[학위논문]NSE/hAPPsw 치매질환모델동물을 이용한 신경퇴행성질환 치료제로서 홍문동(Red Liriope platyphylla)의 적용가능성에 대한 연구 (A) study on the application possibility of red liriope platyphylla for the treatment of neurodegenerative disorder in NSE/hAPPsw transgenic mice원문보기
맥문동(Liriope platyphylla)은 백합과에 속하는 다년생 초본으로, 식물의 착생에 필요한 수염뿌리 끝에 짧은 방추형 괴근이 주로 약효를 나타낸다. 예부터 한국, 일본, 중국 등의 동양권 국가에서, 맥문동은 소염, 강장, 진해, 거담제 및 강심제로서 기침, 가래 등의 질병 치료에 사용되었으며, 최근에는 천식치료, 당뇨 치료, 비만억제, 아토피 억제작용, 치매 치료 등에 대한 효과가 보고되고 있다. 이러한 기능 중에서 맥문동 추출물과 spicatoside 성분 등을 이용한 neuritic outgrowth와 관련된 기능은 신경퇴행성질환의 치료를 위한 새로운 전략으로서 관심이 집중되고 있다. 한편, 증숙과정(steaming process)은 독성을 감소시키고 부작용을 최소화하며 다양한 화학적인 변화를 수반하여 약리효과를 증가시키거나 새로운 생리활성을 증가시키는 과정이다. 이러한 과정은 일반적으로 열처리과정과 건조과정을 반복적으로 시행하며, 인삼에 처음으로 적용되었다. 그러나 현재까지 이러한 증숙과정을 약리효과가 우수한 맥문동의 기능을 증진시키기 위한 목적으로 연구가 수행된바 없다. 따라서 본 연구에서는 다양한 증숙과정을 통하여 제조된 홍문동(Red Liriope platyphylla)이 신경성장인자(nerve growth factor, ...
맥문동(Liriope platyphylla)은 백합과에 속하는 다년생 초본으로, 식물의 착생에 필요한 수염뿌리 끝에 짧은 방추형 괴근이 주로 약효를 나타낸다. 예부터 한국, 일본, 중국 등의 동양권 국가에서, 맥문동은 소염, 강장, 진해, 거담제 및 강심제로서 기침, 가래 등의 질병 치료에 사용되었으며, 최근에는 천식치료, 당뇨 치료, 비만억제, 아토피 억제작용, 치매 치료 등에 대한 효과가 보고되고 있다. 이러한 기능 중에서 맥문동 추출물과 spicatoside 성분 등을 이용한 neuritic outgrowth와 관련된 기능은 신경퇴행성질환의 치료를 위한 새로운 전략으로서 관심이 집중되고 있다. 한편, 증숙과정(steaming process)은 독성을 감소시키고 부작용을 최소화하며 다양한 화학적인 변화를 수반하여 약리효과를 증가시키거나 새로운 생리활성을 증가시키는 과정이다. 이러한 과정은 일반적으로 열처리과정과 건조과정을 반복적으로 시행하며, 인삼에 처음으로 적용되었다. 그러나 현재까지 이러한 증숙과정을 약리효과가 우수한 맥문동의 기능을 증진시키기 위한 목적으로 연구가 수행된바 없다. 따라서 본 연구에서는 다양한 증숙과정을 통하여 제조된 홍문동(Red Liriope platyphylla)이 신경성장인자(nerve growth factor, NGF) 분비 촉진에 미치는 영향과 독성을 신경세포주와 모델동물을 이용하여 분석하여 신경퇴행성질환 치료제로서의 가능성과 기전을 평가하고자 하였다. 첫째, 세포수준에서 홍문동의 독성과 효능을 평가하기 위하여 증숙조건에 따라 제조된 홍문동을 세포에 처리하여 MTT, NGF분비 등을 분석하였다. 그 결과, 신경 세포주인 B35세포주에서 세포 독성을 나타내지 않았고, 9시간 증숙한 홍문동(9-SLP)과 7회 증숙한 홍문동(7-SALP)에서 가장 높은 NGF 분비량을 나타내었다. 또한 홍문동 추출물에 의해 분비된 NGF (conditional media, CM)는 PC12세포의 neuritic outgrowth를 촉진하였다. 더불어 PC12 세포에서 vehicle CM에 비해 3-SLP과 1-, 3-SALP CM 처리군에서 NGF의 high affinityreceptor 신호전달과정의 TrkA와 ERK의 인산화가 높게 나타났으며, 9-, 15-, 24-SALP CM 처리군에서 low affinity receptor 신호전달 과정의 대부분의 component가 높게 발현되었다. 게다가 홍문동이 칼슘 조절에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, intracellular와 extracellular의 칼슘 농도 변화를 측정하였다. 그 결과 홍문동을 처리한 그룹에서 유의적으로 intracellular 칼슘 농도가 감소하고, extracellular 칼슘 농도가 증가하였다. 둘째로, in vitro 실험을 바탕으로 효능이 뛰어났던 7회 증숙된 홍문동(7-SALP)이 ICR 마우스에 미치는 독성을 평가하기 위하여, 3주 동안 홍문동을 마우스에 처리하고 간과 신장에 대한 독성지표의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 체중, 사료섭취량 및 음수섭취량은 대조군과 비교하여 큰 변화가 없었으며, 장기무게는 간장, 폐장, 심장, 지라에서 유의적인 변화가 관찰되었다. 폐장과 간장의 무게는 저농도 처리군에서 약간 증가하였지만, 심장과 지라의 무게는 중간농도 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 또한, 간독성분석에서, ALP의 농도는 중간농도를 처리한 군에서 유의적으로 증가하였으나 AST와 ALT의 농도는 대조군과 비교하여 오히려 약간 감소하였다. 더불어 간조직에서는 염증, 세포사 및 빌리루빈의 축적은 관찰되지 않았다. 신장독성분석에서, BUN의 농도는 대주군과 비교하여 고농도 처리군에서 유의적으로 증가하였지만, CA의 농도는 대조군과 처리군간에 유의적인 변화는 없었다. 따라서 이러한 결과는 증숙과정에 의해 제조된 홍문동은 ICR마우스의 간과 신장에 유의적으로 독성을 유발하지는 않음을 제시하고 있다. 셋째로, 홍문동이 알츠하이머질환 모델동물에 미치는 영향에 대해 연구하기 위해 3주 동안 홍문동을 NSE/hAPPsw Tg 마우스에 처리하고, NGF의 분비량, NGF 신호전달과정, Aβ-42 분비량, γ-secretase 구성단백질의 발현양을 관찰하였다. 그 결과 홍문동을 처리한 Tg 마우스의 혈청에서 NGF의 농도가 증가하였다. 그러나 NGF 수용체의 신호전달과정인 TrkA와 p75NTR, RhoA의 발현양은 약간 감소하였다. 그러나 Aβ-42 펩타이드는 홍문동을 처리한 Tg 마우스의 뇌에서 vehicle 처리군보다 유의적으로 감소하였다. 또한 Aβ-42 펩타이드의 생성을 조절하는 γ-secretase 구성 단백질의 발현을 분석한 결과, 4개의 구성 단백질 중에서, APH-1, NCT의 발현양은 감소한 반면, PS-2와 Pen-2의 발현은 유의적 차이가 없거나, 약간 증가하였다. 따라서 이상의 실험결과를 종합해보면, 3시간 증숙과 24시간 건조 단계를 7회 반복하여 제조된 홍문동은 B35 세포주에서 NGF 분비능를 최대로 유도하였고, 실험동물의 간과 신장독성을 유발하지 않았다. 또한, 홍문동은 NGF 분비능, NGF 신호전달과정, Aβ-42 펩타이드 침적 그리고 γ-secretase 구성단백질 발현 등에 변화를 유도함으로서 신경퇴행성질환을 경감시키는 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 홍문동은 향후 알츠하이머 질환의 새로운 치료제로서 개발 가능성이 높을 것으로 사료된다.
맥문동(Liriope platyphylla)은 백합과에 속하는 다년생 초본으로, 식물의 착생에 필요한 수염뿌리 끝에 짧은 방추형 괴근이 주로 약효를 나타낸다. 예부터 한국, 일본, 중국 등의 동양권 국가에서, 맥문동은 소염, 강장, 진해, 거담제 및 강심제로서 기침, 가래 등의 질병 치료에 사용되었으며, 최근에는 천식치료, 당뇨 치료, 비만억제, 아토피 억제작용, 치매 치료 등에 대한 효과가 보고되고 있다. 이러한 기능 중에서 맥문동 추출물과 spicatoside 성분 등을 이용한 neuritic outgrowth와 관련된 기능은 신경퇴행성질환의 치료를 위한 새로운 전략으로서 관심이 집중되고 있다. 한편, 증숙과정(steaming process)은 독성을 감소시키고 부작용을 최소화하며 다양한 화학적인 변화를 수반하여 약리효과를 증가시키거나 새로운 생리활성을 증가시키는 과정이다. 이러한 과정은 일반적으로 열처리과정과 건조과정을 반복적으로 시행하며, 인삼에 처음으로 적용되었다. 그러나 현재까지 이러한 증숙과정을 약리효과가 우수한 맥문동의 기능을 증진시키기 위한 목적으로 연구가 수행된바 없다. 따라서 본 연구에서는 다양한 증숙과정을 통하여 제조된 홍문동(Red Liriope platyphylla)이 신경성장인자(nerve growth factor, NGF) 분비 촉진에 미치는 영향과 독성을 신경세포주와 모델동물을 이용하여 분석하여 신경퇴행성질환 치료제로서의 가능성과 기전을 평가하고자 하였다. 첫째, 세포수준에서 홍문동의 독성과 효능을 평가하기 위하여 증숙조건에 따라 제조된 홍문동을 세포에 처리하여 MTT, NGF분비 등을 분석하였다. 그 결과, 신경 세포주인 B35세포주에서 세포 독성을 나타내지 않았고, 9시간 증숙한 홍문동(9-SLP)과 7회 증숙한 홍문동(7-SALP)에서 가장 높은 NGF 분비량을 나타내었다. 또한 홍문동 추출물에 의해 분비된 NGF (conditional media, CM)는 PC12세포의 neuritic outgrowth를 촉진하였다. 더불어 PC12 세포에서 vehicle CM에 비해 3-SLP과 1-, 3-SALP CM 처리군에서 NGF의 high affinity receptor 신호전달과정의 TrkA와 ERK의 인산화가 높게 나타났으며, 9-, 15-, 24-SALP CM 처리군에서 low affinity receptor 신호전달 과정의 대부분의 component가 높게 발현되었다. 게다가 홍문동이 칼슘 조절에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, intracellular와 extracellular의 칼슘 농도 변화를 측정하였다. 그 결과 홍문동을 처리한 그룹에서 유의적으로 intracellular 칼슘 농도가 감소하고, extracellular 칼슘 농도가 증가하였다. 둘째로, in vitro 실험을 바탕으로 효능이 뛰어났던 7회 증숙된 홍문동(7-SALP)이 ICR 마우스에 미치는 독성을 평가하기 위하여, 3주 동안 홍문동을 마우스에 처리하고 간과 신장에 대한 독성지표의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 체중, 사료섭취량 및 음수섭취량은 대조군과 비교하여 큰 변화가 없었으며, 장기무게는 간장, 폐장, 심장, 지라에서 유의적인 변화가 관찰되었다. 폐장과 간장의 무게는 저농도 처리군에서 약간 증가하였지만, 심장과 지라의 무게는 중간농도 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 또한, 간독성분석에서, ALP의 농도는 중간농도를 처리한 군에서 유의적으로 증가하였으나 AST와 ALT의 농도는 대조군과 비교하여 오히려 약간 감소하였다. 더불어 간조직에서는 염증, 세포사 및 빌리루빈의 축적은 관찰되지 않았다. 신장독성분석에서, BUN의 농도는 대주군과 비교하여 고농도 처리군에서 유의적으로 증가하였지만, CA의 농도는 대조군과 처리군간에 유의적인 변화는 없었다. 따라서 이러한 결과는 증숙과정에 의해 제조된 홍문동은 ICR마우스의 간과 신장에 유의적으로 독성을 유발하지는 않음을 제시하고 있다. 셋째로, 홍문동이 알츠하이머질환 모델동물에 미치는 영향에 대해 연구하기 위해 3주 동안 홍문동을 NSE/hAPPsw Tg 마우스에 처리하고, NGF의 분비량, NGF 신호전달과정, Aβ-42 분비량, γ-secretase 구성단백질의 발현양을 관찰하였다. 그 결과 홍문동을 처리한 Tg 마우스의 혈청에서 NGF의 농도가 증가하였다. 그러나 NGF 수용체의 신호전달과정인 TrkA와 p75NTR, RhoA의 발현양은 약간 감소하였다. 그러나 Aβ-42 펩타이드는 홍문동을 처리한 Tg 마우스의 뇌에서 vehicle 처리군보다 유의적으로 감소하였다. 또한 Aβ-42 펩타이드의 생성을 조절하는 γ-secretase 구성 단백질의 발현을 분석한 결과, 4개의 구성 단백질 중에서, APH-1, NCT의 발현양은 감소한 반면, PS-2와 Pen-2의 발현은 유의적 차이가 없거나, 약간 증가하였다. 따라서 이상의 실험결과를 종합해보면, 3시간 증숙과 24시간 건조 단계를 7회 반복하여 제조된 홍문동은 B35 세포주에서 NGF 분비능를 최대로 유도하였고, 실험동물의 간과 신장독성을 유발하지 않았다. 또한, 홍문동은 NGF 분비능, NGF 신호전달과정, Aβ-42 펩타이드 침적 그리고 γ-secretase 구성단백질 발현 등에 변화를 유도함으로서 신경퇴행성질환을 경감시키는 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 홍문동은 향후 알츠하이머 질환의 새로운 치료제로서 개발 가능성이 높을 것으로 사료된다.
Liriope platyphylla (LP) has long been regarded as a curative herb for the treatment of various chronic diseases including the cough and sputum in Korean, Japan and China. The effects of root of LP in asthma, brunchial lung inflammation, diabetes, obesity, atopic dermatitis and neurodegenerative dis...
Liriope platyphylla (LP) has long been regarded as a curative herb for the treatment of various chronic diseases including the cough and sputum in Korean, Japan and China. The effects of root of LP in asthma, brunchial lung inflammation, diabetes, obesity, atopic dermatitis and neurodegenerative disorders has recently been proved in several studies. Despite these primary effects of LP, a few studies have been conducted to enhance the concentration or efficacy of functional components and induce chemical transformations of therapeutic components in LP. Among the methods to increase therapeutic effect, the steaming process which firstly applied to red ginseng production was widely used in herbal medicine. Therefore, in this study, we have manufactured the Red LP (RLP) using steaming process, and then their therapeutic effect and toxicity were investigated in insulinoma cells and animal model. Firstly, to examine the effects of steaming time and frequency of manufactured RLP on the nerve growth factor (NGF) secretion ability and NGF receptor signaling pathway, the NGF concentration, cell differentiation, NGF signaling pathway and calcium concentration were analyzed in neuronal cells treated with several types of LPs manufactured under different conditions. The maximum NGF secretion was observed in the B35 cells treated with the 50 µg/ml of the LP extract steamed for 9 h (9-SLP) and with two repeated steps (3 h steaming and 24 h air-dried) carried out 7 times (7-SALP). No significant changes in viability were detected in any of the cells treated with the various LPs except for 0-SLP and 0-SALP. In addition, PC12 cell differentiation was induced by a treatment with the NGF-containing conditional medium (CM) collected from the RLP-treated cells. The high levels of TrkA and ERK phosphorylation in the high affinity NGF receptor signaling pathway were observed in the cells treated with 3-SLP or 1-SALP/3-SALP CM compared to those treated with the vehicle CM. In the low affinity NGF receptor pathway, the expression level of most components was higher in the 9-, 15- and 24-SLAP CM-treated cells than the vehicle CM-treated cells. On the other hand, this level was changed significantly in the cells treated with 3-SALP CM. Furthermore, an examination of the RLP function on calcium regulation revealed that only the LP or RLP-treated cells showed changes in the intracellular and extracellular calcium levels. RLP induced a significant decrease in the intracellular calcium level and increase in the extracellular calcium levels. Secondly, in investigating the toxic effects of RLP in mice, we observed significant alteration of liver and kidney pathologies in ICR mice treated with RLP for 3 weeks. Out of seven organs, The heart and spleen showed slightly decreased weights in the medium dosage RLP-treated group, whereas weights of other organs were maintained at constant levels in all dosage groups. In the liver toxicity analysis, the concentrations of alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), and aspartate amino-transferase (AST) were decreased in RLP-treated group compared to the vehicle-treated group. Specific pathological features such as inflammation, necrosis, and bilirubin accumulation were not observed in the liver histological analysis. Furthermore, in the kidney toxicological analysis, slight enhancement of the blood urea nitrogen (BUN) concentration was detected in the high dosage RLP-treated group compared to the vehicle-treated group. However, the serum creatinine (CA) concentration in the serum as well as the pathological features on histological section were not significantly different between the vehicle- and RLP-treated groups. Finally, to examine the therapeutic effects of RLP manufactured by steaming process on neurodegenerative disorders, significant alteration of the key factors influencing Alzheimer’s Disease (AD) was detected in NSE/hAPPsw transgenic (Tg) mice after RLP treatment. The concentration of NGF in serum increased in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice compared with vehicle-treated Tg mice. However, downstream stimulators of the NGF receptor signaling pathway, including TrkA and p75NTR proteins, were suppressed in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice. Especially, Tg mice showed decreased levels of TrkA, p75NTR, and RhoA expression. Production of Aβ-42 peptides was lower in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice than in vehicle-treated Tg mice. Furthermore, analysis of γ-secretase components showed that Aβ-42 peptide expression was downregulated. Of the four components, the expression of APH-1 and Nicastrin was decreased in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice, whereas expression of PS-2 and Pen-2 was maintained or increased within the same group. Taken together, all above results suggest that RLP manufactured with two repeated steps (3 h steaming and 24 h air-dried) carried out 7 times (7-SALP) induced the maximum NGF secretion in the B35 cells. Also, RLP does not induce any specific toxicity in the liver or kidney tissue of mice, although the BUN level was slightly increased in the high dosage RLP-treated group. Moreover RLP can help to relieve neurodegenerative diseases, especially AD, through NGF secretion ability, NGF signaling pathway, downregulation of Aβ-42 peptide deposition, and alteration of γ-secretase components.
Liriope platyphylla (LP) has long been regarded as a curative herb for the treatment of various chronic diseases including the cough and sputum in Korean, Japan and China. The effects of root of LP in asthma, brunchial lung inflammation, diabetes, obesity, atopic dermatitis and neurodegenerative disorders has recently been proved in several studies. Despite these primary effects of LP, a few studies have been conducted to enhance the concentration or efficacy of functional components and induce chemical transformations of therapeutic components in LP. Among the methods to increase therapeutic effect, the steaming process which firstly applied to red ginseng production was widely used in herbal medicine. Therefore, in this study, we have manufactured the Red LP (RLP) using steaming process, and then their therapeutic effect and toxicity were investigated in insulinoma cells and animal model. Firstly, to examine the effects of steaming time and frequency of manufactured RLP on the nerve growth factor (NGF) secretion ability and NGF receptor signaling pathway, the NGF concentration, cell differentiation, NGF signaling pathway and calcium concentration were analyzed in neuronal cells treated with several types of LPs manufactured under different conditions. The maximum NGF secretion was observed in the B35 cells treated with the 50 µg/ml of the LP extract steamed for 9 h (9-SLP) and with two repeated steps (3 h steaming and 24 h air-dried) carried out 7 times (7-SALP). No significant changes in viability were detected in any of the cells treated with the various LPs except for 0-SLP and 0-SALP. In addition, PC12 cell differentiation was induced by a treatment with the NGF-containing conditional medium (CM) collected from the RLP-treated cells. The high levels of TrkA and ERK phosphorylation in the high affinity NGF receptor signaling pathway were observed in the cells treated with 3-SLP or 1-SALP/3-SALP CM compared to those treated with the vehicle CM. In the low affinity NGF receptor pathway, the expression level of most components was higher in the 9-, 15- and 24-SLAP CM-treated cells than the vehicle CM-treated cells. On the other hand, this level was changed significantly in the cells treated with 3-SALP CM. Furthermore, an examination of the RLP function on calcium regulation revealed that only the LP or RLP-treated cells showed changes in the intracellular and extracellular calcium levels. RLP induced a significant decrease in the intracellular calcium level and increase in the extracellular calcium levels. Secondly, in investigating the toxic effects of RLP in mice, we observed significant alteration of liver and kidney pathologies in ICR mice treated with RLP for 3 weeks. Out of seven organs, The heart and spleen showed slightly decreased weights in the medium dosage RLP-treated group, whereas weights of other organs were maintained at constant levels in all dosage groups. In the liver toxicity analysis, the concentrations of alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), and aspartate amino-transferase (AST) were decreased in RLP-treated group compared to the vehicle-treated group. Specific pathological features such as inflammation, necrosis, and bilirubin accumulation were not observed in the liver histological analysis. Furthermore, in the kidney toxicological analysis, slight enhancement of the blood urea nitrogen (BUN) concentration was detected in the high dosage RLP-treated group compared to the vehicle-treated group. However, the serum creatinine (CA) concentration in the serum as well as the pathological features on histological section were not significantly different between the vehicle- and RLP-treated groups. Finally, to examine the therapeutic effects of RLP manufactured by steaming process on neurodegenerative disorders, significant alteration of the key factors influencing Alzheimer’s Disease (AD) was detected in NSE/hAPPsw transgenic (Tg) mice after RLP treatment. The concentration of NGF in serum increased in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice compared with vehicle-treated Tg mice. However, downstream stimulators of the NGF receptor signaling pathway, including TrkA and p75NTR proteins, were suppressed in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice. Especially, Tg mice showed decreased levels of TrkA, p75NTR, and RhoA expression. Production of Aβ-42 peptides was lower in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice than in vehicle-treated Tg mice. Furthermore, analysis of γ-secretase components showed that Aβ-42 peptide expression was downregulated. Of the four components, the expression of APH-1 and Nicastrin was decreased in RLP-treated NSE/hAPPsw Tg mice, whereas expression of PS-2 and Pen-2 was maintained or increased within the same group. Taken together, all above results suggest that RLP manufactured with two repeated steps (3 h steaming and 24 h air-dried) carried out 7 times (7-SALP) induced the maximum NGF secretion in the B35 cells. Also, RLP does not induce any specific toxicity in the liver or kidney tissue of mice, although the BUN level was slightly increased in the high dosage RLP-treated group. Moreover RLP can help to relieve neurodegenerative diseases, especially AD, through NGF secretion ability, NGF signaling pathway, downregulation of Aβ-42 peptide deposition, and alteration of γ-secretase components.
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