신장은 체액을 조절하는 중요한 장기로써 수분 재흡수 및 배설을 조절하여 체내 물과 무기 이온의 평형을 조절하는 중요한 역할을 한다. 최근 Aquaporin (AQP), 수분 통로의 발견은 신장의 세뇨관 상피세포를 통한 수분 이동이 AQP를 경유하는 것으로 밝혀졌다. 현재까지 10여 가지의 AQP 동위 단백이 발견 되었으며, 집합관에서 AQP2 및 ...
신장은 체액을 조절하는 중요한 장기로써 수분 재흡수 및 배설을 조절하여 체내 물과 무기 이온의 평형을 조절하는 중요한 역할을 한다. 최근 Aquaporin (AQP), 수분 통로의 발견은 신장의 세뇨관 상피세포를 통한 수분 이동이 AQP를 경유하는 것으로 밝혀졌다. 현재까지 10여 가지의 AQP 동위 단백이 발견 되었으며, 집합관에서 AQP2 및 AQP3 단백의 조절은 항이뇨 호르몬 (arginine vasopression, AVP, ADH)에 의해 활성화 되고 발현이 증가 된다고 알려 졌다. 적복령은 소나무를 벌채한 후, 4-5년이 경과한 뒤 땅속의 뿌리에서 기생하는 다공균과 (구멍버섯과)에 속한 진균인 복령의 균핵이다. 복령은 세뇨관 재흡수를 억제하여 이뇨를 증진하므로 부종을 개선하고, 파키만 다당류는 암세포 억제작용, 식균 작용, 면역글로불린의 생성증진 작용이 있으며, 항산화 작용도 있다고 보고되었다. 본 연구에서는 적복령 추출물의 국내외 문헌에 기재된 효능을 바탕으로 하여 신장의 체액조절에 미치는 영향을 알아보기 위하여 고삼투 상태에 의해 나타나는 수분통로의 변화 및 세포사멸에 미치는 영향과 puromycin aminonucleoside (PAN)으로 유발한 신증후군에 의한 신장의 변화를 알아보기 위해 연구를 진행하였다. CHAPTER I. 설치류 신장 내피수질 집합관 세포에서 적복령의 고삼투압 스트레스에 의한 AQP2의 발현 억제와 세포사멸에 대한 기전 연구 AQP2는 집합관 내강측막에 분포하며 주로 arginine vasopressin (AVP)의 조절을 받아 수분 재흡수 정도를 결정한다. AVP가 기저외측막의 V2 수용체에 결합하면 G-protein을 경유하는 adenylyl cyclase의 활성화를 일으키고, 그 결과로 세포내에 증가된 cAMP는 protein kinase A(PKA) 활성도를 높여 세뇨관 내강쪽막으로의 AQP2 이동과 단백발현을 촉진한다. 본 연구에서는 설치류 신장 내피수질 집합관 세포 (mIMCD-3)에서 적복령이 NaCl로 유발한 고삼투 스트레스에 인한 수분통로의 변화에 미치는 영향을 확인하였고, 고삼투 스트레스로 인해 세포사멸이 유도되는 것을 확인하고 적복령이 세포사멸에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 그 결과, 단백질과 mRNA 수준 모두에서 고장성 스트레스에 의해 증가된 AQP2를 적복령이 유의하게 감소하였다. 또한 AQP2의 세포막으로의 이동을 형광염색법을 통해 확인 한 결과, 고장성 스트레스에 의해 AQP2의 trafficking이 증가 되는 것을 적복령이 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 그외 고장성 스트레스에 의한 TonEBP와 SMIT의 증가 역시 적복령이 감소시켰고, Sgk1의 인산화를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 적복령을 전처리 하였을 때 KT5720과 비슷한 수준으로 AQP2의 발현을 억제시키고, cAMP의 증가 역시 억제시키는 것으로 확인되었다. 또한, 고장성 스트레스로 인해 유도되는 세포사멸을 확인하고 적복령이 세포사멸에 미치는 영향을 알아보았다. 그 결과, 고장성 스트레스에 의해 세포수 감소와 세포독성이 나타나는 것을 확인하였고, 적복령에 의해 유의적으로 회복되는 것을 확인하였다. 이것을 바탕으로 하여 아포토시스의 기작인 Bax나 caspase-3의 발현이 증가된 것을 적복령에 의해 유의하게 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 DAPI 염색을 통해 적복령이 고장성 스트레스에 의해 핵의 모양이 수축되는 것을 적복령이 회복하는 것을 확인 하였다. 이것으로 보아 세포 내의 고장성 스트레스를 적복령이 유의하게 감소시키는데, 이는 적복령이 AQP2 발현 조절 및 cAMP/PKA 경로를 통해서 신장의 체액조절 항상성을 유지시키고, 고삼투 스트레스에 의한 세포사멸을 Bax/caspase-3의 경로를 통해 항아포토시스 효과를 나타내는 것으로 사료 된다. CHAPTER II. Puromycin aminoucleoside nephrosis (PAN)에 의해 유도된 신증후군 모델에서의 적복령이 미치는 효과에 관한 연구 신증후군은 신장에 이상이 생김으로 인해 심한 단백뇨와 저알부민혈증, 고지혈증, 전신 부종을 일으키는 임상 증후군으로 혈청 단백이 소변으로 다량 소실되어 발생되는 신장 질환이다. 또한 수분 및 sodium 이온 대사의 장애를 동반하여 요 농축능 및 희석능 장애를 일으키는 것으로 알려져 있으며, AQP 및 sodium이온 운반체 (epithelial Na channel, ENaC) 단백들의 양적인 변화가 예상된다. 신증후군은 소아부터 성인에 이르기까지 다양한 연령대에 나타나며, 원인으로는 정확히 밝혀지진 않았으나 여러가지 요인으로 인해 발병된다고 추측되고 있다. 본 연구에서는 신증후군을 규명하기 위해 puromycin aminonucleoside (PAN, 75 mg/kg) 를 주사하여 유도된 신증 백서를 사용하였다. 정상군 (saline 주사 + 물 투여), 대조군 (PAN 주사 + 물 투여), 양성대조군 (PAN 주사 + Losartan 30 mg/kg/day 투여), 약물군 (PAN 주사 + 적복령 200 mg/kg/day 투여)로 나누어 7일간 실험을 진행하였다. PAN 신증 모델에서 복수의 형성 및 AQP와 ENaC의 발현 변화를 조사하여 적복령을 투여하였을 때 나타나는 변화를 조사하였다. 실험기간 동안 정상군에 비해 대조군에서 소변, 단백뇨, 복수, 혈장내 BUN, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 및 LDL 콜레스테롤 농도가 현저하게 증가된 것을 관찰 할수 있었다. 그러나, 적복령을 투여함으로써 유의성있는 감소를 확인 할 수 있었다. 또한, 소변의 농축과 관련있는 AQP2의 발현을 확인한 결과 정상군에 비해 대조군에서 유의적으로 증가하는 것을 적복령이 감소시키는 것을 확인 할 수 있었으며, 복수 형성과 관련있는 ENaC의 변화를 확인 한 결과 역시 대조군에서 유의적으로 증가하는 것을 적복령이 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다. 면역형광염색법을 이용하여 신장의 수질에서의 AQP2의 발현을 측정한 결과, 대조군에서 정상군에 비해 현저하게 증가하였고, 적복령을 투여로 인해 유의성있게 감소하였다. 이상의 결과로 PAN에 의해 유도된 신증후군 동물모델에서 적복령은 AQP2와 ENaC의 발현 억제하여 복수 형성 및 수분대사를 조절하여 신장 기능을 개선하는 효과를 나타낼 뿐만 아니라 고지혈증을 억제하여 신증후군의 진행을 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 종합적으로, 본 연구에서 적복령은 cAMP/PKA의 경로를 통하여 수분 항상성을 조절하고, Bax 경로를 통해 세포사멸을 억제하며, 병태동물모델에서 신증후군의 발병을 억제시키는 효과가 있는 것으로 사료된다.
신장은 체액을 조절하는 중요한 장기로써 수분 재흡수 및 배설을 조절하여 체내 물과 무기 이온의 평형을 조절하는 중요한 역할을 한다. 최근 Aquaporin (AQP), 수분 통로의 발견은 신장의 세뇨관 상피세포를 통한 수분 이동이 AQP를 경유하는 것으로 밝혀졌다. 현재까지 10여 가지의 AQP 동위 단백이 발견 되었으며, 집합관에서 AQP2 및 AQP3 단백의 조절은 항이뇨 호르몬 (arginine vasopression, AVP, ADH)에 의해 활성화 되고 발현이 증가 된다고 알려 졌다. 적복령은 소나무를 벌채한 후, 4-5년이 경과한 뒤 땅속의 뿌리에서 기생하는 다공균과 (구멍버섯과)에 속한 진균인 복령의 균핵이다. 복령은 세뇨관 재흡수를 억제하여 이뇨를 증진하므로 부종을 개선하고, 파키만 다당류는 암세포 억제작용, 식균 작용, 면역글로불린의 생성증진 작용이 있으며, 항산화 작용도 있다고 보고되었다. 본 연구에서는 적복령 추출물의 국내외 문헌에 기재된 효능을 바탕으로 하여 신장의 체액조절에 미치는 영향을 알아보기 위하여 고삼투 상태에 의해 나타나는 수분통로의 변화 및 세포사멸에 미치는 영향과 puromycin aminonucleoside (PAN)으로 유발한 신증후군에 의한 신장의 변화를 알아보기 위해 연구를 진행하였다. CHAPTER I. 설치류 신장 내피수질 집합관 세포에서 적복령의 고삼투압 스트레스에 의한 AQP2의 발현 억제와 세포사멸에 대한 기전 연구 AQP2는 집합관 내강측막에 분포하며 주로 arginine vasopressin (AVP)의 조절을 받아 수분 재흡수 정도를 결정한다. AVP가 기저외측막의 V2 수용체에 결합하면 G-protein을 경유하는 adenylyl cyclase의 활성화를 일으키고, 그 결과로 세포내에 증가된 cAMP는 protein kinase A(PKA) 활성도를 높여 세뇨관 내강쪽막으로의 AQP2 이동과 단백발현을 촉진한다. 본 연구에서는 설치류 신장 내피수질 집합관 세포 (mIMCD-3)에서 적복령이 NaCl로 유발한 고삼투 스트레스에 인한 수분통로의 변화에 미치는 영향을 확인하였고, 고삼투 스트레스로 인해 세포사멸이 유도되는 것을 확인하고 적복령이 세포사멸에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 그 결과, 단백질과 mRNA 수준 모두에서 고장성 스트레스에 의해 증가된 AQP2를 적복령이 유의하게 감소하였다. 또한 AQP2의 세포막으로의 이동을 형광염색법을 통해 확인 한 결과, 고장성 스트레스에 의해 AQP2의 trafficking이 증가 되는 것을 적복령이 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 그외 고장성 스트레스에 의한 TonEBP와 SMIT의 증가 역시 적복령이 감소시켰고, Sgk1의 인산화를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 적복령을 전처리 하였을 때 KT5720과 비슷한 수준으로 AQP2의 발현을 억제시키고, cAMP의 증가 역시 억제시키는 것으로 확인되었다. 또한, 고장성 스트레스로 인해 유도되는 세포사멸을 확인하고 적복령이 세포사멸에 미치는 영향을 알아보았다. 그 결과, 고장성 스트레스에 의해 세포수 감소와 세포독성이 나타나는 것을 확인하였고, 적복령에 의해 유의적으로 회복되는 것을 확인하였다. 이것을 바탕으로 하여 아포토시스의 기작인 Bax나 caspase-3의 발현이 증가된 것을 적복령에 의해 유의하게 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 DAPI 염색을 통해 적복령이 고장성 스트레스에 의해 핵의 모양이 수축되는 것을 적복령이 회복하는 것을 확인 하였다. 이것으로 보아 세포 내의 고장성 스트레스를 적복령이 유의하게 감소시키는데, 이는 적복령이 AQP2 발현 조절 및 cAMP/PKA 경로를 통해서 신장의 체액조절 항상성을 유지시키고, 고삼투 스트레스에 의한 세포사멸을 Bax/caspase-3의 경로를 통해 항아포토시스 효과를 나타내는 것으로 사료 된다. CHAPTER II. Puromycin aminoucleoside nephrosis (PAN)에 의해 유도된 신증후군 모델에서의 적복령이 미치는 효과에 관한 연구 신증후군은 신장에 이상이 생김으로 인해 심한 단백뇨와 저알부민혈증, 고지혈증, 전신 부종을 일으키는 임상 증후군으로 혈청 단백이 소변으로 다량 소실되어 발생되는 신장 질환이다. 또한 수분 및 sodium 이온 대사의 장애를 동반하여 요 농축능 및 희석능 장애를 일으키는 것으로 알려져 있으며, AQP 및 sodium이온 운반체 (epithelial Na channel, ENaC) 단백들의 양적인 변화가 예상된다. 신증후군은 소아부터 성인에 이르기까지 다양한 연령대에 나타나며, 원인으로는 정확히 밝혀지진 않았으나 여러가지 요인으로 인해 발병된다고 추측되고 있다. 본 연구에서는 신증후군을 규명하기 위해 puromycin aminonucleoside (PAN, 75 mg/kg) 를 주사하여 유도된 신증 백서를 사용하였다. 정상군 (saline 주사 + 물 투여), 대조군 (PAN 주사 + 물 투여), 양성대조군 (PAN 주사 + Losartan 30 mg/kg/day 투여), 약물군 (PAN 주사 + 적복령 200 mg/kg/day 투여)로 나누어 7일간 실험을 진행하였다. PAN 신증 모델에서 복수의 형성 및 AQP와 ENaC의 발현 변화를 조사하여 적복령을 투여하였을 때 나타나는 변화를 조사하였다. 실험기간 동안 정상군에 비해 대조군에서 소변, 단백뇨, 복수, 혈장내 BUN, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 및 LDL 콜레스테롤 농도가 현저하게 증가된 것을 관찰 할수 있었다. 그러나, 적복령을 투여함으로써 유의성있는 감소를 확인 할 수 있었다. 또한, 소변의 농축과 관련있는 AQP2의 발현을 확인한 결과 정상군에 비해 대조군에서 유의적으로 증가하는 것을 적복령이 감소시키는 것을 확인 할 수 있었으며, 복수 형성과 관련있는 ENaC의 변화를 확인 한 결과 역시 대조군에서 유의적으로 증가하는 것을 적복령이 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다. 면역형광염색법을 이용하여 신장의 수질에서의 AQP2의 발현을 측정한 결과, 대조군에서 정상군에 비해 현저하게 증가하였고, 적복령을 투여로 인해 유의성있게 감소하였다. 이상의 결과로 PAN에 의해 유도된 신증후군 동물모델에서 적복령은 AQP2와 ENaC의 발현 억제하여 복수 형성 및 수분대사를 조절하여 신장 기능을 개선하는 효과를 나타낼 뿐만 아니라 고지혈증을 억제하여 신증후군의 진행을 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 종합적으로, 본 연구에서 적복령은 cAMP/PKA의 경로를 통하여 수분 항상성을 조절하고, Bax 경로를 통해 세포사멸을 억제하며, 병태동물모델에서 신증후군의 발병을 억제시키는 효과가 있는 것으로 사료된다.
A major physiological role of the kidney is to regulate body water and urine concentration. Aquaporin-2 (AQP2), a family of water channels, plays an important role in the urinary concentrating process and regulation of water balance in the kidney. The dried sclerotia of Poria cocos Wolf (WPC) has be...
A major physiological role of the kidney is to regulate body water and urine concentration. Aquaporin-2 (AQP2), a family of water channels, plays an important role in the urinary concentrating process and regulation of water balance in the kidney. The dried sclerotia of Poria cocos Wolf (WPC) has been known used for chronic edema and nephrosis. This study was conducted to evaluate the effects of WPC on hypertonic stress (175 mM NaCl)-induced AQP2 expression in murine inner medullary collecting duct cell line (mIMCD-3). WPC significantly attenuated the hypertonicity-induced AQP2 protein and mRNA levels and blocked the apical membrane insertion of AQP2 in a concentration-dependent manner. Hypertonicity increased serum- and glucocorticoid-inducible protein kinase 1 (Sgk1) phosphorylation, however, WPC attenuated the hypertonicity-induced Sgk1 activation. Tonicity-responsive enhancer binding protein (TonEBP) mRNA was also recovered by WPC under hypertonic stress. Furthermore, pretreatment with WPC presented the similar effect with KT5720 which was decreased hypertonic stress-induced AQP2 expression. Hypertonicity increased cAMP levels and the changes were blocked by WPC. On the other hand, WPC significantly recovered hypertonic stress-injured mIMCD-3 viability and cell number. WPC markedly inhibited hypertonic stress-induced Bax or caspase-3 expression, whereas Bcl-2 expression was increased. Besides, WPC attenuated the hypertonicity-induced morphological changes in nuclei, resulting in anti-apoptotic effect. Taken together, the present data suggests that WPC has beneficial effect on the therapeutic approach to renal disorder. Nephrotic syndrome is associated with altered renal handling of water and sodium along with changes of renal abundance of aquaporins (AQP), renal epithelial Na channel (ENaC). The dried sclerotia of Poria cocos Wolf (WPC) has been known as used for chronic edema and nephrosis. To investigate WPC regulated on nephrotic syndrome-induced changes of water permeability and sodium retention. The nephrotic syndrome animal models were treated with puromycin aminonucleoside (PAN) 75 mg/kg injection and then rats were treated with losartan (30 mg/kg/day) or WPC (200 mg/kg/day) for 7 days to examine. Consequently, WPC group markedly increased urine volume and ANP extraction. However, proteinuria and ascites in the WPC group was lower than PAN group rats. The plasma level of triglyceride, total cholesterol, and low density lipoprotein (LDL)-cholesterol were significantly decreased in WPC. Besides, WPC group attenuated the PAN-induced increase in protein and mRNA levels of AQP2. In addition, WPC was significantly inhibited PAN-induced the protein abundance of ENaC subunit (?-ENaC and ?-ENaC). PAN group increased serum- and glucocorticoid-inducible protein kinase (Sgk1), sodium-myo-inositol cotransporter (SMIT), and mineralocorticoid receptor (MR) mRNA expression, however, WPC significantly suppressed. Taken together, PAN-induced nephritic syndrome was associated with water channel and ENaC subunits expression, WPC suppressed expression of AQP2 and ENaC subunits. In conclusion, this study demonstrated that WPC prevent a nephrotic syndrome.
A major physiological role of the kidney is to regulate body water and urine concentration. Aquaporin-2 (AQP2), a family of water channels, plays an important role in the urinary concentrating process and regulation of water balance in the kidney. The dried sclerotia of Poria cocos Wolf (WPC) has been known used for chronic edema and nephrosis. This study was conducted to evaluate the effects of WPC on hypertonic stress (175 mM NaCl)-induced AQP2 expression in murine inner medullary collecting duct cell line (mIMCD-3). WPC significantly attenuated the hypertonicity-induced AQP2 protein and mRNA levels and blocked the apical membrane insertion of AQP2 in a concentration-dependent manner. Hypertonicity increased serum- and glucocorticoid-inducible protein kinase 1 (Sgk1) phosphorylation, however, WPC attenuated the hypertonicity-induced Sgk1 activation. Tonicity-responsive enhancer binding protein (TonEBP) mRNA was also recovered by WPC under hypertonic stress. Furthermore, pretreatment with WPC presented the similar effect with KT5720 which was decreased hypertonic stress-induced AQP2 expression. Hypertonicity increased cAMP levels and the changes were blocked by WPC. On the other hand, WPC significantly recovered hypertonic stress-injured mIMCD-3 viability and cell number. WPC markedly inhibited hypertonic stress-induced Bax or caspase-3 expression, whereas Bcl-2 expression was increased. Besides, WPC attenuated the hypertonicity-induced morphological changes in nuclei, resulting in anti-apoptotic effect. Taken together, the present data suggests that WPC has beneficial effect on the therapeutic approach to renal disorder. Nephrotic syndrome is associated with altered renal handling of water and sodium along with changes of renal abundance of aquaporins (AQP), renal epithelial Na channel (ENaC). The dried sclerotia of Poria cocos Wolf (WPC) has been known as used for chronic edema and nephrosis. To investigate WPC regulated on nephrotic syndrome-induced changes of water permeability and sodium retention. The nephrotic syndrome animal models were treated with puromycin aminonucleoside (PAN) 75 mg/kg injection and then rats were treated with losartan (30 mg/kg/day) or WPC (200 mg/kg/day) for 7 days to examine. Consequently, WPC group markedly increased urine volume and ANP extraction. However, proteinuria and ascites in the WPC group was lower than PAN group rats. The plasma level of triglyceride, total cholesterol, and low density lipoprotein (LDL)-cholesterol were significantly decreased in WPC. Besides, WPC group attenuated the PAN-induced increase in protein and mRNA levels of AQP2. In addition, WPC was significantly inhibited PAN-induced the protein abundance of ENaC subunit (?-ENaC and ?-ENaC). PAN group increased serum- and glucocorticoid-inducible protein kinase (Sgk1), sodium-myo-inositol cotransporter (SMIT), and mineralocorticoid receptor (MR) mRNA expression, however, WPC significantly suppressed. Taken together, PAN-induced nephritic syndrome was associated with water channel and ENaC subunits expression, WPC suppressed expression of AQP2 and ENaC subunits. In conclusion, this study demonstrated that WPC prevent a nephrotic syndrome.
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