돌연변이를 이용한 보리 알파-아밀라제 동질효소의 대장균 내 발현 증가 및 효소특성 변화 Highly Enhanced Expression in E. coli and Changes in Enzymatic Properties of Barley α-Amylase Isozymes by Mutagenesis원문보기
보리 맥아로부터 두 종류의 알파-아밀라제 동질효소인 AMY1과 AMY2가 발견되었고, 이들 효소는 서로 다른 등전점(등전점이 낮은 AMY1과 등전점이 높은 AMY2)에 의해 쉽게 구별된다. AMY1과 AMY2 효소는 80%의 높은 아미노산 서열의 상동성과 매우 유사한 3차구조를 가지는 반면에, 그 효소적 특성은 매우 다른 것으로 알려져 있다. 따라서 AMY1과 AMY2 효소에 대한 비교연구는 단백질 구조와 기능의 상관관계를 규명할 수 있는 좋은 모델시스템으로서 그 활용가치가 높을 것으로 기대된다. 그러나, 아직까지 이들 효소 유전자의 대장균에서의 발현도는 극히 낮으며, 이러한 문제가 보리 아밀라제를 이용한 단백질공학적 연구에 큰 제약 요인이 되고 있다. 본 연구를 통해서 흥미롭게도 유도발현의 온도가 이들 효소의 발현에 큰 영향을 미치는 것을 발견하였다. 37도의 배양온도에서 대장균 내 보리 아밀라제 발현도가 매우 낮은 것에 반하여, 15도의 낮은 온도에서 유도발현을 한 경우에는 그 발현도가 현저하게 증가하였다. 결과적으로 본 연구에서는 pET21-a ...
보리 맥아로부터 두 종류의 알파-아밀라제 동질효소인 AMY1과 AMY2가 발견되었고, 이들 효소는 서로 다른 등전점(등전점이 낮은 AMY1과 등전점이 높은 AMY2)에 의해 쉽게 구별된다. AMY1과 AMY2 효소는 80%의 높은 아미노산 서열의 상동성과 매우 유사한 3차구조를 가지는 반면에, 그 효소적 특성은 매우 다른 것으로 알려져 있다. 따라서 AMY1과 AMY2 효소에 대한 비교연구는 단백질 구조와 기능의 상관관계를 규명할 수 있는 좋은 모델시스템으로서 그 활용가치가 높을 것으로 기대된다. 그러나, 아직까지 이들 효소 유전자의 대장균에서의 발현도는 극히 낮으며, 이러한 문제가 보리 아밀라제를 이용한 단백질공학적 연구에 큰 제약 요인이 되고 있다. 본 연구를 통해서 흥미롭게도 유도발현의 온도가 이들 효소의 발현에 큰 영향을 미치는 것을 발견하였다. 37도의 배양온도에서 대장균 내 보리 아밀라제 발현도가 매우 낮은 것에 반하여, 15도의 낮은 온도에서 유도발현을 한 경우에는 그 발현도가 현저하게 증가하였다. 결과적으로 본 연구에서는 pET21-a 벡터의 T7 RAN 중합효소 프로모터를 이용하여 C-말단에 6개의 histidine 잔기가 융합된 아밀라제를 성공적으로 발현하였다. 비록 대장균에서의 아밀라제 효소의 발현도가 매우 향상되었지만, 특히 AMY2의 발현도는 상대적으로 낮은 수준이었다. 효소 활성부위의 (β-α) loop2 내에 위치하는 42번째 alanine 잔기를 치환할 경우, S. cerevisiae에서의 세포외 분비가 증가한다는 선행연구에 근거하여 돌연변이를 실시하고, AMY2와 AMY2-A42P 효소의 발현도를 확인하였다. 결과적으로 A42P의 경우 약 2배의 발현도 향상이 확인되었고, Ni-NTA 크로마토그래피를 통해 쉽게 정제되었다. 최종적으로 AMY1, AMY2, AMY2- A42P의 칼슘의존성과 다양한 전분기질에 대한 가수분해 양상 등을 상호 비교분석하였으며, 각 효소의 특성은 보리나 효모에서 생산된 경우와 매우 유사하였다.
보리 맥아로부터 두 종류의 알파-아밀라제 동질효소인 AMY1과 AMY2가 발견되었고, 이들 효소는 서로 다른 등전점(등전점이 낮은 AMY1과 등전점이 높은 AMY2)에 의해 쉽게 구별된다. AMY1과 AMY2 효소는 80%의 높은 아미노산 서열의 상동성과 매우 유사한 3차구조를 가지는 반면에, 그 효소적 특성은 매우 다른 것으로 알려져 있다. 따라서 AMY1과 AMY2 효소에 대한 비교연구는 단백질 구조와 기능의 상관관계를 규명할 수 있는 좋은 모델시스템으로서 그 활용가치가 높을 것으로 기대된다. 그러나, 아직까지 이들 효소 유전자의 대장균에서의 발현도는 극히 낮으며, 이러한 문제가 보리 아밀라제를 이용한 단백질공학적 연구에 큰 제약 요인이 되고 있다. 본 연구를 통해서 흥미롭게도 유도발현의 온도가 이들 효소의 발현에 큰 영향을 미치는 것을 발견하였다. 37도의 배양온도에서 대장균 내 보리 아밀라제 발현도가 매우 낮은 것에 반하여, 15도의 낮은 온도에서 유도발현을 한 경우에는 그 발현도가 현저하게 증가하였다. 결과적으로 본 연구에서는 pET21-a 벡터의 T7 RAN 중합효소 프로모터를 이용하여 C-말단에 6개의 histidine 잔기가 융합된 아밀라제를 성공적으로 발현하였다. 비록 대장균에서의 아밀라제 효소의 발현도가 매우 향상되었지만, 특히 AMY2의 발현도는 상대적으로 낮은 수준이었다. 효소 활성부위의 (β-α) loop2 내에 위치하는 42번째 alanine 잔기를 치환할 경우, S. cerevisiae에서의 세포외 분비가 증가한다는 선행연구에 근거하여 돌연변이를 실시하고, AMY2와 AMY2-A42P 효소의 발현도를 확인하였다. 결과적으로 A42P의 경우 약 2배의 발현도 향상이 확인되었고, Ni-NTA 크로마토그래피를 통해 쉽게 정제되었다. 최종적으로 AMY1, AMY2, AMY2- A42P의 칼슘의존성과 다양한 전분기질에 대한 가수분해 양상 등을 상호 비교분석하였으며, 각 효소의 특성은 보리나 효모에서 생산된 경우와 매우 유사하였다.
Barley (Hordeum vulgare) malt contains two alpha-amylase isozymes, AMY1 and AMY2, readily distinguished by their isoelectric points of AMY1 (low pI) and AMY2 (high pI). Although barley AMYs share up to 80 % amino acid sequence identity and almost identical three-dimensional structure, their enzymati...
Barley (Hordeum vulgare) malt contains two alpha-amylase isozymes, AMY1 and AMY2, readily distinguished by their isoelectric points of AMY1 (low pI) and AMY2 (high pI). Although barley AMYs share up to 80 % amino acid sequence identity and almost identical three-dimensional structure, their enzymatic properties differ remarkably. Therefore, the comparative investigation of these isozymes may be one of the good candidates to elucidate the relationships between structure and function of proteins. To date, however, both AMY genes have been poorly expressed in recombinant E. coli systems, which has been a major barrier in enzyme engineering approaches for barley AMYs. Interestingly, it was revealed that its expression can be significantly affected by induction temperature. The induction of AMYs at 15℃ remarkably increased their expression level in E. coli, while extremely low productivity at 37℃. As a result, high amount of recombinant AMYs with C-terminal six-histidines were successfully expressed under the control of inducible T7 RNA polymerase promoter in pET-21a. Even though their expression levels highly increased in E. coli, the productivity of AMY2 still remains much lower than that of AMY1. According to the previous report, the 42nd alanine residue located within the (β-α) loop2 of the catalytic (β/α)8-barrel domain may be important in the secretion of AMY in S. cerevisiae. In the present study, expression levels of AMY2 mutant A42P and wild-type AMY2 at 15℃ were compared under the control of IPTG-inducible T7 RNA polymerase promoter. As a result, about 2-times higher amount of recombinant AMY2 A42P was obtained and simply purified via Ni-NTA chromatography. Finally, Calcium-dependency and hydrolysis patterns on various starch-derivatives of AMY1, AMY2, and AMY2-A42P mutant were comparatively examined with each other. Enzymatic characteristics are very similar to those from barley or yeasts.
Barley (Hordeum vulgare) malt contains two alpha-amylase isozymes, AMY1 and AMY2, readily distinguished by their isoelectric points of AMY1 (low pI) and AMY2 (high pI). Although barley AMYs share up to 80 % amino acid sequence identity and almost identical three-dimensional structure, their enzymatic properties differ remarkably. Therefore, the comparative investigation of these isozymes may be one of the good candidates to elucidate the relationships between structure and function of proteins. To date, however, both AMY genes have been poorly expressed in recombinant E. coli systems, which has been a major barrier in enzyme engineering approaches for barley AMYs. Interestingly, it was revealed that its expression can be significantly affected by induction temperature. The induction of AMYs at 15℃ remarkably increased their expression level in E. coli, while extremely low productivity at 37℃. As a result, high amount of recombinant AMYs with C-terminal six-histidines were successfully expressed under the control of inducible T7 RNA polymerase promoter in pET-21a. Even though their expression levels highly increased in E. coli, the productivity of AMY2 still remains much lower than that of AMY1. According to the previous report, the 42nd alanine residue located within the (β-α) loop2 of the catalytic (β/α)8-barrel domain may be important in the secretion of AMY in S. cerevisiae. In the present study, expression levels of AMY2 mutant A42P and wild-type AMY2 at 15℃ were compared under the control of IPTG-inducible T7 RNA polymerase promoter. As a result, about 2-times higher amount of recombinant AMY2 A42P was obtained and simply purified via Ni-NTA chromatography. Finally, Calcium-dependency and hydrolysis patterns on various starch-derivatives of AMY1, AMY2, and AMY2-A42P mutant were comparatively examined with each other. Enzymatic characteristics are very similar to those from barley or yeasts.
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