[논문]녹농균 임상균주의 쿼럼 센싱 관련 표현형 분석

정경주; 최유상; 하창완; 신정환; 이준희

[국내논문] 녹농균 임상균주의 쿼럼 센싱 관련 표현형 분석
Analysis of Quorum Sensing-Related Phenotypes of Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolates 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.46 no.3, 2010년, pp.240 - 247

정경주 (부산대학교 약학대학 미생물학 연구실) , 최유상 (부산대학교 약학대학 미생물학 연구실) , 하창완 (부산대학교 약학대학 미생물학 연구실) , 신정환 (인제대학교 의과대학 진단검사의학교실) , 이준희 (부산대학교 약학대학 미생물학 연구실)

초록
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그람음성 간균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 비뇨기, 결막(conjunctiva), 호흡기(respiratory system), 화상부위 등에 광범위하게 감염하며, 병원성의 발현에 세균의 세포밀도 인식기전인 쿼럼 센싱이 매우 중요하다고 알려진 기회감염성 병원균이다. 국내의 환자들에게 감염하는 녹농균에서 쿼럼 센싱의 중요성을 알아보기 위해 부산 백병원의 환자들로부터 189종의 녹농균을 분리 동정하였다. 이 임상 균주들에서 쿼럼 센싱 신호 물질의 발현을 리포터 균주를 이용한 고체 배지 확산법으로 조사하였다. 전체 임상 균주의 79.4%가 녹농균 야생형균주와 비슷하게 쿼럼 센싱 조절의 가장 상위 신호인식-조절단백질인 LasR을 충분히 활성화 시키는 수준으로 쿼럼 신호물질을 생성하였다. 반면 4.2% 정도는 신호물질을 합성하지 못하는 녹농균 돌연변이주와 비슷하게 LasR을 활성화 시키지 못하는 수준으로 쿼럼 신호물질을 생성하였다. 한편, 전체의 72.5%가 또 다른 쿼럼 신호인식-조절 단백질인 QscR을 충분히 활성화 시킬 수 있는 야생형 수준으로 신호물질을 생성한 반면, 9%가 QscR을 활성화 시키지 못하는 수준으로 신호물질을 생성하였다. 임상 균주들 중 특히 녹농균 감염이 의심되는 환자들에게서 유래한 74종을 선정하여 병독인자로 중요한 프로테아제 활성을 조사한 결과, 44.6%에서 프로테아제 활성이 낮아져 있었으며, 12.2%에서는 프로테아제 활성이 관찰되지 않았다. 같은 균들을 대상으로 만성감염에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 생물막 형성 능력을 확인하였을 때, 대부분이 야생형보다 생물막 형성능력이 떨어져 있었다. 또한 이 균주들의 운동성을 살펴본 결과 많은 균주들이 swarming과 twitching 능력이 저해되어 있었으며(전체의 51.4%가 reduced swarming activity, 전체의 41.9%가 reduced twitching activity), 관찰되지 않는 수준의 균주도 상당부분 있었다(전체의 28.4%가 swarming negative, 전체의 28.4%가 twitching negative). 본 연구결과는 쿼럼 센싱을 정상적으로 하는 임상 균주들 중에서도 상당 부분은 프로테아제 생성, 생물막 형성, 운동성 등의 특징들이 저해될 수 있음을 의미하며, 일부 임상 균주들은 그들의 쿼럼 활성과는 상관관계가 없는 독특한 패턴의 프로테아제 생성능과 생물막 형성능 및 운동성을 보여주고 있음을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Pseudomonas aeruginosa is a Gram (-) opportunistic human pathogen causing a wide variety of infections on lung, urinary tract, eyes, and burn wound sites and quorum sensing (QS), a cell density-sensing mechanism plays an essential role in Pseudomonas pathogenesis. In order to investigate the importance of QS in the Pseudomonas infections of Korean patients, we isolated 189 clinical strains of P. aeruginosa from the patients in Pusan Paik Hospital, Busan, South Korea. The QS signal production of these clinical isolates was measured by signal diffusion assay on solid media using reporter strains. While most clinical strains (79.4%) produced the QS signals as similar level as a wild type strain, PAO1 did, where LasR, the initial QS signal sensor-regulator was fully activated, a minority of them (4.2%) produced much less QS signals at the level to which LasR failed to respond. Similarly, while 72.5% of the clinical isolates produced QS signals enough to activate QscR, an another QS signal sensor-regulator, some few of them (9%) produced the QS signals at much lower level where QscR was not activated. For further analysis, we selected 74 clinical strains that were obtained from the patients under suspicion of Pseudomonas infection and investigated the total protease activity that is considered important for virulence. Interestingly, significant portion of them showed very low protease activity (44.6%) or no detectable protease activity (12.2%). When the biofilm-forming ability that is considered very important in chronic infection was examined, most isolates showed lower biofilm-forming activity than PAO1. Similarly, significant portion of clinical isolates showed reduced motility (reduced swarming activity in 51.4% and reduced twitching activity in 41.9%), or non-detectable motility (swarming-negative in 28.4% and twitching-negative in 28.4%). Our result showed that the clinical isolates that produced QS signals at the similar level to wild type could have significantly reduced activities in the protease production, biofilm formation, and motility, and some clinical isolates had unique patterns of motility, biofilm formation, and protease production that are not correlated to their QS activity.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

하지만, 국내 임상환자들에서 분리된 녹농균에서 쿼럼 신호물질 및 생물막 형성에 대한 분석은 아직 폭넓게 수행된 바가 없었다. 본 실험에서는 국내 환자들에서 분리된 다량의 녹농균 임상균주들에서 쿼럼 신호물질 생성과 생물막 형성 정도를 분석하고, 이들이 임상균들의 병원성에 대한 지표로 사용될 수 있는 가능성을 조사해 보았다.
3). 본 연구에서는 QS 신호물질을 생성하지 않은 임상 균주들 중에 녹농균이 아닌 것이 잘못 동정된 경우가 포함되었을 가능성을 배제하기 위하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 보다 엄밀하게 녹농균 임을 확인하였고, 녹농균이 아닌 것은 제외하였다(자료 미제시).
임상 균주들의 생물막 형성능력을 알아보기 위해 앞에서 사용한 74종의 임상 균주들을 대상으로 생물막 형성 정도를 조사하였다. 임상 균주들을 48시간 동안 배양하여 생물막 형성을 측정하였을 때, 흥미롭게도 대부분이 야생형 PAO1 보다 생물막 형성능력이 떨어져 있었다(Fig.

제안 방법

녹농균 임상 균주들을 동정하기 위해 인제대학교 부속 부산백병원에 내원한 외래환자와 입원환자의 모든 가검물에서 녹농균으로 의심되는 균들을 VITEK2-System (bioMérieux)을 이용하여 동정했다.
Skim milk agar plate 위에 지름 0.5 cm의 여과지를 놓고 그 위에 OD600=1.0로 배양한 임상 균주들을 2 μl씩 접종하였다.
Luria-Bertani (LB) 고체배지에 발색반응을 위하여 40 μg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)를, 두 플라스미드를 갖는 리포터 균주를 선택하기 위하여 10 μg/ml gentamicin과 100 μg/ml ampicilin을, 리포터 균주내에서 3OC12-HSL 인지단백질인 LasR과 QscR을 발현 시키기 위하여 0.4% L-arabi-nose를 각각 첨가한 후, 그 위에 Fig. 1B에서처럼 리포터 균주를 선형으로 그어 접종하였다.
1B에서처럼 리포터 균주를 선형으로 그어 접종하였다. 여기에 녹농균 임상균주들을 나란히 그어 접종하여 24시간 동안 배양하며 리포터 균주의 색깔 변화를 관찰하였다. Fig.
0로 배양한 임상 균주들을 2 μl씩 접종하였다. 이를 18-24시간 배양하면서 주위에 skim milk 속의 단백질이 분해되어 생기는 투명환을 관찰한 후, 그 직경의 크기를 통해 프로테아제 활성을 측정하였다. 그 활성의 정도를 네 등급으로 나누어 각각 -, +, ++, +++로 표시하였다.
여기에 absolute ethanol 200 μl를 넣고 30분간 잘 흔들어 crystal violet을 녹여낸 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 양에 의한 오차를 보정하기 위하여 이 흡광도를 앞에서 측정한 OD값으로 나누어 준 값을 생물막 형성 정도로 제시하였다. 흡광도 측정에는 Tristar LB941 (Berthold, Germany)이 사용되었다.
임상균주들의 운동성은 평판배지법을 통해 측정되었다. twitching 활성 측정용 평판배지는 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1% agar로 만들었으며, swarming 활성 측정용 평판배지는 0.4% tryptone, 0.2% yeast extract, 0.2% NaCl, 0.5% agar, 0.5% glucose로 만들었다. 각각의 평판배지위에 임상균주들을 접종하여 이들이 각각의 운동성을 통해 주변으로 퍼져나가는 정도를 측정한 후, 그 정도를 네 등급으로 나누어 각각 -, +, ++, +++로 표시하였다.
5% glucose로 만들었다. 각각의 평판배지위에 임상균주들을 접종하여 이들이 각각의 운동성을 통해 주변으로 퍼져나가는 정도를 측정한 후, 그 정도를 네 등급으로 나누어 각각 -, +, ++, +++로 표시하였다. 세포가 균일하게 퍼져 나가는 것은 아니지만 대략 -는 10-15 mm, +는 11-20 mm, ++는 15-24 mm, +++는 25-35 mm 이상으로 측정되었다.
aeruginosa는 배제하고 한 환자당 하나의 녹농균만을 취하여, 총 189개의 임상 균주를 얻었다. 이렇게 얻어진 189개의 임상 균주에서 쿼럼 신호물질 생성 여부를 Fig. 2A, 2B에 예시된 것처럼 고체배지상에서 신호 확산법으로 조사하였다. 그 결과 전체 189종의 임상 균주중 79.
임상 균주의 QS 신호물질 생성이 실제로 감염력과 관련이 있는지 확인하기 위해 녹농균 감염이 의심되는 환자에서 동정된 74종에 대해 대표적 병독인자인 프로테아제 활성을 분석하였다. 녹농균의 프로테아제들은 쿼럼 센싱의 조절을 받아 발현되는 것이 많은데, 8종 이상의 세포외로 분비되는 프로테아제가 쿼럼 센싱의 조절을 받는다는 것이 전사체 분석을 통해 알려졌으며(34), LasB, protease IV 등의 프로테아제들은 그 발현이 LasR 등 쿼럼 센싱 조절 단백질에 의해 직접 조절된다는 것이 밝혀진 바 있다(4, 5, 34, 35, 40).
3. Summary of the results of the assays for the total protease activity, biofilm formation, swarming motility, twitching motility, and QS signal production for comparison. The results for the QS signal production assays by two different reporters were presented together as LasR activity and QscR activity, respectively.
그람음성 간균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 비뇨기, 결막(conjunctiva), 호흡기(respiratory system), 화상부위 등에 광범위하게 감염하며, 병원성의 발현에 세균의 세포밀도 인식기전인 쿼럼 센싱이 매우 중요하다고 알려진 기회감염성 병원균이다. 국내의 환자들에게 감염하는 녹농균에서 쿼럼 센싱의 중요성을 알아보기 위해 부산 백병원의 환자들로부터 189종의 녹농균을 분리 동정하였다. 이 임상 균주들에서 쿼럼 센싱 신호 물질의 발현을 리포터 균주를 이용한 고체 배지 확산법으로 조사하였다.

대상 데이터

2009년에 부산백병원 임상 미생물검사실로 의뢰된 환자들의 검체로부터 동정된 녹농균 189개를 이번 실험에 사용하였으며, 질병에 따른 녹농균 임상균주의 수는 Table 1과 같다. 표준 야생형 녹농균 균주로는 일반적으로 많은 연구진에 의해 연구되어온 PAO1을 사용하였으며, 쿼럼 센싱을 하지 못하는 대조군 균주로는 MW1 (lasI-rhlI-, 이중 돌연변이주)을 사용하였다.
2009년에 부산백병원 임상 미생물검사실로 의뢰된 환자들의 검체로부터 동정된 녹농균 189개를 이번 실험에 사용하였으며, 질병에 따른 녹농균 임상균주의 수는 Table 1과 같다. 표준 야생형 녹농균 균주로는 일반적으로 많은 연구진에 의해 연구되어온 PAO1을 사용하였으며, 쿼럼 센싱을 하지 못하는 대조군 균주로는 MW1 (lasI-rhlI-, 이중 돌연변이주)을 사용하였다. 녹농균 동정에는 VITEK2-System (bioMérieux, Korea)을사용하였으며, 표준 녹농균 균주인 PAO1과 생리적 특성이 차이가 나는 임상균들에 대해서는 16S 리보좀 RNA 염기서열 분석을 통해 보다 정확히 녹농균임을 확인하였다.
이들을 각각 pJN105L- pSC11과 pJN105Q-pJL101의 조합으로 함께 대장균 DH5α에 형질전환을 통해 도입한 후, 3OC12-HSL에 반응하여 β-galac-tosidase를 발현하는 리포터 균주로 사용하였다.
프로테아제 활성은 skim milk agar (0.5% skim milk, 0.5% peptone, 0.1% glucose, 1.5% agar)를 이용하여 측정되었다. Skim milk agar plate 위에 지름 0.
생물막 형성은 M63 최소 배지[M63 salt (12 g/L KH₂PO₄, 28 g/L K₂HPO₄, 8 g/L (NH₄)SO₄, 1 mM MgSO₄, 0.5% CAA, 0.2% citrate]에서 수행되었다. 두 개의 96 well plate에 M63 액체배지를 150 μl씩 분주한 후, 24시간 배양한 임상 균주들의 seed 배양액을 동일하게 2%로 접종하고 37°C에서 48시간 배양하였다.
세포의 양에 의한 오차를 보정하기 위하여 이 흡광도를 앞에서 측정한 OD값으로 나누어 준 값을 생물막 형성 정도로 제시하였다. 흡광도 측정에는 Tristar LB941 (Berthold, Germany)이 사용되었다.
쿼럼 신호물질인 3OC12-HSL의 검출을 위해서 두 종류의 공존가능한 플라스미드(compatible plasmids)들을 조합하여 도입한 재조합 대장균(Escherichia coli) 균주를 사용하였다(Fig. 1A). 한 종류는 arabinose에 의해 발현이 유도되는 프로모터에 3OC12-HSL에 대한 쿼럼 수용체 단백질들인 LasR과 QscR을 각각 클로닝한 pJN105L과 pJN105Q이고, 다른 종류는 LasR과 QscR이 각각 특이적으로 발현을 유도하는 lasI와 PA1897 유전자의 프로모터를 lacZ 리포터 유전자에 결합시킨 pSC11과 pJL101 플라스미드들이다(9, 22).

이론/모형

QS 신호전달을 처음 개시하는 3OC12-HSL의 검출을 위해 고체 배지상에서 리포터 균주를 이용한 신호 확산 검출법 (signal diffusion assay)을 수행하였다(Fig. 1B). Luria-Bertani (LB) 고체배지에 발색반응을 위하여 40 μg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)를, 두 플라스미드를 갖는 리포터 균주를 선택하기 위하여 10 μg/ml gentamicin과 100 μg/ml ampicilin을, 리포터 균주내에서 3OC12-HSL 인지단백질인 LasR과 QscR을 발현 시키기 위하여 0.
임상균주들의 운동성은 평판배지법을 통해 측정되었다. twitching 활성 측정용 평판배지는 1% tryptone, 0.
국내의 환자들에게 감염하는 녹농균에서 쿼럼 센싱의 중요성을 알아보기 위해 부산 백병원의 환자들로부터 189종의 녹농균을 분리 동정하였다. 이 임상 균주들에서 쿼럼 센싱 신호 물질의 발현을 리포터 균주를 이용한 고체 배지 확산법으로 조사하였다. 전체 임상 균주의 79.

성능/효과

녹농균 동정에는 VITEK2-System (bioMérieux, Korea)을사용하였으며, 표준 녹농균 균주인 PAO1과 생리적 특성이 차이가 나는 임상균들에 대해서는 16S 리보좀 RNA 염기서열 분석을 통해 보다 정확히 녹농균임을 확인하였다.
녹농균 임상 균주들을 동정하기 위해 인제대학교 부속 부산백병원에 내원한 외래환자와 입원환자의 모든 가검물에서 녹농균으로 의심되는 균들을 VITEK2-System (bioMérieux)을 이용하여 동정했다. 중복을 피하기 위하여 같은 환자로부터 동정된 P. aeruginosa는 배제하고 한 환자당 하나의 녹농균만을 취하여, 총 189개의 임상 균주를 얻었다. 이렇게 얻어진 189개의 임상 균주에서 쿼럼 신호물질 생성 여부를 Fig.
2A, 2B에 예시된 것처럼 고체배지상에서 신호 확산법으로 조사하였다. 그 결과 전체 189종의 임상 균주중 79.4% (150종)가 녹농균 야생형 균주와 비슷하게 쿼럼 센싱 조절의 가장 상위 신호인식-조절 단백질인 LasR을 충분히 활성화 시키는 수준으로 쿼럼 신호물질을 생성하였다(Fig. 2C). LasR은 3OC12-HSL을 인식하는 쿼럼 신호 수용체 단백질로 많은 병독인자들(virulence factors)의 발현을 직접 조절할 뿐만 아니라, C4-HSL에 의한 RhlR-I 조절군과 PQS 신호 조절군 등 다른 쿼럼 센싱 조절군을 연속적으로 활성화시키는 역할을 한다.
2% (23종)는 다소 낮은 정도의 쿼럼 신호물질 생성능력을 보였다. 반면, 전체의 8.4% (16종)는 상당히 낮은 수준으로 쿼럼 신호물질을 생성하였으며, 이중 절반 정도, 즉 전체의 4.2% (8종)는 신호물질을 전혀 합성하지 못하는 녹농균 돌연변이주(MW1)와 비슷하게 LasR을 전혀 활성화 시키지 못하는 수준이었다(Fig. 2C). LasR은 3OC12- HSL에 대한 특이성과 민감성이 모두 높기 때문에(35), 이 4.
2%는 쿼럼 음성으로 판단된다. 이 실험결과는 79.4%의 임상 균주들이 3OC12-HSL을 야생형 수준으로 생성하지만, 나머지는 야생형 보다 낮은 수준으로 생성하거나 생성하지 못함을 보여주는 것이다.
QscR이 반응하는 acyl-HSL에는 3OC12-HSL을 포함하여, 3OC10-HSL (N-3- oxodecanoyl-homoserine lactone), C12-HSL (N-dodecanoyl- homoserine lactone), C10-HSL (N-decanoyl-homoserine lactone), 3OHC10-HSL (N-3-hydroxydecanoyl-homoserine lactone), C8- HSL (N-octanoyl-homoserine lactone), C14-HSL (N-tetrade-canoyl-homoserine lactone) 등이 있다(22). LasR 대신 QscR의 활성을 검사할 수 있는 리포터 균주를 이용하여 189개의 임상 균주들을 조사해본 결과, 전체의 72.5% (137종)가 야생형과 비슷한 수준으로 QscR을 충분히 활성화 시켰으며, 11.1% (21종)가 다소 낮은 정도로 QscR을 활성화 시켰다(Fig. 2C). 반면, 전체의 16.
이는 쿼럼 신호물질을 생성하는 임상 균주들은 모두 야생형처럼 3OC12-HSL을 주로 생성하며, 탄소사슬의 길이나 기능기가 다른 acyl group을 갖는 acyl-HSL을 의미있는 수준으로 생성하는 임상 균주는 없었음을 의미한다. LasR 리포터를 사용한 분석과 QscR 리포터를 사용한 분석 중 LasR 리포터를 사용한 분석이 보다 민감하게 쿼럼 센싱 신호물질의 활성을 반영하기 때문에, 실제 쿼럼 센싱 음성인 임상균은 LasR 리포터를 이용한 분석결과인 전체의 4.2% (8종)로 보는 것이 타당하다고 사료된다.
한편, 임상 균주들 중 특히 녹농균 감염이 의심되는 폐렴, 화상부위 감염, 요도 감염, 호흡기 감염 등에서 동정된 74종만을 선택하여 따로 분석하였을 때에도 전체의 8.1% (6종)가 낮은 쿼럼활성을, 전체의 5.4% (4종)가 쿼럼 음성으로 분석되어, 전체 189종을 가지고 분석했을 때와 유사한 것으로 나타났다(Fig. 3). 마찬가지로 74종에 대해 QscR 리포터 균주를 이용한 결과를 가지고 분석하였을 때도 16.
3). 마찬가지로 74종에 대해 QscR 리포터 균주를 이용한 결과를 가지고 분석하였을 때도 16.2% (12종)가 낮은 활성을, 10.8% (8종)가 음성으로 분석되어 전체 189종을 가지고 분석했을 때와 대동소이하였다(Fig. 3). 본 연구에서는 QS 신호물질을 생성하지 않은 임상 균주들 중에 녹농균이 아닌 것이 잘못 동정된 경우가 포함되었을 가능성을 배제하기 위하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 보다 엄밀하게 녹농균 임을 확인하였고, 녹농균이 아닌 것은 제외하였다(자료 미제시).
녹농균의 프로테아제들은 쿼럼 센싱의 조절을 받아 발현되는 것이 많은데, 8종 이상의 세포외로 분비되는 프로테아제가 쿼럼 센싱의 조절을 받는다는 것이 전사체 분석을 통해 알려졌으며(34), LasB, protease IV 등의 프로테아제들은 그 발현이 LasR 등 쿼럼 센싱 조절 단백질에 의해 직접 조절된다는 것이 밝혀진 바 있다(4, 5, 34, 35, 40). 본 연구에서도 쿼럼 센싱 활성이 정상적인 임상 균주 대부분이 야생형 PAO1과 비슷한 수준의 프로테아제 활성을 보였으며, 통계적으로도 쿼럼 센싱과 프로테아제 생성간에 유의한 상관관계가 있는 것으로 관찰되었으나(p-value=0.499, Fig. 3), 전체적으로는 44.6%인 33종의 임상 균주들이 낮은 프로테아제 활성을 보였고, 전체의 12.2% (9종)에서는 프로테아제 활성이 관찰되지 않았다(Fig. 3). 또한 일부 임상 균주들은 정상적인 쿼럼 활성을 보이면서도 프로테아제 활성은 나타나지 않거나(Fig.
3, J3, J27, J34, J43, J63, J74, J76, J86, J94, J115, J132, J160, J194, J199, J202). 이와 반대로 쿼럼 활성은 없으면서 프로테아제 활성이 야생형과 비슷한 수준으로 나오는 경우는 없었으며, J187만이 쿼럼 활성이 없으면서도 PAO1에 비해 낮은 수준으로 프로테아제 활성을 보였다(Fig. 3). 이 결과는 임상 균주들에서도 야생형 균주인 PAO1으로부터 알려진 쿼럼 센싱과 프로테아제 활성사이의 상관관계가 여전히 나타남을 보여주는 한편, 그것이 절대적이지는 않아서 쿼럼 센싱이 정상이면서 프로테아제 활성이 감소한 종들도 일부 존재한다는 사실을 함께 보여주고 있다.
3). 이 결과는 임상 균주들에서도 야생형 균주인 PAO1으로부터 알려진 쿼럼 센싱과 프로테아제 활성사이의 상관관계가 여전히 나타남을 보여주는 한편, 그것이 절대적이지는 않아서 쿼럼 센싱이 정상이면서 프로테아제 활성이 감소한 종들도 일부 존재한다는 사실을 함께 보여주고 있다.
3). 생물막 형성능력이 PAO1 보다 더 높아진 임상균주는 J16, J40, J63, J76, J123, J161, J202 등 7종으로 전체의 9.5%였으며, 이들은 야생형에 비해 15% 이상 증가된 생물막을 형성하였다(Fig. 3). 야생형에 비해 50% 이상 생물막을 많이 형성한 것은 J16, J76, J161 등 3종 뿐이었다.
녹농균에서는 오랫동안 쿼럼 센싱과 생물막 형성이 밀접한 관계가 있다는 것이 많이 보고되어 왔는데(11, 28), 최근에는 생물막 형성에 쿼럼 센싱이외의 다른 조절인자가 작용한다는 보고도 많으며, 실험 조건이나 주변 환경 인자에 의해 쿼럼 센싱과는 독립적으로 다양하게 조절 받을 수 있는 것으로 생각되고 있다(18, 27). 본 연구 결과 또한 임상균주에서는 쿼럼 센싱과 생물막 형성사이의 상관관계가 낮으며, J16과 같이 전혀 상관관계가 없는 경우도 있음을 보여준다.
녹농균의 운동성이 생물막 형성과 관련이 있다는 것이 보고된 바 있다(3, 25, 36). 임상 균주들에서 관찰된 생물막 형성능력과 운동성간의 상관 관계를 알아보기 위해 74종의 임상균을 가지고 평판배지에서 약 48시간 배양하면서 swarming과 twitching 활성을 측정해 보았을 때, 많은 임상균들에서 swarming과 twitching 능력이 저해되어 있었다. 전체의 51.
임상 균주들에서 관찰된 생물막 형성능력과 운동성간의 상관 관계를 알아보기 위해 74종의 임상균을 가지고 평판배지에서 약 48시간 배양하면서 swarming과 twitching 활성을 측정해 보았을 때, 많은 임상균들에서 swarming과 twitching 능력이 저해되어 있었다. 전체의 51.4%인 38종이 감소된 swarming 활성을 보였으며, 전체의 41.9%인 31종이 감소된 twitching 활성을 보였다(Fig. 3). 이들 중 절반이상에서 swarming과 twitching 능력이 관찰되지 않았다 [Fig.
또한 쿼럼 센싱을 정상적으로 하는 임상 균주들에서도 프로테아제 생성, 생물막 형성, 운동성 등의 특징들이 저해되어 있는 경우가 많았다는 점도 본 연구 결과에서 언급할 만한 부분이다. J16과 같은 일부 임상 균주들은 쿼럼 활성과는 상관관계가 없는 독특한 패턴의 프로테아제 생성능과 생물막 형성능 및 운동성을 보여주고 있음도 본 연구를 통해 확인하였다.
이 임상 균주들에서 쿼럼 센싱 신호 물질의 발현을 리포터 균주를 이용한 고체 배지 확산법으로 조사하였다. 전체 임상 균주의 79.4%가 녹농균 야생형 균주와 비슷하게 쿼럼 센싱 조절의 가장 상위 신호인식-조절 단백질인 LasR을 충분히 활성화 시키는 수준으로 쿼럼 신호물질을 생성하였다. 반면 4.
5%가 또 다른 쿼럼 신호인식-조절 단백질인 QscR을 충분히 활성화 시킬 수 있는 야생형 수준으로 신호물질을 생성한 반면, 9%가 QscR을 활성화 시키지 못하는 수준으로 신호물질을 생성하였다. 임상 균주들 중 특히 녹농균 감염이 의심되는 환자들에게서 유래한 74종을 선정하여 병독인자로 중요한 프로테아제 활성을 조사한 결과, 44.6%에서 프로테아제 활성이 낮아져 있었으며, 12.2%에서는 프로테아제 활성이 관찰되지 않았다. 같은 균들을 대상으로 만성감염에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 생물막 형성 능력을 확인하였을 때, 대부분이 야생형보다 생물막 형성능력이 떨어져 있었다.
2%에서는 프로테아제 활성이 관찰되지 않았다. 같은 균들을 대상으로 만성감염에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 생물막 형성 능력을 확인하였을 때, 대부분이 야생형보다 생물막 형성능력이 떨어져 있었다. 또한 이 균주들의 운동성을 살펴본 결과 많은 균주들이 swarming과 twitching 능력이 저해되어 있었으며(전체의 51.
같은 균들을 대상으로 만성감염에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 생물막 형성 능력을 확인하였을 때, 대부분이 야생형보다 생물막 형성능력이 떨어져 있었다. 또한 이 균주들의 운동성을 살펴본 결과 많은 균주들이 swarming과 twitching 능력이 저해되어 있었으며(전체의 51.4%가 reduced swarming activity, 전체의 41.9%가 reduced twitching activity), 관찰되지 않는 수준의 균주도 상당부분 있었다(전체의 28.4%가 swarming negative, 전체의 28.4%가 twitching negative). 본 연구결과는 쿼럼 센싱을 정상적으로 하는 임상 균주들 중에서도 상당 부분은 프로테아제 생성, 생물막 형성, 운동성 등의 특징들이 저해될 수 있음을 의미하며, 일부 임상 균주들은 그들의 쿼럼 활성과는 상관관계가 없는 독특한 패턴의 프로테아제 생성능과 생물막 형성능 및 운동성을 보여주고 있음을 확인하였다.
4%가 twitching negative). 본 연구결과는 쿼럼 센싱을 정상적으로 하는 임상 균주들 중에서도 상당 부분은 프로테아제 생성, 생물막 형성, 운동성 등의 특징들이 저해될 수 있음을 의미하며, 일부 임상 균주들은 그들의 쿼럼 활성과는 상관관계가 없는 독특한 패턴의 프로테아제 생성능과 생물막 형성능 및 운동성을 보여주고 있음을 확인하였다.

후속연구

쿼럼 활성이 정상적이면서 PAO1보다 훨씬 높은 생물막 형성능력을 보인 J76, J161과, 이와는 반대로 쿼럼 음성이면서 매우 높은 생물막 형성능을 보인 J16은 매우 흥미로운 임상 균주들이다. 특히 나머지 쿼럼 음성 임상균들(J25, J150, J187)은 PAO1보다 현저하게 적은 생물막 형성능을 보였다는 점에서 J16에 대한 추가 연구가 필요하다고 사료된다. 녹농균에서는 오랫동안 쿼럼 센싱과 생물막 형성이 밀접한 관계가 있다는 것이 많이 보고되어 왔는데(11, 28), 최근에는 생물막 형성에 쿼럼 센싱이외의 다른 조절인자가 작용한다는 보고도 많으며, 실험 조건이나 주변 환경 인자에 의해 쿼럼 센싱과는 독립적으로 다양하게 조절 받을 수 있는 것으로 생각되고 있다(18, 27).
쿼럼 센싱은 녹농균의 감염과 병원성에 핵심적인 역할은 한다고 알려져 왔기 때문에 녹농균 감염의 중요한 지표로 사용하려는 시도가 진행되어 왔으나, 국내 환자들에게서 동정된 녹농균 임상 균주에서 쿼럼 센싱 및 이와 관련된 여러 생리적 특성들에 대한 연구는 아직까지 제한적이었다는 점에서 본 연구의 결과는 중요한 정보로 쓰일 수 있다고 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	녹농균이란 무엇인가?	그람음성 간균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 비뇨기, 결막(conjunctiva), 호흡기(respiratory system), 화상부위 등에 광범위하게 감염하며, 병원성의 발현에 세균의 세포밀도 인식기전인 쿼럼 센싱이 매우 중요하다고 알려진 기회감염성 병원균이다. 국내의 환자들에게 감염하는 녹농균에서 쿼럼 센싱의 중요성을 알아보기 위해 부산 백병원의 환자들로부터 189종의 녹농균을 분리 동정하였다.
	본 논문은 임상 균주에서 쿼럼 센싱 신호 물질의 발현을 어떤 방법으로 조사하였는가?	국내의 환자들에게 감염하는 녹농균에서 쿼럼 센싱의 중요성을 알아보기 위해 부산 백병원의 환자들로부터 189종의 녹농균을 분리 동정하였다. 이 임상 균주들에서 쿼럼 센싱 신호 물질의 발현을 리포터 균주를 이용한 고체 배지 확산법으로 조사하였다. 전체 임상 균주의 79.
	부산 백병원 환자들에게 감염된 녹농균에서 쿼럼 센싱의 중요성을 알아본 실험의 결과는 어떠한가?	이 임상 균주들에서 쿼럼 센싱 신호 물질의 발현을 리포터 균주를 이용한 고체 배지 확산법으로 조사하였다. 전체 임상 균주의 79.4%가 녹농균 야생형균주와 비슷하게 쿼럼 센싱 조절의 가장 상위 신호인식-조절단백질인 LasR을 충분히 활성화 시키는 수준으로 쿼럼 신호물질을 생성하였다. 반면 4.2% 정도는 신호물질을 합성하지 못하는 녹농균 돌연변이주와 비슷하게 LasR을 활성화 시키지 못하는 수준으로 쿼럼 신호물질을 생성하였다. 한편, 전체의 72.5%가 또 다른 쿼럼 신호인식-조절 단백질인 QscR을 충분히 활성화 시킬 수 있는 야생형 수준으로 신호물질을 생성한 반면, 9%가 QscR을 활성화 시키지 못하는 수준으로 신호물질을 생성하였다. 임상 균주들 중 특히 녹농균 감염이 의심되는 환자들에게서 유래한 74종을 선정하여 병독인자로 중요한 프로테아제 활성을 조사한 결과, 44.6%에서 프로테아제 활성이 낮아져 있었으며, 12.2%에서는 프로테아제 활성이 관찰되지 않았다. 같은 균들을 대상으로 만성감염에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 생물막 형성 능력을 확인하였을 때, 대부분이 야생형보다 생물막 형성능력이 떨어져 있었다. 또한 이 균주들의 운동성을 살펴본 결과 많은 균주들이 swarming과 twitching 능력이 저해되어 있었으며(전체의 51.4%가 reduced swarming activity, 전체의 41.9%가 reduced twitching activity), 관찰되지 않는 수준의 균주도 상당부분 있었다(전체의 28.4%가 swarming negative, 전체의 28.4%가 twitching negative). 본 연구결과는 쿼럼 센싱을 정상적으로 하는 임상 균주들 중에서도 상당 부분은 프로테아제 생성, 생물막 형성, 운동성 등의 특징들이 저해될 수 있음을 의미하며, 일부 임상 균주들은 그들의 쿼럼 활성과는 상관관계가 없는 독특한 패턴의 프로테아제 생성능과 생물막 형성능 및 운동성을 보여주고 있음을 확인하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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