암 특이적 과발현 아데노 부속 바이러스 벡터 및 항암 유전자치료제 벡터 개발 Development of cancer-specific over-expression adeno-associated virus (AAV) vectors and anti-tumor gene therapeutic vectors원문보기
유전자치료기술은 유전자결함에 기인한 질환을 치료하기 위해 환자에게 정상적인 유전물질을 도입하여 손상된 유전자 기능을 교정함으로써 질병을 치료하는 기술을 말한다. 따라서 초기에는 주로 인간 유전병을 교정하기 위해 개발되었으나, 현재는 암이나 혈관질환 등 많은 난치성 질환도 유전자의 기능 변화에 기인한다는 보고에 따라 암 치료용 유전자치료제의 임상시험만도 전체의 64.5%를 차지할 정도로 난치성 질환의 근원적 치료 기술로 간주되고 있다. 유전자치료기술 개발 분야는 질환에 따라 유전자치료소재 개발 및 이상적인 유전자전달체 개발 두 부분으로 나뉜다. 이제까지 개발된 많은 유전자전달체 중에서 가장 이상적인 ...
유전자치료기술은 유전자결함에 기인한 질환을 치료하기 위해 환자에게 정상적인 유전물질을 도입하여 손상된 유전자 기능을 교정함으로써 질병을 치료하는 기술을 말한다. 따라서 초기에는 주로 인간 유전병을 교정하기 위해 개발되었으나, 현재는 암이나 혈관질환 등 많은 난치성 질환도 유전자의 기능 변화에 기인한다는 보고에 따라 암 치료용 유전자치료제의 임상시험만도 전체의 64.5%를 차지할 정도로 난치성 질환의 근원적 치료 기술로 간주되고 있다. 유전자치료기술 개발 분야는 질환에 따라 유전자치료소재 개발 및 이상적인 유전자전달체 개발 두 부분으로 나뉜다. 이제까지 개발된 많은 유전자전달체 중에서 가장 이상적인 벡터로 평가되는 것 중 하나는 adeno-associated virus (AAV) 벡터인데, 병원성과 독성이 거의 없고 면역반응이 매우 낮으며 광범위한 세포에 감염이 가능하고 수개월에서 수년까지 장기간 발현이 가능하기 때문인 것으로 알려져 있다. 본 연구팀은 안전성을 확보한 AAV 바이러스 벡터를 이용하여 암조직에 대한 트로피즘이 높은 AAV2를 이용하고 암조직 특이적 과발현을 하는 Protein Regulator of Cytokinesis 1 (PRC1) 프로모터를 함유한 암 치료용 dual targeting 벡터를 개발하여 왔다. 그러나 이 벡터가 in vivo 발현에서는 암조직에서 강한 발현을 하는 반면, 간 조직에서도 어느 정도 발현하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러므로, 본 석사과정 연구에서는 이 dual targeting 벡터를 더욱 조작하여 암조직에서만 과발현하는 프로모터를 함유한 암 치료용 AAV2 벡터를 개발하고자 하였으며, 더 나아가 개발한 암 치료용 AAV 벡터에 세포사멸을 유도하는 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) cDNA를 삽입한 암 치료용 유전자치료제까지 개발하여 효능을 분석하는 것까지를 연구목표로 하였다. 기존에 개발한 PRC1 (1,747-bp) 중 암 조직에서만 강한 발현을 하는 프로모터를 규명하기 위해 PRC1 프로모터의 5‘ 말단부터 순차적으로 삭제한 mutant 프로모터, 즉 M1 (1,156-bp), M2 (923-bp), M3 (563-bp) 및 M4 (461-bp) 삭제변이 프로모터를 리포터 유전자인 루시페라아제 (luciferase cDNA)에 연결하여 in vitro 및 in vivo 활성을 분석하였다. 암조직 특이적 과발현 in vitro 프로모터 활성을 분석하고자 세 종류의 인간 유래 암 세포주 (HCT116, A549 및 HeLa) 및 정상세포주에 5가지 시험군 (rAAV2-PRC1(M1, M2, M3 혹은 M4)-Luc)과 대조군인 rAAV2-CMV-Luc 벡터를 감염시킨 후 루시페라아제 활성을 측정하여 프로모터 활성을 분석하였다. 그 결과, 세 종류 암 세포주에서 M3 > M4 >> M1 > PRC1 > M2 >> CMV 순서로 프로모터 활성을 보였고 정상세포주에서는 CMV 프로모터에 비해 모든 시험군 프로모터가 낮은 활성을 나타내었다. 암 조직 특이적 in vivo 프로모터 활성을 분석하기 위해서는 A549와 HeLa를 이식한 xenograft 마우스 모델 (BALB/c-nu Sic)에 5가지 시험군과 대조군 rAAV2-CMV-Luc 벡터 (1.5x1011 virus particles/mouse)를 미정맥 투여하였고, BLI 분석장비 (Xenogen IVIS 200)를 이용하여 생체 내 유전자 발현 정도를 측정하여 in vivo 프로모터 활성을 분석하였다. 그 결과 in vivo 활성도 in vitro 활성과 유사한 경향을 나타내었다. 위 실험을 토대로 TRAIL cDNA를 함유한 rAAV2-PRC1(혹은 M3)-TRAIL 벡터를 제작하였으며, TRAIL 활성을 높이기 위해 세 종류 cDNA (1～281, 95～281, 혹은 114～281 아미노산 부위의 cDNA)를 만들어 각 벡터에 삽입하여 항암 in vitro 효능을 분석하였다. 암세포주 HeLa에 각 벡터를 감염시키고, 세포사멸 효능을 현미경관찰과 MTT 분석방법을 이용하여 실시한 결과 모든 벡터가 세포사멸 효능이 있는 어느 정도 있는것으로 분석되었고, cDNA 종류에 따라 크게는 70% 이상까지 암세포를 사멸하는 효과를 나타내었다. 본 석사과정 연구를 통해 암조직에 특이적으로 과발현하는 AAV2 벡터를 개발하였고, TRAIL을 함유한 rAAV2 기반 유전자치료제가 암세포를 70% 이상 사멸하는 매우 우수한 치료제가 될 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 현재는 xenograft 모델을 이용하여 TRAIL 벡터의 in vivo 항암 효능을 분석하는 연구를 진행하고 있다.
유전자치료기술은 유전자결함에 기인한 질환을 치료하기 위해 환자에게 정상적인 유전물질을 도입하여 손상된 유전자 기능을 교정함으로써 질병을 치료하는 기술을 말한다. 따라서 초기에는 주로 인간 유전병을 교정하기 위해 개발되었으나, 현재는 암이나 혈관질환 등 많은 난치성 질환도 유전자의 기능 변화에 기인한다는 보고에 따라 암 치료용 유전자치료제의 임상시험만도 전체의 64.5%를 차지할 정도로 난치성 질환의 근원적 치료 기술로 간주되고 있다. 유전자치료기술 개발 분야는 질환에 따라 유전자치료소재 개발 및 이상적인 유전자전달체 개발 두 부분으로 나뉜다. 이제까지 개발된 많은 유전자전달체 중에서 가장 이상적인 벡터로 평가되는 것 중 하나는 adeno-associated virus (AAV) 벡터인데, 병원성과 독성이 거의 없고 면역반응이 매우 낮으며 광범위한 세포에 감염이 가능하고 수개월에서 수년까지 장기간 발현이 가능하기 때문인 것으로 알려져 있다. 본 연구팀은 안전성을 확보한 AAV 바이러스 벡터를 이용하여 암조직에 대한 트로피즘이 높은 AAV2를 이용하고 암조직 특이적 과발현을 하는 Protein Regulator of Cytokinesis 1 (PRC1) 프로모터를 함유한 암 치료용 dual targeting 벡터를 개발하여 왔다. 그러나 이 벡터가 in vivo 발현에서는 암조직에서 강한 발현을 하는 반면, 간 조직에서도 어느 정도 발현하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러므로, 본 석사과정 연구에서는 이 dual targeting 벡터를 더욱 조작하여 암조직에서만 과발현하는 프로모터를 함유한 암 치료용 AAV2 벡터를 개발하고자 하였으며, 더 나아가 개발한 암 치료용 AAV 벡터에 세포사멸을 유도하는 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) cDNA를 삽입한 암 치료용 유전자치료제까지 개발하여 효능을 분석하는 것까지를 연구목표로 하였다. 기존에 개발한 PRC1 (1,747-bp) 중 암 조직에서만 강한 발현을 하는 프로모터를 규명하기 위해 PRC1 프로모터의 5‘ 말단부터 순차적으로 삭제한 mutant 프로모터, 즉 M1 (1,156-bp), M2 (923-bp), M3 (563-bp) 및 M4 (461-bp) 삭제변이 프로모터를 리포터 유전자인 루시페라아제 (luciferase cDNA)에 연결하여 in vitro 및 in vivo 활성을 분석하였다. 암조직 특이적 과발현 in vitro 프로모터 활성을 분석하고자 세 종류의 인간 유래 암 세포주 (HCT116, A549 및 HeLa) 및 정상세포주에 5가지 시험군 (rAAV2-PRC1(M1, M2, M3 혹은 M4)-Luc)과 대조군인 rAAV2-CMV-Luc 벡터를 감염시킨 후 루시페라아제 활성을 측정하여 프로모터 활성을 분석하였다. 그 결과, 세 종류 암 세포주에서 M3 > M4 >> M1 > PRC1 > M2 >> CMV 순서로 프로모터 활성을 보였고 정상세포주에서는 CMV 프로모터에 비해 모든 시험군 프로모터가 낮은 활성을 나타내었다. 암 조직 특이적 in vivo 프로모터 활성을 분석하기 위해서는 A549와 HeLa를 이식한 xenograft 마우스 모델 (BALB/c-nu Sic)에 5가지 시험군과 대조군 rAAV2-CMV-Luc 벡터 (1.5x1011 virus particles/mouse)를 미정맥 투여하였고, BLI 분석장비 (Xenogen IVIS 200)를 이용하여 생체 내 유전자 발현 정도를 측정하여 in vivo 프로모터 활성을 분석하였다. 그 결과 in vivo 활성도 in vitro 활성과 유사한 경향을 나타내었다. 위 실험을 토대로 TRAIL cDNA를 함유한 rAAV2-PRC1(혹은 M3)-TRAIL 벡터를 제작하였으며, TRAIL 활성을 높이기 위해 세 종류 cDNA (1～281, 95～281, 혹은 114～281 아미노산 부위의 cDNA)를 만들어 각 벡터에 삽입하여 항암 in vitro 효능을 분석하였다. 암세포주 HeLa에 각 벡터를 감염시키고, 세포사멸 효능을 현미경관찰과 MTT 분석방법을 이용하여 실시한 결과 모든 벡터가 세포사멸 효능이 있는 어느 정도 있는것으로 분석되었고, cDNA 종류에 따라 크게는 70% 이상까지 암세포를 사멸하는 효과를 나타내었다. 본 석사과정 연구를 통해 암조직에 특이적으로 과발현하는 AAV2 벡터를 개발하였고, TRAIL을 함유한 rAAV2 기반 유전자치료제가 암세포를 70% 이상 사멸하는 매우 우수한 치료제가 될 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 현재는 xenograft 모델을 이용하여 TRAIL 벡터의 in vivo 항암 효능을 분석하는 연구를 진행하고 있다.
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