본 연구에서는 차가버섯 균사체로부터 다양한 방법을 이용하여 최적의 단백다당체 추출 조건과 배양액으로부터 단백다당체를 보다 순수하게 분리, 정제하는 방법을 확립하고자 하였으며, 분리된 단백다당체의 기능기를 FT-IR를 이용하여 확인하였다. 1. 0.2 ㎛를 사용한 경우 여액과 cake의 무게는 각각 8.71 L와 341.8 g으로 균체의 회수율은 75.4%나타냈고, 0.8 ㎛를 사용한 경우 여액과 cake의 무게는 각각 8.99 L와 317.9 g으로 균체의 회수율은 77.6% 나타냈다. 상기 결과로부터 차가버섯 배양액으로부터 균사체 분리 시 0.8 ㎛의 ...
본 연구에서는 차가버섯 균사체로부터 다양한 방법을 이용하여 최적의 단백다당체 추출 조건과 배양액으로부터 단백다당체를 보다 순수하게 분리, 정제하는 방법을 확립하고자 하였으며, 분리된 단백다당체의 기능기를 FT-IR를 이용하여 확인하였다. 1. 0.2 ㎛를 사용한 경우 여액과 cake의 무게는 각각 8.71 L와 341.8 g으로 균체의 회수율은 75.4%나타냈고, 0.8 ㎛를 사용한 경우 여액과 cake의 무게는 각각 8.99 L와 317.9 g으로 균체의 회수율은 77.6% 나타냈다. 상기 결과로부터 차가버섯 배양액으로부터 균사체 분리 시 0.8 ㎛의 여과지를 사용하는 것이 효율적이라고 판단되어진다. 2. 단백다당체를 추출함에 있어 효과적인 추출조건은 열수추출의 경우 온도 100℃와 용매비 1:7.5이었으며 추출시간 2시간경과 후 당과 단백질 함량은 4.5와 4.9%로 가장 높은 값을 나타냈다. 초음파 추출의 경우에는 80℃, 4시간 추출시 당과 단백질 함량은 각각 5.1%과 5.22%로 가장 높은 수치를 나타냈다. 전자파를 이용한 추출은 150℃, 2시간이었으며, 당과 단백질함량이 각각 5.1%과 7.1%로 높게 측정되었다. 80℃에서 3시간 열수추출 하고 남은 잔사를 이용해 2차 추출을 행한 결과, 150℃에서 5시간 추출 시 당과 단백질 함량이 5.6%와 12.4%로 다른 조건에 비해 가장 높게 측정 되었다. 여러 종류(상황, 송이와 차가)의 버섯 자실체와 균사체에 대해 Ultrahydrogel 1000 column을 사용하여 단백다당체를 분석한 실험결과 대략 8.3분에서 단백다당체가 분리됨을 확인할 수 있었다. 3. 다양한 전처리 후 단백다당체 추출을 위해 효소처리와 기계적인 방법 등을 통한 단백다당체의 추출향상을 연구하였다. 효소처리에 의한 최적의 단백다당체 추출 조건은 셀룰라제 효소농도 0.5%로 처리 후 100℃에서 1시간동안 추출된 잔사를 전자파에서 20분 추출한 경우였다. 이러한 결과는 효소를 처리 하지 않은 것보다 단백다당체 추출이 약 1.5배 향상됨을 알 수 있었다. 기계적인 방법으로는 초미세 분쇄기를 이용했을 때 대부분의 균체가 파쇄 됨을 확인 할 수 있었다. 코리아메디(주)의 KMS-200을 이용해 분쇄한 시료는 1차 추출 21.07 mg/g과 2차 전자파 추출 40.96 mg/g으로 총 62.03 mg/g이 추출되었으며, 한국에너지 기술(주)의 HKP-05를 이용해 분쇄한 시료는 1차 추출 25.6 mg/g과 2차 전자파추출 38.16 mg/g으로 총 63.76 mg/g이 추출되어 거의 비슷한 함량을 보였다. 4. 차가버섯 균사체 배양액(EPS)에 존재하는 단백다당체 분리와 농축을 위해 한외여과를 행하였다. 먼저 한계분자량(MWCO)에 따른 단백다당체의 분리와 농축을 위한 실험은 한계분자량이 클수록 TMP는 낮게 측정되며 플럭스가 높고, 농축하는데 요구된 시간도 짧은 것을 알 수 있었다. 그러나 한계분자량이 너무 큰 경우에는 단백다당체가 농축이 되지 않고 여액으로 빠져나와 단백다당체의 분리와 농축에는 적절하지 않음을 확인 할 수 있었다. 따라서 차가버섯 단백다당체 분리와 농축을 위한 적절한 한외여과막의 한계분자량은 농축이 잘 이루어지면서 7.2 psi로 TMP가 낮고 플럭스는 850(g/min․m2으로 높았던 30 kDa이 적합하다 판단되었다. 운전압력에 따른 단백다당체의 분리와 농축을 위한 실험은 압력이 증가할수록 TMP는 낮게 측정되며 플럭스가 높고, 농축하는데 요구된 시간도 짧은 것을 알 수 있었다. 또한 압력이 높아질수록 단백다당체 함량이 미미하게 감소하는 경향을 나타냈는데, 이는 우려할 수준은 아니었다. 따라서 본 연구에 사용된 한외여과 시스템의 경우, 단백다당체 분리와 농축을 위한 적용 압력은 최대 허용압력인 20 psi 보다 낮은 15 psi로 작동하는 것이 효율적이라고 생각되었다. 5. Gel filtration column 크로마토그래피에 의한 단백다당체(EPS)를 분획하기 위하여 Sepharose CL-4B(MWCO; 104-106)를 충전제로 gel filtration을 수행 한 결과, 3개의 peak가 검출되었으며 이를 GPC column을 이용하여 분석한 결과 첫 번째 peak 분획이 표준물질의 단백다당체와 같은 시간대에 검출되어 단백다당체임을 확인할 수 있었다. 그러나 이 컬럼으로는 많은 양의 시료를 분획할 수 없으며 처리시간이 긴 단점이 있어 이를 보완하고자 Shodex(Japan)사의 SB 2000(20 mm×300 mm)을 사용하여 gel filtration을 행하였다. 그 결과 4개의 peak가 검출되었으며 이중 52-97분의 분획이 표준물질의 단백다당체와 같은 시간대에 검출되어 단백다당체임을 확인할 수 있었다. 차가버섯 균사체 배양액으로부터 균체를 분리한 후, gel filtration을 이용한 분획과정 중 각 단계별 단백다당체 수율은 lab-scale에서 규모 확대를 하는데 중요한 변수 중의 하나이다. 원액 중의 단백다당체 함량은 8.62 mg/L이었고, 에탄올 침전과 gel filtration 후의 단백다당체 함량이 각각 8.00mg/L과 7.4 mg/L로 수율은 92.7%에서 89.8%로 비교적 높은 수치를 나타냈다. 6. Gel filtration으로부터 분획된 시료(단백다당체)가 어떤 작용기를 가지고 있는지 알아보기 위해 FT-IR 스펙트럼을 이용하여 실험을 수행하였다. 분석 결과, O-H, C-H, C=O와 CH, C=O bending등 표준물질과 같은 작용기를 가지고 있어 다당체임이 확인되었다. 또한 Vlasta 등은 표고, 영지, 느타리버섯 등 약 70여 종의 버섯에 대한 FT-IR 패턴 연구에서 890 cm-1 영역은 β-glycosidic linkage를 나타내며, 930 cm-1은 α-glycosidic linkage를 나타낸다고 보고하였는데, 본 연구에서 추출한 시료의 경우 두 영역 모두에서 진동이 일어남을 알 수 있었다.
본 연구에서는 차가버섯 균사체로부터 다양한 방법을 이용하여 최적의 단백다당체 추출 조건과 배양액으로부터 단백다당체를 보다 순수하게 분리, 정제하는 방법을 확립하고자 하였으며, 분리된 단백다당체의 기능기를 FT-IR를 이용하여 확인하였다. 1. 0.2 ㎛를 사용한 경우 여액과 cake의 무게는 각각 8.71 L와 341.8 g으로 균체의 회수율은 75.4%나타냈고, 0.8 ㎛를 사용한 경우 여액과 cake의 무게는 각각 8.99 L와 317.9 g으로 균체의 회수율은 77.6% 나타냈다. 상기 결과로부터 차가버섯 배양액으로부터 균사체 분리 시 0.8 ㎛의 여과지를 사용하는 것이 효율적이라고 판단되어진다. 2. 단백다당체를 추출함에 있어 효과적인 추출조건은 열수추출의 경우 온도 100℃와 용매비 1:7.5이었으며 추출시간 2시간경과 후 당과 단백질 함량은 4.5와 4.9%로 가장 높은 값을 나타냈다. 초음파 추출의 경우에는 80℃, 4시간 추출시 당과 단백질 함량은 각각 5.1%과 5.22%로 가장 높은 수치를 나타냈다. 전자파를 이용한 추출은 150℃, 2시간이었으며, 당과 단백질함량이 각각 5.1%과 7.1%로 높게 측정되었다. 80℃에서 3시간 열수추출 하고 남은 잔사를 이용해 2차 추출을 행한 결과, 150℃에서 5시간 추출 시 당과 단백질 함량이 5.6%와 12.4%로 다른 조건에 비해 가장 높게 측정 되었다. 여러 종류(상황, 송이와 차가)의 버섯 자실체와 균사체에 대해 Ultrahydrogel 1000 column을 사용하여 단백다당체를 분석한 실험결과 대략 8.3분에서 단백다당체가 분리됨을 확인할 수 있었다. 3. 다양한 전처리 후 단백다당체 추출을 위해 효소처리와 기계적인 방법 등을 통한 단백다당체의 추출향상을 연구하였다. 효소처리에 의한 최적의 단백다당체 추출 조건은 셀룰라제 효소농도 0.5%로 처리 후 100℃에서 1시간동안 추출된 잔사를 전자파에서 20분 추출한 경우였다. 이러한 결과는 효소를 처리 하지 않은 것보다 단백다당체 추출이 약 1.5배 향상됨을 알 수 있었다. 기계적인 방법으로는 초미세 분쇄기를 이용했을 때 대부분의 균체가 파쇄 됨을 확인 할 수 있었다. 코리아메디(주)의 KMS-200을 이용해 분쇄한 시료는 1차 추출 21.07 mg/g과 2차 전자파 추출 40.96 mg/g으로 총 62.03 mg/g이 추출되었으며, 한국에너지 기술(주)의 HKP-05를 이용해 분쇄한 시료는 1차 추출 25.6 mg/g과 2차 전자파추출 38.16 mg/g으로 총 63.76 mg/g이 추출되어 거의 비슷한 함량을 보였다. 4. 차가버섯 균사체 배양액(EPS)에 존재하는 단백다당체 분리와 농축을 위해 한외여과를 행하였다. 먼저 한계분자량(MWCO)에 따른 단백다당체의 분리와 농축을 위한 실험은 한계분자량이 클수록 TMP는 낮게 측정되며 플럭스가 높고, 농축하는데 요구된 시간도 짧은 것을 알 수 있었다. 그러나 한계분자량이 너무 큰 경우에는 단백다당체가 농축이 되지 않고 여액으로 빠져나와 단백다당체의 분리와 농축에는 적절하지 않음을 확인 할 수 있었다. 따라서 차가버섯 단백다당체 분리와 농축을 위한 적절한 한외여과막의 한계분자량은 농축이 잘 이루어지면서 7.2 psi로 TMP가 낮고 플럭스는 850(g/min․m2으로 높았던 30 kDa이 적합하다 판단되었다. 운전압력에 따른 단백다당체의 분리와 농축을 위한 실험은 압력이 증가할수록 TMP는 낮게 측정되며 플럭스가 높고, 농축하는데 요구된 시간도 짧은 것을 알 수 있었다. 또한 압력이 높아질수록 단백다당체 함량이 미미하게 감소하는 경향을 나타냈는데, 이는 우려할 수준은 아니었다. 따라서 본 연구에 사용된 한외여과 시스템의 경우, 단백다당체 분리와 농축을 위한 적용 압력은 최대 허용압력인 20 psi 보다 낮은 15 psi로 작동하는 것이 효율적이라고 생각되었다. 5. Gel filtration column 크로마토그래피에 의한 단백다당체(EPS)를 분획하기 위하여 Sepharose CL-4B(MWCO; 104-106)를 충전제로 gel filtration을 수행 한 결과, 3개의 peak가 검출되었으며 이를 GPC column을 이용하여 분석한 결과 첫 번째 peak 분획이 표준물질의 단백다당체와 같은 시간대에 검출되어 단백다당체임을 확인할 수 있었다. 그러나 이 컬럼으로는 많은 양의 시료를 분획할 수 없으며 처리시간이 긴 단점이 있어 이를 보완하고자 Shodex(Japan)사의 SB 2000(20 mm×300 mm)을 사용하여 gel filtration을 행하였다. 그 결과 4개의 peak가 검출되었으며 이중 52-97분의 분획이 표준물질의 단백다당체와 같은 시간대에 검출되어 단백다당체임을 확인할 수 있었다. 차가버섯 균사체 배양액으로부터 균체를 분리한 후, gel filtration을 이용한 분획과정 중 각 단계별 단백다당체 수율은 lab-scale에서 규모 확대를 하는데 중요한 변수 중의 하나이다. 원액 중의 단백다당체 함량은 8.62 mg/L이었고, 에탄올 침전과 gel filtration 후의 단백다당체 함량이 각각 8.00mg/L과 7.4 mg/L로 수율은 92.7%에서 89.8%로 비교적 높은 수치를 나타냈다. 6. Gel filtration으로부터 분획된 시료(단백다당체)가 어떤 작용기를 가지고 있는지 알아보기 위해 FT-IR 스펙트럼을 이용하여 실험을 수행하였다. 분석 결과, O-H, C-H, C=O와 CH, C=O bending등 표준물질과 같은 작용기를 가지고 있어 다당체임이 확인되었다. 또한 Vlasta 등은 표고, 영지, 느타리버섯 등 약 70여 종의 버섯에 대한 FT-IR 패턴 연구에서 890 cm-1 영역은 β-glycosidic linkage를 나타내며, 930 cm-1은 α-glycosidic linkage를 나타낸다고 보고하였는데, 본 연구에서 추출한 시료의 경우 두 영역 모두에서 진동이 일어남을 알 수 있었다.
Inonotus obliquus mushroom, which is fungus in Hymenochaetaceae family, was known to grow on birth trees in colder northern climates and to be fungal parasite that draws nutrients out of living trees rather than from the ground. In this study, we establish the extraction method and conditions for se...
Inonotus obliquus mushroom, which is fungus in Hymenochaetaceae family, was known to grow on birth trees in colder northern climates and to be fungal parasite that draws nutrients out of living trees rather than from the ground. In this study, we establish the extraction method and conditions for separation of protein-bound polysaccharide(PBP) from culture broth of Inonotus obliqus and study the possibility of concentration of PBP solution by using membrane. First, for the separation of PBP from Inonotus obliquus, three well known extraction methods were used such as hot water, ultrasonic and microwave. And then the ultrafiltration membrane system was used to concentrate the extraction solution. Second, two step extraction method was much better than one step to separate the PBP. For mycelium of Inonotus obliquus, the PBP was separated by microwave extraction for 20 min at 150℃ after the first extraction was achieved by hot water for 4 hours at 80℃. In addition, the PBP was concentrated effectively by using ultrafiltration membrane of which molecular weight cut off is 30 KDa. It had been observed that membrane concentration was essential not only for the development of clean separation technology but also for the enhanced production of PBP. Namely, we had reported that final concentrated solution was approximately 10 times higher PBP than the crude solution by applying the developed separation systems. Finally, the pretreatment process to make small particles of cells by using ultrafine pulverizer was very effective to extract PBP from mycelium by submerged culture of Inonotus obliqus. The results showed that concentration of PBP was increased from 14.3 to 63.8 mg/g because of the effective extraction by enhanced surface area of the superfine powder after ultra fine grinding. In addition, the yield of PBP was about 90% through developed process and the purified product which was obtained from the precipitation by ethanol and freeze drying was also confirmed as a PBP by using FT-IR.
Inonotus obliquus mushroom, which is fungus in Hymenochaetaceae family, was known to grow on birth trees in colder northern climates and to be fungal parasite that draws nutrients out of living trees rather than from the ground. In this study, we establish the extraction method and conditions for separation of protein-bound polysaccharide(PBP) from culture broth of Inonotus obliqus and study the possibility of concentration of PBP solution by using membrane. First, for the separation of PBP from Inonotus obliquus, three well known extraction methods were used such as hot water, ultrasonic and microwave. And then the ultrafiltration membrane system was used to concentrate the extraction solution. Second, two step extraction method was much better than one step to separate the PBP. For mycelium of Inonotus obliquus, the PBP was separated by microwave extraction for 20 min at 150℃ after the first extraction was achieved by hot water for 4 hours at 80℃. In addition, the PBP was concentrated effectively by using ultrafiltration membrane of which molecular weight cut off is 30 KDa. It had been observed that membrane concentration was essential not only for the development of clean separation technology but also for the enhanced production of PBP. Namely, we had reported that final concentrated solution was approximately 10 times higher PBP than the crude solution by applying the developed separation systems. Finally, the pretreatment process to make small particles of cells by using ultrafine pulverizer was very effective to extract PBP from mycelium by submerged culture of Inonotus obliqus. The results showed that concentration of PBP was increased from 14.3 to 63.8 mg/g because of the effective extraction by enhanced surface area of the superfine powder after ultra fine grinding. In addition, the yield of PBP was about 90% through developed process and the purified product which was obtained from the precipitation by ethanol and freeze drying was also confirmed as a PBP by using FT-IR.
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