조직 손상 및 노화의 주요 원인의 일종으로 염증반응이 있으며 체내 염증 과정에서 활성자유종 (reactive radical species)의 일종인 NO는 대식세포와 같은 면역세포에 의해 생성되어 각종 생리 및 병리학적 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS는 그람 음성 박테리아의 세포벽으로부터 유래된 세포내 독소로써 대식세포를 자극시켜 다양한 신호 기작을 활성화 시킴으로써 NO와 PGE2같은 염증 매게 물질을 분비하여 염증을 유발시킨다. 그러나 ...
조직 손상 및 노화의 주요 원인의 일종으로 염증반응이 있으며 체내 염증 과정에서 활성자유종 (reactive radical species)의 일종인 NO는 대식세포와 같은 면역세포에 의해 생성되어 각종 생리 및 병리학적 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS는 그람 음성 박테리아의 세포벽으로부터 유래된 세포내 독소로써 대식세포를 자극시켜 다양한 신호 기작을 활성화 시킴으로써 NO와 PGE2같은 염증 매게 물질을 분비하여 염증을 유발시킨다. 그러나 마크로파지는 HO-1효소를 발현시킴으로써 항산화 작용을 하는 bilirubin, 일산화탄소, 유리철 등을 생성하여 그들 자신을 산화적 스트레스 및 염증으로부터 보호 할 수 있다. 포도는 (Vitis vinifera L.)는 세계적으로 광범위하게 재배되고 있으며 포도주 생산에 가장 많이 이용되고 있으나 국내에서는 식용으로 이용되며 음료 및 주류의 가공에 이용되고 있다. 이런 포도의 가공 공정에서 약 천 톤 정도의 포도씨가 부산물로 배출되는 것으로 추정되지만 포도씨에 대한 활용도는 미비한 실정이다. 포도씨에는 phenol 화합물들이 다량 함유되어 있어 기능성 신소재로 각광받고 있다. 포도씨에 함유된 유용물질들은 심혈관계 질환을 예방하고 항산화작용, 항암작용, 항염증작용 등 여러 가지 생리활성을 지니는 것으로 알려져 있으나 HO-1 효소의 유도에 관한 항염증 기작에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 포도씨의 HO-1의 유도와 항염증 효과를 탐색하기 위하여 NO와 PGE2의 함량과 iNOS, COX-2의 단백질 발현량을 측정하였으며, iNOS mRNA 발현량, NF-κB (p65, p50), IκBα, p-IκBα 단백질 발현량 및 NF-κB transcriptional activity를 측정함으로써 항염증 작용기작을 규명하고자 하였다. 또한 HO-1효소와 이 효소의 저해제, 유도체, 분해산물들을 처리하여 NO생성을 측정함으로써 HO-1효소의 유도와 항염증과의 상관성도 측정해 보았다. 연구 결과 다양한 용매로 추출한 포도씨 추출물 중 LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 methanol과 acetone추출물에서 NO 및 PGE2함량을 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 나타냈으며 유의적인 차이를 보였다. 포도씨 methanol추출물은 acetone 추출물보다 더 효과적인 결과를 나타냈고 세포에 대한 독성 결과를 측정한 결과 본 실험에 사용된 농도 범위에서 (62.5-500 μg/mL) 독성을 나타내지 않았다. 포도씨 methanol추출물과 acetone 추출물을 처리해 보았을 경우 iNOS 단백질 발현의 경우도 농도 의존적으로 저해하는 결과를 나타냈으며 유의성 있는 차이를 나타냈으나 COX-2 단백질 발현은 억제하지 않았다. 따라서 두 포도씨 추출물의 PGE2 생성 저해 효과는 COX-2의 경로에 의한 것이 아니라 다른 경로에 의해 저해된다고 생각된다. 포도씨 추출물이 iNOS 단백질 생합성을 억제하였으므로 전사단계에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Real time RT-PCR를 실행하였고, mRNA 발현량 또한 농도 의존적인 경향을 나타내며 저해하였다. SEAP reporter assay를 실행한 결과 LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 transcriptional activity를 두 포도씨 추출물이 현저히 감소시키는 경향을 나타내었고, 세포질의 IκBα의 인산화를 저해함으로써 전사 요소인 NF-κB p65, p50을 핵속으로 유리시키는 과정을 억제하였다. 이 결과로 두 포도씨 추출물이 전사단계에서 저해 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다. HO-1효소 발현과 항염증 효과와의 관계를 실험한 결과 두 포도씨 추출물이 HO-1효소의 유도체로 작용하여 농도 의존적으로 HO-1효소의 발현량이 증가하는 경향을 보였다. 두 포도씨 추출물과 HO-1효소의 저해제인 ZnPP를 처리하여 NO함량을 측정 한 결과 저해제와 추출물을 동시에 처리하였을 경우 추출물의 저해 효과를 감소시켰고 이로써 항염증 반응경로에서 HO-1이 부분적으로 포도씨의 항염증 효과를 중재한다는 것을 알수 있었다. 또한 HO-1효소의 유도체인 CoPP와 분해산물인 Bilirubin과 RuCO를 처리하였을 경우 LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 포도씨 추출물의 NO함량 저해 효과와 비슷하게 NO생성을 억제하였다. 이 결과로 포도씨 추출물을 처리함에 따른 HO-1효소 발현이 포도씨 추출물의 항염증 기작과 관계된다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과 가공 부산물로 폐기 되거나 사료 원료로 이용되고있는 포도씨는 HO-1효소의 발현 및 우수한 항염증 효과를 나타냄에 따라 만성질환 예방을 위한 기능성식품의 원료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
조직 손상 및 노화의 주요 원인의 일종으로 염증반응이 있으며 체내 염증 과정에서 활성자유종 (reactive radical species)의 일종인 NO는 대식세포와 같은 면역세포에 의해 생성되어 각종 생리 및 병리학적 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS는 그람 음성 박테리아의 세포벽으로부터 유래된 세포내 독소로써 대식세포를 자극시켜 다양한 신호 기작을 활성화 시킴으로써 NO와 PGE2같은 염증 매게 물질을 분비하여 염증을 유발시킨다. 그러나 마크로파지는 HO-1효소를 발현시킴으로써 항산화 작용을 하는 bilirubin, 일산화탄소, 유리철 등을 생성하여 그들 자신을 산화적 스트레스 및 염증으로부터 보호 할 수 있다. 포도는 (Vitis vinifera L.)는 세계적으로 광범위하게 재배되고 있으며 포도주 생산에 가장 많이 이용되고 있으나 국내에서는 식용으로 이용되며 음료 및 주류의 가공에 이용되고 있다. 이런 포도의 가공 공정에서 약 천 톤 정도의 포도씨가 부산물로 배출되는 것으로 추정되지만 포도씨에 대한 활용도는 미비한 실정이다. 포도씨에는 phenol 화합물들이 다량 함유되어 있어 기능성 신소재로 각광받고 있다. 포도씨에 함유된 유용물질들은 심혈관계 질환을 예방하고 항산화작용, 항암작용, 항염증작용 등 여러 가지 생리활성을 지니는 것으로 알려져 있으나 HO-1 효소의 유도에 관한 항염증 기작에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 포도씨의 HO-1의 유도와 항염증 효과를 탐색하기 위하여 NO와 PGE2의 함량과 iNOS, COX-2의 단백질 발현량을 측정하였으며, iNOS mRNA 발현량, NF-κB (p65, p50), IκBα, p-IκBα 단백질 발현량 및 NF-κB transcriptional activity를 측정함으로써 항염증 작용기작을 규명하고자 하였다. 또한 HO-1효소와 이 효소의 저해제, 유도체, 분해산물들을 처리하여 NO생성을 측정함으로써 HO-1효소의 유도와 항염증과의 상관성도 측정해 보았다. 연구 결과 다양한 용매로 추출한 포도씨 추출물 중 LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 methanol과 acetone추출물에서 NO 및 PGE2함량을 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 나타냈으며 유의적인 차이를 보였다. 포도씨 methanol추출물은 acetone 추출물보다 더 효과적인 결과를 나타냈고 세포에 대한 독성 결과를 측정한 결과 본 실험에 사용된 농도 범위에서 (62.5-500 μg/mL) 독성을 나타내지 않았다. 포도씨 methanol추출물과 acetone 추출물을 처리해 보았을 경우 iNOS 단백질 발현의 경우도 농도 의존적으로 저해하는 결과를 나타냈으며 유의성 있는 차이를 나타냈으나 COX-2 단백질 발현은 억제하지 않았다. 따라서 두 포도씨 추출물의 PGE2 생성 저해 효과는 COX-2의 경로에 의한 것이 아니라 다른 경로에 의해 저해된다고 생각된다. 포도씨 추출물이 iNOS 단백질 생합성을 억제하였으므로 전사단계에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Real time RT-PCR를 실행하였고, mRNA 발현량 또한 농도 의존적인 경향을 나타내며 저해하였다. SEAP reporter assay를 실행한 결과 LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 transcriptional activity를 두 포도씨 추출물이 현저히 감소시키는 경향을 나타내었고, 세포질의 IκBα의 인산화를 저해함으로써 전사 요소인 NF-κB p65, p50을 핵속으로 유리시키는 과정을 억제하였다. 이 결과로 두 포도씨 추출물이 전사단계에서 저해 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다. HO-1효소 발현과 항염증 효과와의 관계를 실험한 결과 두 포도씨 추출물이 HO-1효소의 유도체로 작용하여 농도 의존적으로 HO-1효소의 발현량이 증가하는 경향을 보였다. 두 포도씨 추출물과 HO-1효소의 저해제인 ZnPP를 처리하여 NO함량을 측정 한 결과 저해제와 추출물을 동시에 처리하였을 경우 추출물의 저해 효과를 감소시켰고 이로써 항염증 반응경로에서 HO-1이 부분적으로 포도씨의 항염증 효과를 중재한다는 것을 알수 있었다. 또한 HO-1효소의 유도체인 CoPP와 분해산물인 Bilirubin과 RuCO를 처리하였을 경우 LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 포도씨 추출물의 NO함량 저해 효과와 비슷하게 NO생성을 억제하였다. 이 결과로 포도씨 추출물을 처리함에 따른 HO-1효소 발현이 포도씨 추출물의 항염증 기작과 관계된다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과 가공 부산물로 폐기 되거나 사료 원료로 이용되고있는 포도씨는 HO-1효소의 발현 및 우수한 항염증 효과를 나타냄에 따라 만성질환 예방을 위한 기능성식품의 원료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
Lipopolysaccharide (LPS) stimulates macrophages to produce inflammatory mediators, such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2), through activating multiple signaling pathways. Grape seeds are a rich source of phenolic compounds, which has anti-inflammatory and antioxidant activities. There...
Lipopolysaccharide (LPS) stimulates macrophages to produce inflammatory mediators, such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2), through activating multiple signaling pathways. Grape seeds are a rich source of phenolic compounds, which has anti-inflammatory and antioxidant activities. Therefore, we investigated that induction of heme oxygenase-1 (HO-1) modulates in the inhibitory effects of grape seed extracts on anti-inflammatory effect in LPS-induced RAW 264.7 cells. Among the five different extracts, the acetone extracts of grape seeds (GSEA) significantly reduced LPS-induced NO and PGE2 production in a concentration-dependent manner (62.5-500 μg/mL). GSEA also inhibited the expression of inducible NO synthase (iNOS) protein and its mRNA expression, suppressed NF-κB (p65, p50) translocation to the nucleus as well as IκB release resulting in the inhibition of transcriptional activity of NF-κB. We demonstrated that GSEA by itself is a potent inducer of HO-1. Blockage of HO-1 activity by Zinc protoporphyrin, a specific HO-1 inhibitor, suppressed GSEA-induced reductions in the production of NO. Over-expression of HO-1 or exogenous addition of carbon monoxide, a byproduct derived from heme degradation, suppressed LPS-mediated NO production. Our data suggest that GSEA exerts anti-inflammatory effect in macrophages via activation of the HO-1 pathway and helps to elucidate the mechanism underlying the potential therapeutic value of grape seed extracts.
Lipopolysaccharide (LPS) stimulates macrophages to produce inflammatory mediators, such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2), through activating multiple signaling pathways. Grape seeds are a rich source of phenolic compounds, which has anti-inflammatory and antioxidant activities. Therefore, we investigated that induction of heme oxygenase-1 (HO-1) modulates in the inhibitory effects of grape seed extracts on anti-inflammatory effect in LPS-induced RAW 264.7 cells. Among the five different extracts, the acetone extracts of grape seeds (GSEA) significantly reduced LPS-induced NO and PGE2 production in a concentration-dependent manner (62.5-500 μg/mL). GSEA also inhibited the expression of inducible NO synthase (iNOS) protein and its mRNA expression, suppressed NF-κB (p65, p50) translocation to the nucleus as well as IκB release resulting in the inhibition of transcriptional activity of NF-κB. We demonstrated that GSEA by itself is a potent inducer of HO-1. Blockage of HO-1 activity by Zinc protoporphyrin, a specific HO-1 inhibitor, suppressed GSEA-induced reductions in the production of NO. Over-expression of HO-1 or exogenous addition of carbon monoxide, a byproduct derived from heme degradation, suppressed LPS-mediated NO production. Our data suggest that GSEA exerts anti-inflammatory effect in macrophages via activation of the HO-1 pathway and helps to elucidate the mechanism underlying the potential therapeutic value of grape seed extracts.
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