[논문]감미단백질 관련 브라제인, 타우마틴 및 미라쿨린 유전자를 이용한 형질전환 상추 육성 및 발현분석

정여진; 강권규

doi:10.5010/jpb.2018.45.3.257

[국내논문] 감미단백질 관련 브라제인, 타우마틴 및 미라쿨린 유전자를 이용한 형질전환 상추 육성 및 발현분석
Stable expression and characterization of brazzein, thaumatin and miraculin genes related to sweet protein in transgenic lettuce 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.45 no.3, 2018년, pp.257 - 265

정여진 (국립한경대학교 원예생명과학과) , 강권규 (국립한경대학교 원예생명과학과)

초록
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감미료(sweetener)는 단맛을 느끼게 하는 첨가물 중 하나로 인공감미료와 설탕이 대표적이며, 단맛의 특성을 지닌 감미 단백질도 잘 알려져 있다. 본 연구는 천연 감미 단백질, brazzein, thaumatin 및 miraculin의 안정적인 생산을 위해 Agrobacterium방법으로 상추 세포를 형질 전환시켰다. 감미 단백질을 코딩하는 합성 유전자들은 상시적으로 발현하는 프로모터의 제어 하에 상추에 형질전환 하였다. 형질전환한 잎을 이용하여 RT-PCR 및 Western blot 분석을 실시한 결과 감미 단백질이 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다. 형질전환 상추에서 발현한 단백질은 단맛을 유발하는 단백질 활성을 가지고 있었다. 이러한 결과는 유전자 재조합 감미 단백질들은 형질전환한 상추에 잘 발현된 것을 보여 주며, 이들 생산 시스템은 식물로부터 감미단백질 생산을 위한 좋은 대안이 될 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Sweetener is one of the additives that makes you feel sweet. Artificial sweeteners and sugar are typical examples, and sweetness proteins with sweetness characteristics have been widely studied. These studies elucidated the transformation lettuce cells with Agrobacterium method for stable production of natural sweet proteins, brazzein, thaumatin, and miraculin. In this paper, we report use of a plant expression system for production of sweet proteins. A synthetic gene encoding sweet proteins was placed under the control of constitutive promoters and transferred to lettuce. High and genetically stable expression of sweetener was confirmed in leaves by RT-PCR and Western blot analysis. Sweet proteins expressed in transgenic lettuce had sweetness-inducing activity. Results demonstrate recombinant sweet proteins correctly processed in transgenic lettuce plants, and that this production system could be a viable alternative to production from the native plant.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 천연 유래 과실에서 생산하는 감미단백질을 당과 인공 감미료의 대체 방안으로 생각하고 감미단백질을 상추에 도입한 후 발현 여부를 분석하여 안정적 발현하는 계통을 육성하고자 하였다. 과실에서 생산하는 천연 감미단백질의 양은 매우 적으며 재배에도 어렵기 때문에 형질전환방법을 사용한 대체 생산 시스템을 이용하여 대량생산의 가능성을 검토하고자 하였다. 식물 발현 시스템은 형질전환 후대 종자의 유용단백질의 안정적 발현과 장기간 보관이 가능하며, 식물세포는 박테리아에서 볼 수 없는 글리코실화 반응과 같은 복잡한 단백질 번역 후 변형 (Post-translational modification)이 잘 일어나지 않아 유용물질 생산에 가치가 있다고 보고된다(Lamphear et al.
이상의 결과로부터 얻어진 brazzein, thaumatin 및 miraculin 단백질 생산 형질전환체는 감미단백질 생산이 가능하고 산업적으로 이용 가능한 계통으로 사료된다. 따라서 본 연구는 형질전환 상추로부터 감미단백질 생산 가능성을 확인하였고, 향후 이들 식물체를 이용하여 homo 후대계통 육성 및 감미단백질의 생산에 이용하고자 한다.
2016). 따라서 본 연구에서는 천연 유래 과실에서 생산하는 감미단백질을 당과 인공 감미료의 대체 방안으로 생각하고 감미단백질을 상추에 도입한 후 발현 여부를 분석하여 안정적 발현하는 계통을 육성하고자 하였다. 과실에서 생산하는 천연 감미단백질의 양은 매우 적으며 재배에도 어렵기 때문에 형질전환방법을 사용한 대체 생산 시스템을 이용하여 대량생산의 가능성을 검토하고자 하였다.
2018). 본 연구에서는 감미단백질의 이용 가능성을 높이기 위해 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자를 식물에 도입하여 얻어진 형질전환 상추로부터 유전자의 안정적 발현 및 후대 육성을 수행하였다. 또한 도입 유전자마다 감미단백질의 발현이 가장 높은 계통을 선발하고 후대 종자를 확보하였다.

제안 방법

각각의 유전자 말단에는 FLAG-tag를 부착하여 형질전환 된 식물에서 단백질의 발현을 검출하는데 사용하였다. Brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자를 상추 게놈에 도입시키기 위한 식물형질전환용Ti-plasmid 벡터는 2 x CaMV 35S 프로모터 하에 유전자의 발현이 조절되도록 하고, 선발 마커로 bar 유전자를 사용하여 구축하였다. 이렇게 구축된 식물발현 벡터는 A.
Brazzein, thaumatin, miraculin 유전자의 도입 여부 확인은 재분화된 상추 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR분석을 실시하여 확인하였다. 이때 사용한 primer set는 Table 1과 같이 bar-fw 및 nos-rv로 제작하여 95℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 58℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 실시하여 분석하였다.
각각의 brazzein, thaumatin, miraculin 라인으로부터 동일한 양의 총 단백질 20 µg/lane을 12% SDS polyacrylamide gels에서 분리하고(Laemmli, 1970), semi-dry transfer (5 mA /m2, 15분)에 의해 PVDF membrane (Bio-Rad, Korea)으로 옮겼다. FLAG HRP anti-flag을 1차 항체(1 : 1000, v/v)로 사용하고, anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase (Roche, Korea)를 2차항체(1 : 3000, v/v)로 사용 하여 검출하였다.
또한 정량적 실시간 PCR 실험을 위해, SuperScript^TMIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하였다. PCR 반응을 위해, 반응 성분의 마스터 믹스를 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 제조하였다. Thermocycling 및 형광 검출을 Illumina's Eco Real-Time PCR System (Illumina, Inc.
PCR 반응은 94℃에서 4분간 pre-denaturation 시킨 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 실시하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel상에 영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여band를 확인하였다. RT-PCR 결과를 입증하기 위해, 독립적으로 제조된 total RNA를 이용하여 2회 실험을 반복하였다.
5% agarose gel상에 영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여band를 확인하였다. RT-PCR 결과를 입증하기 위해, 독립적으로 제조된 total RNA를 이용하여 2회 실험을 반복하였다. 또한 정량적 실시간 PCR 실험을 위해, SuperScript^TMIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하였다.
Thermocycling 및 형광 검출을 Illumina's Eco Real-Time PCR System (Illumina, Inc. California, U.S.A.)을 이용하여 수행하였다.
도입 유전자의 발현분석은 형질전환 상추로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR과 qRT-PCR 분석을 통하여 수행하였다. Total RNA는 FavorPrepTMPlantTotal RNAMiniKit (Favorgen, Korea)를 사용하여 분리하였고, IncloneTMOne-stepRT-PCRkit (IncloneBiotech, Korea)를 사용하여 total RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. PCR 반응은 94℃에서 4분간 pre-denaturation 시킨 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 실시하였다.
감염 후, acetosyringone이 첨가된 pre-culture배지에 계대하여 25℃ 에서 2일간 암 배양으로 co-culture 하여 유전자 도입을 유도하였다. co-culture 후에는 감염된 잎 절편을 NAA 0.1 mg/L^-1, Kinetin 0.5 mg/L^-1, PPT 3 mg/L^-1, cefotaxime 300 mg/L^-1 을 포함한 MS고체 선발배지에 계대하고 25℃에서 명 배양하여 bar 유전자에 내성이 있는 신초를 유도 하며 2주마다 계대배양하였다. 한달 후, 잎절편으로부터 유도된 재분화 개체는 MS hormone free배지에 이식하여 뿌리를 유도하고 뿌리가 형성된 형질전환 상추는 포트에 이식하여 순화시켰다.
1). 각각의 유전자 말단에는 FLAG-tag를 부착하여 형질전환 된 식물에서 단백질의 발현을 검출하는데 사용하였다. Brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자를 상추 게놈에 도입시키기 위한 식물형질전환용Ti-plasmid 벡터는 2 x CaMV 35S 프로모터 하에 유전자의 발현이 조절되도록 하고, 선발 마커로 bar 유전자를 사용하여 구축하였다.
감미단백질 유전자가 안정적으로 발현하는 형질전환 상추(B1, B2, B3, T1, T2 및 M1)에서 각각의 유전자가 single copy로 도입된 개체를 효율적으로 선발하기 위하여 이들 개체로부터 후대육성을 통하여 T1세대 종자를 획득하였으며, T1세대에서 basta처리를 통하여 저항성과 감수성을 선발하여 카이자승 검정(Chi-square analysis)을 실시하였다(Table 2). 그 결과 멘델의 법칙에 맞게 brazzein 유전자가 single copy 로 도입 된 개체는 B1과 B2 식물체로 2개체를 선발하였고, thaumatin 및 miraculin 유전자가 single copy 로 도입된 개체는 T1과 M1 식물체로 각각 1개체씩 선발하였다(Table 2).
7)에 10분간 감염시켰다. 감염 후, acetosyringone이 첨가된 pre-culture배지에 계대하여 25℃ 에서 2일간 암 배양으로 co-culture 하여 유전자 도입을 유도하였다. co-culture 후에는 감염된 잎 절편을 NAA 0.
단백질 추출은 brazzein, thaumatin, miraculin 유전자가 도입되어 mRNA의 발현량이 높은 형질전환체와 wild type 의 잎으로부터 extraction buffer 2.0M KPO4 (pH 7.8), 0.5M EDTA, Triton X-100, 1.0M dithiothreitol (DTT), 80% glycerol and dH2O 200 µl를 사용하여 총 단백질을 추출 하였다.
도입 유전자의 발현분석은 형질전환 상추로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR과 qRT-PCR 분석을 통하여 수행하였다. Total RNA는 FavorPrepTMPlantTotal RNAMiniKit (Favorgen, Korea)를 사용하여 분리하였고, IncloneTMOne-stepRT-PCRkit (IncloneBiotech, Korea)를 사용하여 total RNA로부터 cDNA를 합성 하였다.
도입유전자들로부터 재분화한 총9개의 상추 잎을 이용하여 각각 DNA를 추출한 후, 유전자 도입 여부 확인은 bar 유전자와 nos 터미네이터 영역의 프라이머를 작성하여 PCR 분석을 수행하였다(Table 1). 그 결과 WT에 비하여 9개의 재분화 식물체에서 PCR가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 감미단백질의 이용 가능성을 높이기 위해 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자를 식물에 도입하여 얻어진 형질전환 상추로부터 유전자의 안정적 발현 및 후대 육성을 수행하였다. 또한 도입 유전자마다 감미단백질의 발현이 가장 높은 계통을 선발하고 후대 종자를 확보하였다. 이들 계통은 감미단백질의 높은 생산을 위한 대량 생산 시스템을 구축하는데 이용 가능 할 것으로 생각되며, 향후 본 계통을 이용하여 탱크배양용 세포주 육 성 및 양약 재배용 상추 육종 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.
RT-PCR 결과를 입증하기 위해, 독립적으로 제조된 total RNA를 이용하여 2회 실험을 반복하였다. 또한 정량적 실시간 PCR 실험을 위해, SuperScript^TMIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하였다. PCR 반응을 위해, 반응 성분의 마스터 믹스를 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 제조하였다.
상추(Lactuca sativa L. cv. Green Skirt, 청치마) 종자는 70% EtOH로 30초간 소독한 뒤 tween 20이 첨가된 1% sodium hypochlorite를 사용하여 15분간 표면 살균을 하였다. 그 후, 멸균수로 3회 수세한 후 1/2 MS 고체배지에 치상하고, 16일장의 광조건(25 ± 1℃, 16h day/8h dark)에서 발아를 유도 시켰다.
상추의 자엽절편은 NAA 0.1 mg/L^-1, Kinetin 0.5 mg/L^-1 을 포함한 MS고체배지에서 2일간 pre-culture 한 후, Agrobacterium tumefaciens EHA105 (OD₆₀₀=0.5-0.7)에 10분간 감염시켰다. 감염 후, acetosyringone이 첨가된 pre-culture배지에 계대하여 25℃ 에서 2일간 암 배양으로 co-culture 하여 유전자 도입을 유도하였다.
따라서 안정적으로 단백질 생산을 위해서는 유전자 고효율 발현 시스템을 이용한 재조합변이세포 또는 식물체를 육성하여, 안정적으로 주년 생산 할 수 있는 탱크 배양 및 양액 재배 시스템 개발이 절실히 필요하다고 하였다(Faus 2000; Masuda and Kitabatake 2006). 이 일환으로 본 연구에서는 먼저 몇몇 감미단백질에 관련된 유전자를 고 발현 프로모터 하에서 생산 가능하도록 벡터를 구축하고, Agrobacterium 방법을 통해 상추 세포에 T-DNA를 삽입시켜 안정적 발현 및 후대 종자를 육성하였다.
Brazzein, thaumatin, miraculin 유전자의 도입 여부 확인은 재분화된 상추 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR분석을 실시하여 확인하였다. 이때 사용한 primer set는 Table 1과 같이 bar-fw 및 nos-rv로 제작하여 95℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 58℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 실시하여 분석하였다.
한달 후, 잎절편으로부터 유도된 재분화 개체는 MS hormone free배지에 이식하여 뿌리를 유도하고 뿌리가 형성된 형질전환 상추는 포트에 이식하여 순화시켰다. 이후 이를 이용하여 형질전환체의 유전자 분석에 사용하였다.
합성된 유전자는 brazzein 239 bp, thaumatin 701 bp, miraculin 737 bp로 제한효소를 사용하여 식물과 발현 벡터인 pPZP-3’PinII-Bar Ti-plasmid 벡터에 클로닝하였다.
5). 확인된 9개 형질전환 상추에서 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자의 발현여부 확인은 각각의 잎으로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR 분석과 qRT-PCR 분석으로 수행하였다. 그 결과 WT에 비하여 형질전환 상추에서 유전자가 높게 발현 되고 있음을 확인하였다.

대상 데이터

감염된 자엽절편으로부터 얻어진 재분화 식물체는 총9개체로 brazzein(5개체), thaumatin(3개체) 및 miraculin(1개체)를 확보하였다(Fig. 3). 육성된 T0 형질전환 상추의 생장상을 분석하기 위하여 잎과 줄기, 뿌리의 길이를 분석한 결과는 wild-type (WT)와 유사한 생장양상을 보이는 것을 확인하였다(Fig.
감미단백질 유전자가 안정적으로 발현하는 형질전환 상추(B1, B2, B3, T1, T2 및 M1)에서 각각의 유전자가 single copy로 도입된 개체를 효율적으로 선발하기 위하여 이들 개체로부터 후대육성을 통하여 T1세대 종자를 획득하였으며, T1세대에서 basta처리를 통하여 저항성과 감수성을 선발하여 카이자승 검정(Chi-square analysis)을 실시하였다(Table 2). 그 결과 멘델의 법칙에 맞게 brazzein 유전자가 single copy 로 도입 된 개체는 B1과 B2 식물체로 2개체를 선발하였고, thaumatin 및 miraculin 유전자가 single copy 로 도입된 개체는 T1과 M1 식물체로 각각 1개체씩 선발하였다(Table 2). 이들 식물체로부터 후대육성을 통하여 저항성으로 분리된 homo 및 hetero 선발 개체인 B2-7, T2-14, M1-11은 각각의 감미단백질 유전자가 도입되어 안정적으로 발현하고 있는 것을 확인하였다 (Fig.
Miraculin 유전자가 도입된 형질전환 M1에서도 단백질이 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 연구에서 개발한 형질전환 상추에서 brazzein, thaumatin 및 miraculin 감미단백질이 안정적으로 발현한 것을 선발하여 후대 육성에 사용하였다.
식물 발현용 Ti-plasmid 벡터 구축은 NCBI (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)로부터 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자 정보를 확보하여 제한 효소 XhoI 및 BamHI을 포함하는 염기서열의 합성을 ㈜바이오니아(https://www.bioneer.co.kr/index.php/)에 의뢰하여 진행하였다(Shahina et al. 2016). 합성된 유전자는 brazzein 239 bp, thaumatin 701 bp, miraculin 737 bp로 제한효소를 사용하여 식물과 발현 벡터인 pPZP-3’PinII-Bar Ti-plasmid 벡터에 클로닝하였다.

이론/모형

6). 안정적으로 발현하는 형질전환 9개체로부터 단백질의 발현과 축적 가능성 검토는 western blot 분석을 통하여 수행하였다. 그 결과 형질전환 9개체 모두에서 도입한 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자가 전사 및 번역과정을 걸쳐 안정적으로 단백질 생산을 하고 있는 것으로 나타났다(Fig.
세포 분쇄액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하고 상층액을 수집하여 추가 분석에 사용 하였다. 총 단백질은 Bradford (1976)에 따라 소혈청 알부민을 표준으로 사용하는 Bio-Rad 단백질 염색을 사용하여 검출하였다. 각각의 brazzein, thaumatin, miraculin 라인으로부터 동일한 양의 총 단백질 20 µg/lane을 12% SDS polyacrylamide gels에서 분리하고(Laemmli, 1970), semi-dry transfer (5 mA /m2, 15분)에 의해 PVDF membrane (Bio-Rad, Korea)으로 옮겼다.
형질전환 상추의 단백질 발현 분석은 Western blot 으로 수행하였다. 단백질 추출은 brazzein, thaumatin, miraculin 유전자가 도입되어 mRNA의 발현량이 높은 형질전환체와 wild type 의 잎으로부터 extraction buffer 2.

성능/효과

8). 감미단백질 유전자인 brazzein, thaumatin, miraculin이 도입된 형질전환 상추 후대로부터 안정적으로 발현량이 높은 유전자는 brazzein 유전자가 도입된 식물체로 나타났다 (Fig 8). 이상의 결과로부터 얻어진 brazzein, thaumatin 및 miraculin 단백질 생산 형질전환체는 감미단백질 생산이 가능하고 산업적으로 이용 가능한 계통으로 사료된다.
도입유전자들로부터 재분화한 총9개의 상추 잎을 이용하여 각각 DNA를 추출한 후, 유전자 도입 여부 확인은 bar 유전자와 nos 터미네이터 영역의 프라이머를 작성하여 PCR 분석을 수행하였다(Table 1). 그 결과 WT에 비하여 9개의 재분화 식물체에서 PCR가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 재분화 식물체들은 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자가 각각 상추 게놈에 안정적으로 도입된 것을 확인하였다(Fig.
확인된 9개 형질전환 상추에서 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자의 발현여부 확인은 각각의 잎으로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR 분석과 qRT-PCR 분석으로 수행하였다. 그 결과 WT에 비하여 형질전환 상추에서 유전자가 높게 발현 되고 있음을 확인하였다. 그 중 brazzein에서는 B1, B3 개체와 thaumatin에서는 T2개체, miraculin에서는 M1개체에서 가장 많이 발현하는 것을 확인하였다(Fig.
안정적으로 발현하는 형질전환 9개체로부터 단백질의 발현과 축적 가능성 검토는 western blot 분석을 통하여 수행하였다. 그 결과 형질전환 9개체 모두에서 도입한 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자가 전사 및 번역과정을 걸쳐 안정적으로 단백질 생산을 하고 있는 것으로 나타났다(Fig. 7). Western blot분석으로 검출된 단백질은 기 보고된 천연 brazzein 분자량인 6.
그 결과 WT에 비하여 형질전환 상추에서 유전자가 높게 발현 되고 있음을 확인하였다. 그 중 brazzein에서는 B1, B3 개체와 thaumatin에서는 T2개체, miraculin에서는 M1개체에서 가장 많이 발현하는 것을 확인하였다(Fig. 6). 안정적으로 발현하는 형질전환 9개체로부터 단백질의 발현과 축적 가능성 검토는 western blot 분석을 통하여 수행하였다.
그 결과 WT에 비하여 9개의 재분화 식물체에서 PCR가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 재분화 식물체들은 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자가 각각 상추 게놈에 안정적으로 도입된 것을 확인하였다(Fig. 5). 확인된 9개 형질전환 상추에서 brazzein, thaumatin 및 miraculin 유전자의 발현여부 확인은 각각의 잎으로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR 분석과 qRT-PCR 분석으로 수행하였다.
7). 또한 brazzein 도입 형질 전환 개체 중에서는 B1, B2 및 B3에서 가장 높은 발현을 나타내었고, thaumatin 도입 형질전환 개체에서는 T2에서 높은 발현을 보였다. Miraculin 유전자가 도입된 형질전환 M1에서도 단백질이 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
3). 육성된 T0 형질전환 상추의 생장상을 분석하기 위하여 잎과 줄기, 뿌리의 길이를 분석한 결과는 wild-type (WT)와 유사한 생장양상을 보이는 것을 확인하였다(Fig. 4).
그 결과 멘델의 법칙에 맞게 brazzein 유전자가 single copy 로 도입 된 개체는 B1과 B2 식물체로 2개체를 선발하였고, thaumatin 및 miraculin 유전자가 single copy 로 도입된 개체는 T1과 M1 식물체로 각각 1개체씩 선발하였다(Table 2). 이들 식물체로부터 후대육성을 통하여 저항성으로 분리된 homo 및 hetero 선발 개체인 B2-7, T2-14, M1-11은 각각의 감미단백질 유전자가 도입되어 안정적으로 발현하고 있는 것을 확인하였다 (Fig. 8). 감미단백질 유전자인 brazzein, thaumatin, miraculin이 도입된 형질전환 상추 후대로부터 안정적으로 발현량이 높은 유전자는 brazzein 유전자가 도입된 식물체로 나타났다 (Fig 8).
감미단백질 유전자인 brazzein, thaumatin, miraculin이 도입된 형질전환 상추 후대로부터 안정적으로 발현량이 높은 유전자는 brazzein 유전자가 도입된 식물체로 나타났다 (Fig 8). 이상의 결과로부터 얻어진 brazzein, thaumatin 및 miraculin 단백질 생산 형질전환체는 감미단백질 생산이 가능하고 산업적으로 이용 가능한 계통으로 사료된다. 따라서 본 연구는 형질전환 상추로부터 감미단백질 생산 가능성을 확인하였고, 향후 이들 식물체를 이용하여 homo 후대계통 육성 및 감미단백질의 생산에 이용하고자 한다.

후속연구

또한 도입 유전자마다 감미단백질의 발현이 가장 높은 계통을 선발하고 후대 종자를 확보하였다. 이들 계통은 감미단백질의 높은 생산을 위한 대량 생산 시스템을 구축하는데 이용 가능 할 것으로 생각되며, 향후 본 계통을 이용하여 탱크배양용 세포주 육 성 및 양약 재배용 상추 육종 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Miracullin이 미각수식활성 작용을 할 때에 그 특징은 무엇인가?	Miracullin은 열대식물인 miracle fruit (Synsepalum dulcificum)의 열매에서 추출한당 단백질로 자체로는 단맛은 없지만 신맛을 단맛으로 변화시킬 수 있는 미각수식활성(Taste modifying activity) 작용을 한다고 하였다(Kurihara and Beidler 1968). 이렇게 변형된 단맛은 산의 pH와 신맛에 따라 결정되며, 설탕보다 3,000배 높은 감미도를 가지며, 100°C 이상 가열하면 맛을 변화시키는 성질을 상실한다고 하였다(Faus 2000). 이러한 감미단백질들은 천연감미료로써 매우 높은 평가를 받고 있으나, 과실에서 생산하는 단백질은 한정된 지역 및 계절에 따라 단백질품질이 다르기 때문에 산업적 활용이 극히 제한 적이라고 할수 있다.
	인공감미료의 사용에 따라 발생되는 질환은 무엇인가?	당은 다양한 음식에 필요하며, 설탕과 아세설팜칼륨, 아스파탐 및 사카린 등의 인공감미료를 다량 섭취하는 현대인들에게 고혈압, 당뇨병, 비만 및 치아질환 등을 유발할 수 있다. 또한 이러한 인공감미료의 사용은 방광암, 뇌종양, 심부전 및 정신적 질환과 같은 복합성 질환을 야기한다고 보고되었다(Kant 2005). 따라서 인공 감미료나 설탕 대신에 단맛의 특성을 발휘하거나 미각을 수식할 수 있는 안전하고 건강한 대체 감미료의 연구가 필수적이다(Kant 2005).
	감미료(sweetener)는 무엇인가?	감미료(sweetener)는 단맛을 느끼게 하는 첨가물 중 하나로 인공감미료와 설탕이 대표적이며, 단맛의 특성을 지닌 감미 단백질도 잘 알려져 있다. 본 연구는 천연 감미 단백질, brazzein, thaumatin 및 miraculin의 안정적인 생산을 위해 Agrobacterium방법으로 상추 세포를 형질 전환시켰다.

참고문헌 (46)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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