본 연구는 토마토에 함유 되어 있는 tomato glycoalkaloid (TGA)인 α-tomatine과 dehydrotomatine를 alumina column chromatography와 HPLC chromatography를 이용하여 효율적으로 단리하는 방법을 개발하였으며, 토마토의 생육단계과정을 11단계(녹색의 토마토 7단계, 붉게 익어 가는 4단계 과정)로 나누어 채취하여 단계별 토마토에 함유되어 있는 tomatine을 추출하였다. 또한 HPLC로 α-tomatine과 dehydrotomatine을 분리하고 양물질의 함량을 측정하였으며 생육단계별로 추출한 tomatine이 2종류의 정상세포와 3종류의 암세포에 어떠한 영향을 미치는가를 MTT법을 통해 분석하고 tomatine 함량과 암세포성장 저해와의 상관관계를 연구하였다. 1. 토마토에 함유되어 있는 TGA를 산 용매로 추출한 후 alumina column에 부가하고 수포화 n-butanol로 TGA를 분획하였다. 용매유속은 0.5 mL/min 1 fraction(Fr)을 5mL로 분획한 결과 Fr.No.=26～36에서 α-tomatine을 단리 할 수 있었다. 그 결과 동결 건조한 토마토 분말에는 0.414의 α-tomatine이 함유되어 있음을 알 수 있었다. 2. Alumina column chromatography로 분취된 α-tomatine을 HPLC로 분석한 결과 2점의 peak가 검출되었다. 검출된 각각의 peak를 HPLC로 분취하고 산가수 분해처리로 생성된 aglycone과 그 ...
본 연구는 토마토에 함유 되어 있는 tomato glycoalkaloid (TGA)인 α-tomatine과 dehydrotomatine를 alumina column chromatography와 HPLC chromatography를 이용하여 효율적으로 단리하는 방법을 개발하였으며, 토마토의 생육단계과정을 11단계(녹색의 토마토 7단계, 붉게 익어 가는 4단계 과정)로 나누어 채취하여 단계별 토마토에 함유되어 있는 tomatine을 추출하였다. 또한 HPLC로 α-tomatine과 dehydrotomatine을 분리하고 양물질의 함량을 측정하였으며 생육단계별로 추출한 tomatine이 2종류의 정상세포와 3종류의 암세포에 어떠한 영향을 미치는가를 MTT법을 통해 분석하고 tomatine 함량과 암세포성장 저해와의 상관관계를 연구하였다. 1. 토마토에 함유되어 있는 TGA를 산 용매로 추출한 후 alumina column에 부가하고 수포화 n-butanol로 TGA를 분획하였다. 용매유속은 0.5 mL/min 1 fraction(Fr)을 5mL로 분획한 결과 Fr.No.=26～36에서 α-tomatine을 단리 할 수 있었다. 그 결과 동결 건조한 토마토 분말에는 0.414의 α-tomatine이 함유되어 있음을 알 수 있었다. 2. Alumina column chromatography로 분취된 α-tomatine을 HPLC로 분석한 결과 2점의 peak가 검출되었다. 검출된 각각의 peak를 HPLC로 분취하고 산가수 분해처리로 생성된 aglycone과 그 배당체를 GC로 분석한 결과 최초에 검출된 peak는 aglycone인 tomatidenol, 당조성은 xylose, glucose, galactose(Mol비 1:1:2)인 것으로 보아 dehydrotomatine로 동정되었다. 두 번째 peak도 동일한 방법으로 분석한 결과 aglycone은 tomatidine, 당조성은 dehydrotomatine과 동일한 것으로 보아 α-tomatine으로 동정되었다. 본 연구를 통하여 간편한 조작과 저가로 토마토에서 dehydrotomatine과 α-tomatine을 단리가 가능함을 알 수 있다. 3. 7단계의 녹색토마토와 4단계의 적색 토마토에 함유되어 있는 tomatine을 추출하고 암모니아로 석출시켜 건조 총 tomatine 함량( TGA)을 측정한 결과 S1의 작은 녹색 토마토에는 481.60 mL/100 g, S2에는 531.59 mL/100 g로 tomatine이 많이 함유되어 있음을 알 수 있다. 이후 토마토가 성장해 감에 따라 tomatine이 급격하게 감소하였으며 S3를 살펴보니 25.53 mL/100 g으로 S1과 비교해 약 35배의 저하되어 있음을 알 수 있다. 또한 붉게 익어 가는 과정에서는 tomatine이 검출되지 않았다. 4. 토마토로부터 조TGA를 추출하고 HPLC로 분석한 결과 Rt=17.5분에 검출된 peak는 dehydrotomatine, Rt=21.0분에 검출된 peak는 α-tomatine로 동정하였다. 또한 본 실험방법을 통해 dehydrotomatine과 α-tomatine을 분리할 수 있고 30분 내에 분석을 완료할 수 있음을 알 수 있다. 5. 토마토의 생육단계별로 채취한 7단계 시료와 4단계의 붉게 숙성되어가는 토마토 시료의 tomatine함량의 변화를 살펴본 결과 S1(가장 작은 녹색 토마토)은 100g당 dehydrotomatine＋α-tomatine이 409.0 mg으로 가장 많이 함유 되어 있으며 토마토가 비대해 질수록 tomatine 함량이 감소함을 알 수 있다. 또한 토마토 과피 표면이 붉게 변화할수록 tomatine 성분이 검출되지 않음을 알 수 있었다. 6. 사람의 정상 간세포(Chang)및 정상 폐세포(Hel299)의 2종류의 세포와 3종의 임파선종 세포(U937), 간암세포(A549) 경암세포(Hela)에 7단계의 토마토 시료로부터 추출한 건조 TGA를 투여해 세포 성장 억제율을 살펴보았다. 정상세포에 미치는 TGA의 영향은 Chang 및 Hel299 세포 모두 1 uL/mL와 10 uL/mL의 범위에서는 S1～S7의 활성이 낮았고 세포 성장 저해에 큰 영향을 주지 않았다. 한편 암세포 U977, A549 및 Hela에 미치는 TGA의 효과를 검토한 결과 3종류의 암세포에 영향을 주었고 TGA의 농도가 증가할수록 증식 저해력이 증가하였으며 1 uL/mL의 저농도에서도 강한 저해효과가 있음을 알 수 있었다. 7. TGA에 의한 Chang, Hel299, U937, A549 및 Hela 세포의 IC_(50)(50% 저해농도)을 조사한 결과 정상 간세포(Chang)의 IC_(50)을 살펴보니 S3이 IC_(50)=0.89로 가장 저해 농도가 낮고 가장 저해 농도가 높은 것은 S6의 IC_(50)=8.47이였다. 또한 Hel299에는 전체 시료에서 1.55이상의 값을 나타내 Chang보다 IC_(50)의 저해 농도가 높은 것을 알 수 있다. 한편 임파선암세포(U937), 폐암세포(A549) 및 경암세포(Hela)의 종양세포에 관해서 살펴보니 U937의 IC_(50)은 S7이 0.36으로 가장 낮고 다음으로 S6의 0.96이고 가장 IC_(50)가 높은 S5에서 4.11로 나타났다. 또한, A549세포의 IC_(50)은 S1～S7의 단계에서 0.05～0.76의 값을 나타내 강한 세포 성장 억제력이 있음을 알 수 있었다. 8. 토마토 생육단계별에서 단리한 tomatine(%)와 IC_(50)와의 상관관계를 조사한 결과 tomatine의 저농도(S3=10.3%)에서 고농도(S1=84.9%)까지 U937, A549 및 Hela의 종양세포를 효율적으로 저해했다. 특히 S6(38.8％) 및 S1(84.9％)은 정상세포 Chang 및 Hel299에 비교해서 암세포인 A549와 Hela에 강력한 저해효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이 사실은 tomatine이 폐암 및 경암의 세포 증식억제에 유효한 작용을 할 수 있는 가능성을 나타낸 것이라 사료된다.
본 연구는 토마토에 함유 되어 있는 tomato glycoalkaloid (TGA)인 α-tomatine과 dehydrotomatine를 alumina column chromatography와 HPLC chromatography를 이용하여 효율적으로 단리하는 방법을 개발하였으며, 토마토의 생육단계과정을 11단계(녹색의 토마토 7단계, 붉게 익어 가는 4단계 과정)로 나누어 채취하여 단계별 토마토에 함유되어 있는 tomatine을 추출하였다. 또한 HPLC로 α-tomatine과 dehydrotomatine을 분리하고 양물질의 함량을 측정하였으며 생육단계별로 추출한 tomatine이 2종류의 정상세포와 3종류의 암세포에 어떠한 영향을 미치는가를 MTT법을 통해 분석하고 tomatine 함량과 암세포성장 저해와의 상관관계를 연구하였다. 1. 토마토에 함유되어 있는 TGA를 산 용매로 추출한 후 alumina column에 부가하고 수포화 n-butanol로 TGA를 분획하였다. 용매유속은 0.5 mL/min 1 fraction(Fr)을 5mL로 분획한 결과 Fr.No.=26～36에서 α-tomatine을 단리 할 수 있었다. 그 결과 동결 건조한 토마토 분말에는 0.414의 α-tomatine이 함유되어 있음을 알 수 있었다. 2. Alumina column chromatography로 분취된 α-tomatine을 HPLC로 분석한 결과 2점의 peak가 검출되었다. 검출된 각각의 peak를 HPLC로 분취하고 산가수 분해처리로 생성된 aglycone과 그 배당체를 GC로 분석한 결과 최초에 검출된 peak는 aglycone인 tomatidenol, 당조성은 xylose, glucose, galactose(Mol비 1:1:2)인 것으로 보아 dehydrotomatine로 동정되었다. 두 번째 peak도 동일한 방법으로 분석한 결과 aglycone은 tomatidine, 당조성은 dehydrotomatine과 동일한 것으로 보아 α-tomatine으로 동정되었다. 본 연구를 통하여 간편한 조작과 저가로 토마토에서 dehydrotomatine과 α-tomatine을 단리가 가능함을 알 수 있다. 3. 7단계의 녹색토마토와 4단계의 적색 토마토에 함유되어 있는 tomatine을 추출하고 암모니아로 석출시켜 건조 총 tomatine 함량( TGA)을 측정한 결과 S1의 작은 녹색 토마토에는 481.60 mL/100 g, S2에는 531.59 mL/100 g로 tomatine이 많이 함유되어 있음을 알 수 있다. 이후 토마토가 성장해 감에 따라 tomatine이 급격하게 감소하였으며 S3를 살펴보니 25.53 mL/100 g으로 S1과 비교해 약 35배의 저하되어 있음을 알 수 있다. 또한 붉게 익어 가는 과정에서는 tomatine이 검출되지 않았다. 4. 토마토로부터 조TGA를 추출하고 HPLC로 분석한 결과 Rt=17.5분에 검출된 peak는 dehydrotomatine, Rt=21.0분에 검출된 peak는 α-tomatine로 동정하였다. 또한 본 실험방법을 통해 dehydrotomatine과 α-tomatine을 분리할 수 있고 30분 내에 분석을 완료할 수 있음을 알 수 있다. 5. 토마토의 생육단계별로 채취한 7단계 시료와 4단계의 붉게 숙성되어가는 토마토 시료의 tomatine함량의 변화를 살펴본 결과 S1(가장 작은 녹색 토마토)은 100g당 dehydrotomatine＋α-tomatine이 409.0 mg으로 가장 많이 함유 되어 있으며 토마토가 비대해 질수록 tomatine 함량이 감소함을 알 수 있다. 또한 토마토 과피 표면이 붉게 변화할수록 tomatine 성분이 검출되지 않음을 알 수 있었다. 6. 사람의 정상 간세포(Chang)및 정상 폐세포(Hel299)의 2종류의 세포와 3종의 임파선종 세포(U937), 간암세포(A549) 경암세포(Hela)에 7단계의 토마토 시료로부터 추출한 건조 TGA를 투여해 세포 성장 억제율을 살펴보았다. 정상세포에 미치는 TGA의 영향은 Chang 및 Hel299 세포 모두 1 uL/mL와 10 uL/mL의 범위에서는 S1～S7의 활성이 낮았고 세포 성장 저해에 큰 영향을 주지 않았다. 한편 암세포 U977, A549 및 Hela에 미치는 TGA의 효과를 검토한 결과 3종류의 암세포에 영향을 주었고 TGA의 농도가 증가할수록 증식 저해력이 증가하였으며 1 uL/mL의 저농도에서도 강한 저해효과가 있음을 알 수 있었다. 7. TGA에 의한 Chang, Hel299, U937, A549 및 Hela 세포의 IC_(50)(50% 저해농도)을 조사한 결과 정상 간세포(Chang)의 IC_(50)을 살펴보니 S3이 IC_(50)=0.89로 가장 저해 농도가 낮고 가장 저해 농도가 높은 것은 S6의 IC_(50)=8.47이였다. 또한 Hel299에는 전체 시료에서 1.55이상의 값을 나타내 Chang보다 IC_(50)의 저해 농도가 높은 것을 알 수 있다. 한편 임파선암세포(U937), 폐암세포(A549) 및 경암세포(Hela)의 종양세포에 관해서 살펴보니 U937의 IC_(50)은 S7이 0.36으로 가장 낮고 다음으로 S6의 0.96이고 가장 IC_(50)가 높은 S5에서 4.11로 나타났다. 또한, A549세포의 IC_(50)은 S1～S7의 단계에서 0.05～0.76의 값을 나타내 강한 세포 성장 억제력이 있음을 알 수 있었다. 8. 토마토 생육단계별에서 단리한 tomatine(%)와 IC_(50)와의 상관관계를 조사한 결과 tomatine의 저농도(S3=10.3%)에서 고농도(S1=84.9%)까지 U937, A549 및 Hela의 종양세포를 효율적으로 저해했다. 특히 S6(38.8％) 및 S1(84.9％)은 정상세포 Chang 및 Hel299에 비교해서 암세포인 A549와 Hela에 강력한 저해효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이 사실은 tomatine이 폐암 및 경암의 세포 증식억제에 유효한 작용을 할 수 있는 가능성을 나타낸 것이라 사료된다.
In this, study, we developed a new effective method to separate α-tomatine and dehydrotomatine which are tomato glycoalkaloid (TGA) contained in tomato using alumina column chromatography and HPLC chromatography. 1. The TGA contained in tomato was extracted by acid solvent, added in the alumina colu...
In this, study, we developed a new effective method to separate α-tomatine and dehydrotomatine which are tomato glycoalkaloid (TGA) contained in tomato using alumina column chromatography and HPLC chromatography. 1. The TGA contained in tomato was extracted by acid solvent, added in the alumina column, and fractionated by hydrated N-butanol. α-tomatine could be separated from 1 fraction (Fr) per 5 mL at 0.5 mL/min velocity of solvent in the Fr.No.26 to 36. In the result, we found that 0.414% α-tomatine was contained in the freeze dried tomato powder. 2. Two peaks were detected by HPLC analysis of a fractionated α-tomatine using alumina column chromatography. We separated detected two peaks using HPLC and analyzed aglycone and its glycoside produced by acid hydrolysis using GC. The first peak was identified as dehydrotomatine since analyzed aglycone was tomatidenol and sugar composition was xylose, glucose, and galactose (Mol ratio 1:1:2). The second peak was identified as α-tomatine showing aglycone was tomatidine and sugar components was identical with dehydrotomatine. Taken together, dehydrotomatine and α-tomatine could be separated from tomato by simple manipulation at a low price. In Chapter 2, we extracted each tomatine from 11 growth stage-tomatoes (7 growth stage of green tomatoes and 4 stages of ripening red tomatoes), separated α-tomatine and dehydrotomatine, and measured contents of them. In addition, we examined how the extracted tomatine at different stage affects on normal cell lines (Chang, human normal liver cell; Hel299, human normal lung cell) and cancer cell lines (U937, human histiocytic lymphoma cell; A549, human lung cancer cell; Hela, human cervical carcinoma cell) using microculture tetrazolium (MTT) assay and investigated correlation between tomatine contents and inhibitory activity on cancer cell proliferation. 1. We extracted tomatine from 7 stages of red and 4 ones of green tomatoes, eluted using NH3, dried, and measured contents of tomatine (TGA). Tomatine contained in small green tomatoes of S1 was 481.60mL/100g and that of S2 was 531.59mL/100g. As tomato grows up, the contents of tomatine was dramatically declined. Tomatine of S3 (25.53/100g) was 35 folds lower than that of S2. In addition, No tomatine was detected during ripening. 2. We identified a peak at Rt=17.5 min. as dehydrotomatine and one at Rt=21.0 min. as α-tomatine by analysis of extracted crude TGA using HPLC. Dehydrotomatine and α-tomatine could be separated by this method within 30min. 3. We examined the content of tomatine according to growth stages of tomatoes. Tomatine was the most enriched in S1, the smallest green tomato as 409.0 mg of dehydrotomatine plus α-tomatine per 100g. The larger tomato grew up, the more content of tomatine was decreased. The more surface of tomato turned red, the less tomatine was detected. 4. We examined the effects of extracted and dried TGA on inhibition of proliferation in the normal (Chang and Hel229 cells) and cancer cell lines (U937, A549, and Hela cells). The activity of TGA in S1 to S7 samples was weak as 1uL/mL to 10uL/mL and extracted TGA from them did not affect proliferation of normal cells. However, TGA could reduce cell proliferation in U977, A549, and Hela cancer cell lines in a dose-dependent manner and a low concentration of TGA at the level of 1uL/mL still had strong inhibitory activity on the cancer cell proliferation. 5. We examined IC_(50), 50% inhibitory concentration of TGA on normal and cancer cell lines. IC_(50) of S3 was the lowest as IC_(50)=0.89 but that of S6 was the highest as IC_(50)=8.47 on Chang, normal liver cell line. IC_(50) of all samples on Hel299 cell was over 1.55. That means IC_(50) of Hel299 was higher than that of Chang cell lines. In cancer cell lines, IC_(50) of S7 on U937 cell was the lowest as 0.36, that of S6 was 0.96, and that of S5 was the highest as 4.11. In A549 cell lines, IC_(50) of S1 to S7 was 0.05 to 0.76 showing strong inhibitory effects on cell proliferation. 6. We also investigated correlation between separated tomatines (%) and IC_(50). Tomatine at the low to high levels (S3=10.3% to S1=4.9%) could effectively inhibit the nature of U937, A549, and Hela cancer cell lines. S6 (38.8%) and S1 (54.9%) had enhanced inhibitory effect on A549 and Hela cancer cell lines compared to Chang and Hel299 normal cell lines. Taken together, these results suggest that tomatine could inhibit effectively the proliferation of cancer cell.
In this, study, we developed a new effective method to separate α-tomatine and dehydrotomatine which are tomato glycoalkaloid (TGA) contained in tomato using alumina column chromatography and HPLC chromatography. 1. The TGA contained in tomato was extracted by acid solvent, added in the alumina column, and fractionated by hydrated N-butanol. α-tomatine could be separated from 1 fraction (Fr) per 5 mL at 0.5 mL/min velocity of solvent in the Fr.No.26 to 36. In the result, we found that 0.414% α-tomatine was contained in the freeze dried tomato powder. 2. Two peaks were detected by HPLC analysis of a fractionated α-tomatine using alumina column chromatography. We separated detected two peaks using HPLC and analyzed aglycone and its glycoside produced by acid hydrolysis using GC. The first peak was identified as dehydrotomatine since analyzed aglycone was tomatidenol and sugar composition was xylose, glucose, and galactose (Mol ratio 1:1:2). The second peak was identified as α-tomatine showing aglycone was tomatidine and sugar components was identical with dehydrotomatine. Taken together, dehydrotomatine and α-tomatine could be separated from tomato by simple manipulation at a low price. In Chapter 2, we extracted each tomatine from 11 growth stage-tomatoes (7 growth stage of green tomatoes and 4 stages of ripening red tomatoes), separated α-tomatine and dehydrotomatine, and measured contents of them. In addition, we examined how the extracted tomatine at different stage affects on normal cell lines (Chang, human normal liver cell; Hel299, human normal lung cell) and cancer cell lines (U937, human histiocytic lymphoma cell; A549, human lung cancer cell; Hela, human cervical carcinoma cell) using microculture tetrazolium (MTT) assay and investigated correlation between tomatine contents and inhibitory activity on cancer cell proliferation. 1. We extracted tomatine from 7 stages of red and 4 ones of green tomatoes, eluted using NH3, dried, and measured contents of tomatine (TGA). Tomatine contained in small green tomatoes of S1 was 481.60mL/100g and that of S2 was 531.59mL/100g. As tomato grows up, the contents of tomatine was dramatically declined. Tomatine of S3 (25.53/100g) was 35 folds lower than that of S2. In addition, No tomatine was detected during ripening. 2. We identified a peak at Rt=17.5 min. as dehydrotomatine and one at Rt=21.0 min. as α-tomatine by analysis of extracted crude TGA using HPLC. Dehydrotomatine and α-tomatine could be separated by this method within 30min. 3. We examined the content of tomatine according to growth stages of tomatoes. Tomatine was the most enriched in S1, the smallest green tomato as 409.0 mg of dehydrotomatine plus α-tomatine per 100g. The larger tomato grew up, the more content of tomatine was decreased. The more surface of tomato turned red, the less tomatine was detected. 4. We examined the effects of extracted and dried TGA on inhibition of proliferation in the normal (Chang and Hel229 cells) and cancer cell lines (U937, A549, and Hela cells). The activity of TGA in S1 to S7 samples was weak as 1uL/mL to 10uL/mL and extracted TGA from them did not affect proliferation of normal cells. However, TGA could reduce cell proliferation in U977, A549, and Hela cancer cell lines in a dose-dependent manner and a low concentration of TGA at the level of 1uL/mL still had strong inhibitory activity on the cancer cell proliferation. 5. We examined IC_(50), 50% inhibitory concentration of TGA on normal and cancer cell lines. IC_(50) of S3 was the lowest as IC_(50)=0.89 but that of S6 was the highest as IC_(50)=8.47 on Chang, normal liver cell line. IC_(50) of all samples on Hel299 cell was over 1.55. That means IC_(50) of Hel299 was higher than that of Chang cell lines. In cancer cell lines, IC_(50) of S7 on U937 cell was the lowest as 0.36, that of S6 was 0.96, and that of S5 was the highest as 4.11. In A549 cell lines, IC_(50) of S1 to S7 was 0.05 to 0.76 showing strong inhibitory effects on cell proliferation. 6. We also investigated correlation between separated tomatines (%) and IC_(50). Tomatine at the low to high levels (S3=10.3% to S1=4.9%) could effectively inhibit the nature of U937, A549, and Hela cancer cell lines. S6 (38.8%) and S1 (54.9%) had enhanced inhibitory effect on A549 and Hela cancer cell lines compared to Chang and Hel299 normal cell lines. Taken together, these results suggest that tomatine could inhibit effectively the proliferation of cancer cell.
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