최근 생물의약품 (바이오의약품)은 세계 제약 매출의 제 10위, 혹은 제 100위권 내의 주된 종목으로 자리매김 할 뿐 아니라, 그 매출 규모가 연간 1조원을 넘는 블럭버스터급으로 인정받는 바이오의약품도 다양해졌다. 더욱이 바이오시밀러 등 특허만료에 따른 복제 생물의약품 준비에 전 세계가 매진을 하면서, 현재 바이오신약개발은 전성기를 누리고 있다. 이러한 바이오신약 개발 중 가장 기대가 되는 분야는 유전자 치료제와 백신 개발 분야이고, 이 두 분야에서 ...
최근 생물의약품 (바이오의약품)은 세계 제약 매출의 제 10위, 혹은 제 100위권 내의 주된 종목으로 자리매김 할 뿐 아니라, 그 매출 규모가 연간 1조원을 넘는 블럭버스터급으로 인정받는 바이오의약품도 다양해졌다. 더욱이 바이오시밀러 등 특허만료에 따른 복제 생물의약품 준비에 전 세계가 매진을 하면서, 현재 바이오신약개발은 전성기를 누리고 있다. 이러한 바이오신약 개발 중 가장 기대가 되는 분야는 유전자 치료제와 백신 개발 분야이고, 이 두 분야에서 아데노바이러스는 많은 장점을 가지고 있어서 가장 많이 사용되는 vector이다 (전 세계적으로 임상시험 483건 진행 중, 국내에서는 임상 및 전임상 포함하여 14건 진행 중). 아데노바이러스는 탁월한 유전자 발현효율 및 우수한 전달능력을 가진 장점으로 인해, 그 단점인 발현 기간이 짧고 면역반응이 강하다는 것을 극복하며 유전자전달체 vector 중 가장 많이 선호되고 있다. 그러나, 임상시험을 진행하는 단계부터는 최대한의 안전성을 확보하는 것이 매우 중요한데, 아데노바이러스의 경우는 Replication Competent Adeno바이러스 (RCA)를 발생하지 않는 생산세포주를 유전공학적으로 디자인하여 확립하는 연구가 매우 필요하다. 따라서 본 연구에서는 A549 세포를 이용하여 RCA가 만들어지지 않는 생산세포주를 구축하기 위해 렌티 vector 시스템으로 디자인하여 형질전환 시켰고, 계획한대로 안전하면서 생산효율성이 좋은지를 기존에 가장 많이 사용되는 아데노바이러스 생산세포주 HEK293과 비교 분석하였다. 재조합 아데노바이러스 생산 시 homologous recombination에 의해 RCA가 발생하는 것을 최소한으로 제한하기 위해, E1a와 E1b 삽입유전자를 기능성 단백질은 생산하고 상동성 재조합은 최소한이 되도록 렌티 vector 생산용 플라스미드를 디자인하였다. 이렇게 디자인된 플라스미드와 두 종류 packaging 플라스미드 DNA (pFIV-34N, pVSV-G)를 함께 293TN세포에 triple co-transfection 하여 A549 감염용 렌티 vector를 준비하였다. 이 후 아데노바이러스의 생산세포주를 구축하기 위해 Ela (Lenti-PGKP-E1a-puro)와 E1b (Lenti-E1b-Neo)를 발현하는 각 각의 렌티 vector를 A549에 감염시킨 후 염색체 삽입하여, E1a와 E1b를 다양한 비율로 발현하는 stable clones을 Puromycin (0.5 μg/mL)과 G418 (1,000 μg/mL) 항생제 처리로 스크리닝하였다. 한편, 대조군 렌티 vector (pSIF1-H1-siLuc-copGFP)도 A549 세포주에 감염하여 GFP 단백질 발현을 형광현미경으로 분석하여 형질전환 효율성도 분석하였다. Puromycin과 G418 항생제로 스크리닝하여 선별한 아데노바이러스 생산세포주 clone들은 재조합아데노바이러스(rAd-GFP)를 감염하여 생산되는 GFP 단백질발현과 CPE (cytopathic effect)현상을 함께 분석함으로써 아데노바이러스 생산효율성을 예측할 수 있었다. 그 다음으로는 가장 우수한 것으로 평가된 #54-1 clone (A549)과 HEK239에 rAd-GFP를 감염하여 대량생산 (CsCl-gradient ultracentrifugation 정제과정 포함) 효율성을 분석한 결과 HEK293의 70% 정도 생산효율성을 갖는 것으로 평가되었다. 한편, 각 생산세포주에서 대량생산된 rAd-GFP를 분석한 결과 RCA 발생면에서 #54-1 clone (A549)이 우수하다는 결과를 얻었다. 본 연구의 목적인 아데노바이러스 생산용 RCA발생이 낮은 우수하고 안전한 A549 기반 생산세포주, #54-1을 얻을 수 있었다. 향 후 #54-1의 유전적 안정성, E1a 및 E1b 삽입 유전자발현의 안정성, 생산효율성 유지조건 등 생산세포주로 확립하는데 필요한 연구를 계속해서 진행하고자 한다.
최근 생물의약품 (바이오의약품)은 세계 제약 매출의 제 10위, 혹은 제 100위권 내의 주된 종목으로 자리매김 할 뿐 아니라, 그 매출 규모가 연간 1조원을 넘는 블럭버스터급으로 인정받는 바이오의약품도 다양해졌다. 더욱이 바이오시밀러 등 특허만료에 따른 복제 생물의약품 준비에 전 세계가 매진을 하면서, 현재 바이오신약개발은 전성기를 누리고 있다. 이러한 바이오신약 개발 중 가장 기대가 되는 분야는 유전자 치료제와 백신 개발 분야이고, 이 두 분야에서 아데노바이러스는 많은 장점을 가지고 있어서 가장 많이 사용되는 vector이다 (전 세계적으로 임상시험 483건 진행 중, 국내에서는 임상 및 전임상 포함하여 14건 진행 중). 아데노바이러스는 탁월한 유전자 발현효율 및 우수한 전달능력을 가진 장점으로 인해, 그 단점인 발현 기간이 짧고 면역반응이 강하다는 것을 극복하며 유전자전달체 vector 중 가장 많이 선호되고 있다. 그러나, 임상시험을 진행하는 단계부터는 최대한의 안전성을 확보하는 것이 매우 중요한데, 아데노바이러스의 경우는 Replication Competent Adeno바이러스 (RCA)를 발생하지 않는 생산세포주를 유전공학적으로 디자인하여 확립하는 연구가 매우 필요하다. 따라서 본 연구에서는 A549 세포를 이용하여 RCA가 만들어지지 않는 생산세포주를 구축하기 위해 렌티 vector 시스템으로 디자인하여 형질전환 시켰고, 계획한대로 안전하면서 생산효율성이 좋은지를 기존에 가장 많이 사용되는 아데노바이러스 생산세포주 HEK293과 비교 분석하였다. 재조합 아데노바이러스 생산 시 homologous recombination에 의해 RCA가 발생하는 것을 최소한으로 제한하기 위해, E1a와 E1b 삽입유전자를 기능성 단백질은 생산하고 상동성 재조합은 최소한이 되도록 렌티 vector 생산용 플라스미드를 디자인하였다. 이렇게 디자인된 플라스미드와 두 종류 packaging 플라스미드 DNA (pFIV-34N, pVSV-G)를 함께 293TN세포에 triple co-transfection 하여 A549 감염용 렌티 vector를 준비하였다. 이 후 아데노바이러스의 생산세포주를 구축하기 위해 Ela (Lenti-PGKP-E1a-puro)와 E1b (Lenti-E1b-Neo)를 발현하는 각 각의 렌티 vector를 A549에 감염시킨 후 염색체 삽입하여, E1a와 E1b를 다양한 비율로 발현하는 stable clones을 Puromycin (0.5 μg/mL)과 G418 (1,000 μg/mL) 항생제 처리로 스크리닝하였다. 한편, 대조군 렌티 vector (pSIF1-H1-siLuc-copGFP)도 A549 세포주에 감염하여 GFP 단백질 발현을 형광현미경으로 분석하여 형질전환 효율성도 분석하였다. Puromycin과 G418 항생제로 스크리닝하여 선별한 아데노바이러스 생산세포주 clone들은 재조합아데노바이러스(rAd-GFP)를 감염하여 생산되는 GFP 단백질발현과 CPE (cytopathic effect)현상을 함께 분석함으로써 아데노바이러스 생산효율성을 예측할 수 있었다. 그 다음으로는 가장 우수한 것으로 평가된 #54-1 clone (A549)과 HEK239에 rAd-GFP를 감염하여 대량생산 (CsCl-gradient ultracentrifugation 정제과정 포함) 효율성을 분석한 결과 HEK293의 70% 정도 생산효율성을 갖는 것으로 평가되었다. 한편, 각 생산세포주에서 대량생산된 rAd-GFP를 분석한 결과 RCA 발생면에서 #54-1 clone (A549)이 우수하다는 결과를 얻었다. 본 연구의 목적인 아데노바이러스 생산용 RCA발생이 낮은 우수하고 안전한 A549 기반 생산세포주, #54-1을 얻을 수 있었다. 향 후 #54-1의 유전적 안정성, E1a 및 E1b 삽입 유전자발현의 안정성, 생산효율성 유지조건 등 생산세포주로 확립하는데 필요한 연구를 계속해서 진행하고자 한다.
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