-expression binary vector producing the functional heat-labile enterotoxin (LTB) subunit of Escherichia coli and cholera toxin of Vibrio cholerae (CTB) in transgenic rice seeds. We confirmed the insertion of two genes in the binary vector for rice transformation by restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction. Both LTB and CTB genes showed 82.3% and 80.2% homologies in nucleotide and amino acids sequences, respectively. We produced the transgenic rice plants of twenty-fives events including 104 lines. The stable integration of the LTB, CTB and bar genes into the rice nuclear genome was confirmed by PCR analyses. Also, the stable integration of the LTB gene into the rice nuclear genome was verified by Southern blot analyses. Through the analyses of flanking regions, we identified the integration sites in chromosomes of transgenic rices. Bar strip test and Western blot analyses for T1 rice showed that PAT and LTB proteins were expressed in transgenic rice seeds. The number of developed seed in transgenic rices showed the decrease compared to that of wild type rice, but germination rate was similar to that of wild type rice. The survival ratio of transgenic rice plants treated by Basta herbicide was over 60%. And we made sure that twenty-two events of transgenic T1 plants were the transformants containing LTB, CTB and bar genes using analyses of PCR, reverse-transcriptase PCR, Bar strip and 0.3% basta treatment. GM1-ganglioside binding assays showed that recommbinant LTB proteins produced in transgenic rice plants could bind to the intestinal membrane GM1-ganglioside receptor, indicating correct folding and disulfide bond formation of LTB pentamers within transgenic rice. We proved transgenic T05 event that one copy of LTB and CTB genes were integrated within exon site of protein kinase-like domain containing protein gene existing in rice chromosome 3. Also, the transgenic T05 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (67.6%), the rate of germination (64.6%) and the ratio of the fixed transgenic plants (69.1%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.63% of the total soluble proteins in T05-6 events. We proved transgenic T07 event that one copy of LTB and CTB genes were integrated between Os06g0101800 gene and Os06g0102100 gene existing in rice chromosome 6. Also, the transgenic T07 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (63.9%), the rate of germination (92.5%) and the ratio of the fixed transgenic plants (83.3%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.63% of the total soluble proteins. We proved transgenic T10 event that one copy of LTB and CTB genes were integrated between Os02g0100800 gene and Os02g0101000 gene existing in rice chromosome 2. Also, the transgenic T10 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (70.3%), the rate of germination (81.3%) and the ratio of the fixed transgenic plants (80.0%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.09% of the total soluble proteins. We proved transgenic T14 event that two copies of LTB and CTB genes were integrated into rice chromosome. Also, the transgenic T14 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (60.0%), the rate of germination (81.3%) and the ratio of the fixed transgenic plants (89.9%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.18% of the total soluble proteins. Transgenic rice obtained from this study could be used for increase of immunity and prevention of bacterial diarrhea of feeding animals.
We constructed an over-expression binary vector producing the functional heat-labile enterotoxin (LTB) subunit of Escherichia coli and cholera toxin of Vibrio cholerae (CTB) in transgenic rice seeds. We confirmed the insertion of two genes in the binary vector for rice transformation by restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction. Both LTB and CTB genes showed 82.3% and 80.2% homologies in nucleotide and amino acids sequences, respectively. We produced the transgenic rice plants of twenty-fives events including 104 lines. The stable integration of the LTB, CTB and bar genes into the rice nuclear genome was confirmed by PCR analyses. Also, the stable integration of the LTB gene into the rice nuclear genome was verified by Southern blot analyses. Through the analyses of flanking regions, we identified the integration sites in chromosomes of transgenic rices. Bar strip test and Western blot analyses for T1 rice showed that PAT and LTB proteins were expressed in transgenic rice seeds. The number of developed seed in transgenic rices showed the decrease compared to that of wild type rice, but germination rate was similar to that of wild type rice. The survival ratio of transgenic rice plants treated by Basta herbicide was over 60%. And we made sure that twenty-two events of transgenic T1 plants were the transformants containing LTB, CTB and bar genes using analyses of PCR, reverse-transcriptase PCR, Bar strip and 0.3% basta treatment. GM1-ganglioside binding assays showed that recommbinant LTB proteins produced in transgenic rice plants could bind to the intestinal membrane GM1-ganglioside receptor, indicating correct folding and disulfide bond formation of LTB pentamers within transgenic rice. We proved transgenic T05 event that one copy of LTB and CTB genes were integrated within exon site of protein kinase-like domain containing protein gene existing in rice chromosome 3. Also, the transgenic T05 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (67.6%), the rate of germination (64.6%) and the ratio of the fixed transgenic plants (69.1%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.63% of the total soluble proteins in T05-6 events. We proved transgenic T07 event that one copy of LTB and CTB genes were integrated between Os06g0101800 gene and Os06g0102100 gene existing in rice chromosome 6. Also, the transgenic T07 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (63.9%), the rate of germination (92.5%) and the ratio of the fixed transgenic plants (83.3%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.63% of the total soluble proteins. We proved transgenic T10 event that one copy of LTB and CTB genes were integrated between Os02g0100800 gene and Os02g0101000 gene existing in rice chromosome 2. Also, the transgenic T10 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (70.3%), the rate of germination (81.3%) and the ratio of the fixed transgenic plants (80.0%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.09% of the total soluble proteins. We proved transgenic T14 event that two copies of LTB and CTB genes were integrated into rice chromosome. Also, the transgenic T14 event was propertied as follows: the ratio of seeds harvested (60.0%), the rate of germination (81.3%) and the ratio of the fixed transgenic plants (89.9%). Especially, the level of expression of LTB proteins in the seeds of transgenic plants was approximately 0.18% of the total soluble proteins. Transgenic rice obtained from this study could be used for increase of immunity and prevention of bacterial diarrhea of feeding animals.
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