바이러스성출혈성패혈증 (viral hemorrhagic septicemia, VHS)은 유럽의 무지개송어 양식장에서 대량폐사를 유발하는 바이러스성 질병으로 보고된 이후 세계동물보건기구 (World Organization for Animal Health)를 통해 주요 질병으로 지정되어 관리되고 있다. VHS의 원인 병원체인 viral hemorrhagic septicemia virus (...
바이러스성출혈성패혈증 (viral hemorrhagic septicemia, VHS)은 유럽의 무지개송어 양식장에서 대량폐사를 유발하는 바이러스성 질병으로 보고된 이후 세계동물보건기구 (World Organization for Animal Health)를 통해 주요 질병으로 지정되어 관리되고 있다. VHS의 원인 병원체인 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV)는 지난 30년간 세계 여러 국가에서 검출되고 있는데 담수어종뿐만 아니라 다양한 해산어종에서도 검출되고 있다. 국내에서는 2000년 이전까지는 VHSV가 검출된 바 없으나, 2001년 넙치 양식장에서 검출된 이후, 다양한 지역에서 보고되면서 양식산업에 큰 피해를 초래하고 있다. 이에 따라 VHSV에 대한 신속 정확한 진단법의 필요성과 VHSV의 감염 기작 등에 대한 연구의 필요성이 대두되기 시작하였다. 본 연구에서는 VHSV의 신속 정확한 진단을 위하여 국내 분리주를 이용한 qRT-PCR 법을 구축하고 현장 적용 실험을 진행하였다. 또한 단백질체 (proteome) 비교, 분석을 통하여 VHSV 감염 기작 연구에 필요한 단백질 수준의 기초자료들을 분석하였다. 국내에서 분리된 VHSV를 대상으로 qRT-PCR법을 구축하기 위하여 우선 2005년 여수에서 분리된 VHSV FYeosu05에 대한 유전체염기서열을 분석하였다. 총 10개의 클론으로 구축하여 분석한 VHSV FYeosu05의 유전체의 크기는 11,168 bp이었고 다른 어류 rhabdovirus와 마찬가지로 Nucleoprotein (N), Phosphprotein (P), Matrix protein (M), Glycoprotien (G), Non-virion protein (NV), RNA Polymerase protein (L) 유전자로 구성되어 있었으며 3′-N-P-M-G-NV-L-5′의 순서로 배열되어 있었다. 기존에 보고된 VHSV들과 유전체 염기서열을 비교해본 결과 VHSV 유전자형 IV에 속하는 분리주와 96% 이상의 유사도를 나타내었고 (JF00Ehi1, 99%; KJ2008, 99%; KRRV9822, 97%; MI03GL, 96%) 다른 분리주와는 86%의 유사도를 보였다. N protein의 서열을 이용한 계통분석을 실시한 결과 유전자형 IV에 속하는 것을 확인하였으며, 각 단백질별로 유사도를 분석한 결과에서는 L protein이 96% 이상 동일한 서열을 가지고 잘 보존되어 있었던 반면 NV protein의 경우 72~100%에 이르는 다양성을 나타내었다. 전체 유전체 분석을 통해 확보된 VHSV FYeosu05 분리주의 유전체 염기서열을 이용하여 각 유전자의 ORF를 클로닝하였고 각 유전자에 대해 한 쌍 또는 두 쌍 이상의 qRT-PCR primer들을 제작하였다. 클로닝한 ORF plasmid DNA들을 이용하여 각 primer들의 효율성을 검토해 본 결과 96% 이상의 높은 효율성을 나타내는 것을 확인하였다. 각 유전자별 primer들 중 기존에 널리 사용되고 있는 VHSV 검출 방법인 TCID50법, OIE 권고 PCR 방법등과 비교 검토하기 위해 N gene을 대상으로 하는 primer (qVN primer set: N_2_11F, N_2_160R)를 선택하여 비교 분석하였다. qVN primer는 96%의 primer 효율성을 나타내었으며 y=0.2928x + 10.4812, R2=0.9979의 회귀 분석결과를 나타내었다. FHM 세포주에 VHSV를 접종하여 시간대별로 샘플링 한 후 기존의 TCID50 값을 이용한 감염가 변화곡선과 정량적 검출 방법을 이용한 바이러스 유전체 copy 수를 비교해 본 결과, 바이러스 접종 6시간 후부터 급격하게 증가하여 3일째에 최대 감염가에 이르는 동일한 패턴의 결과를 나타내었다. 이 결과를 통해 본 연구에서 개발된 qRT-PCR을 이용한 정량적 검출 방법이 기존에 1주일 이상 소요되던 검출 방법을 하루 이내로 분석함으로써 보다 신속하고 민감도 높은 검출법이 될 수 있음을 확인하였다. 세포 수준에서 개발된 qRT-PCR 방법을 현장에 적용 가능한지 여부를 확인하고자 감염실험을 통해 VHSV에 감염된 넙치의 신장, 비장 조직으로 qRT-PCR 및 TCID50법을 이용한 감염가를 분석하였다. 총 300마리의 넙치를 150마리씩 두 수조에 나누어 105.8 TCID50/100ul/개체로 VHSV를 접종하고 한 수조에서는 폐사량을 확인하였고 다른 수조에서는 1, 3, 5, 7, 14, 28일에 각각 10마리씩 샘플링하여 조직 마쇄액을 이용한 감염가와 virus copy수를 분석하였다. VHSV 감염 후 6일째부터 VHS증상을 보이며 폐사가 일어나기 시작하였으며 22일째까지 총 63.8%로 누적폐사율을 나타냈으며 그 이후로는 폐사가 나타나지 않았다. 감염가의 경우 감염 후 1일째에 평균 102.6 TCID50/g을 나타내었고, 3일째, 5일째, 7일째에 급격하게 높아져 각각 106.5 TCID50/g, 105.3 TCID50/g, 106.3 TCID50/g을 보였으며 14일째에 103.5 TCID50/g로 감소되었다. 이와 비교하여 copy 수는 감염 후 1일째에 103.5 copy/g으로 나타났으며 감염가와 마찬가지로 3일째에 급격하게 증가하여 106.5 copy/g, 5일째에 105.3 copy/g, 7일째에 106.3 copy/g를 보였다. 14일째에는 103.5 copy/g를 나타내며 그 수가 감소함을 확인할 수 있었다. 두 결과값의 패턴은 매우 유사하게 나타나는 것으로 확인되었다. 이로써 in vitro상에서 개발되어진 정량적 검출 방법이 감염어 조직을 이용한 분석 결과에서도 비슷한 양상을 나타내며 적용이 가능함을 확인하였다.
넙치에서의 VHS 발병기작에 대한 연구를 위해 한가지 주목해왔던 현상은 넙치에서 발병하는 VHS 증상은 15℃ 사육할 경우에만 발병을 하게 되며 20℃에서 사육하게 되면 감염은 되나 발병이 되지 않는 현상이 있다. 본 연구에서는 비교 단백질체 분석을 통해 이 현상을 이해하고자 연구를 진행하였다. 단백질체 분석에 있어 중요한 요소는 분석에 필요한 샘플과 얻어진 peptide 분석결과를 해석할 수 있는 단백질 데이터베이스이다. 현재 NCBI GenBank 등록되어 있는 넙치의 단백질 서열 수는 1,000여개에 불과하여 단백질체 분석을 진행하여도 효과적인 결과를 도출할 수 가 없다. 이러한 문제점을 극복하고 효율적인 단백질 분석을 위해 넙치의 expressed sequence tag (EST)를 분석하여 자체적인 단백질 데이터베이스를 구축하고자 하였다. 넙치의 난(embryo), 뇌, 신장과 비장, 간, 개체전체(whole body)에서 cDNA library를 구축하여 총 31,104개의 EST sequence 분석을 진행하였다. 얻어진 염기서열들은 생물정보학 도구인 Pipeline for EST analysis service (PESTAS)를 이용하여 분석하였으며 3,515개의 contig와 6,632개의 singleton을 확보하였다. 이와같이 자체적으로 확보한 넙치의 EST 데이타베이스와 GenBank에 등록되어있는 넙치의 EST 데이터베이스를 통합하여 통합 EST 데이바테이스를 구축하였고 구축된 데이터베이스를 6개의 프레임으로 번역된 단백질 데이터베이스로 변환하여 단백질체 분석에 필요한 데이터베이스를 구축하였다. 다른 온도에서 사육된 넙치의 비장을 이용한 단백질체 분석결과 총 375개의 단백질이 동정되었다. VHSV를 접종하지 않고 20℃와 15℃에서 각각 사육한 넙치의 단백질체를 비교 분석한 결과 SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein (SH3BGRL), profiling (PFN), cyclophilins (PPIF), peroxiredoxin (PRDX) 그리고 14-3-3 (YWHA) 단백질들이 20℃에서 많이 발현되는 것을 확인하였고, hemoglobin subunit zeta (HBZ), keratin (KRT), moesin (MSN) 그리고 fibronectin (FN) 단백질들이 감소되어 발현되는 것을 확인하였다. HBZ, 14-3-3, heat shock protein 70, 90 단백질들은 사육온도와 VHSV감염에 대해 유의적인 차이를 나타내는 것을 관찰하였으며 이러한 단백질들을 대상으로 추후 실험을 통해 VHSV와 넙치의 상관관계를 이해할 수 있는 중요한 기본자료가 될 것으로 사료된다.
바이러스성출혈성패혈증 (viral hemorrhagic septicemia, VHS)은 유럽의 무지개송어 양식장에서 대량폐사를 유발하는 바이러스성 질병으로 보고된 이후 세계동물보건기구 (World Organization for Animal Health)를 통해 주요 질병으로 지정되어 관리되고 있다. VHS의 원인 병원체인 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV)는 지난 30년간 세계 여러 국가에서 검출되고 있는데 담수어종뿐만 아니라 다양한 해산어종에서도 검출되고 있다. 국내에서는 2000년 이전까지는 VHSV가 검출된 바 없으나, 2001년 넙치 양식장에서 검출된 이후, 다양한 지역에서 보고되면서 양식산업에 큰 피해를 초래하고 있다. 이에 따라 VHSV에 대한 신속 정확한 진단법의 필요성과 VHSV의 감염 기작 등에 대한 연구의 필요성이 대두되기 시작하였다. 본 연구에서는 VHSV의 신속 정확한 진단을 위하여 국내 분리주를 이용한 qRT-PCR 법을 구축하고 현장 적용 실험을 진행하였다. 또한 단백질체 (proteome) 비교, 분석을 통하여 VHSV 감염 기작 연구에 필요한 단백질 수준의 기초자료들을 분석하였다. 국내에서 분리된 VHSV를 대상으로 qRT-PCR법을 구축하기 위하여 우선 2005년 여수에서 분리된 VHSV FYeosu05에 대한 유전체 염기서열을 분석하였다. 총 10개의 클론으로 구축하여 분석한 VHSV FYeosu05의 유전체의 크기는 11,168 bp이었고 다른 어류 rhabdovirus와 마찬가지로 Nucleoprotein (N), Phosphprotein (P), Matrix protein (M), Glycoprotien (G), Non-virion protein (NV), RNA Polymerase protein (L) 유전자로 구성되어 있었으며 3′-N-P-M-G-NV-L-5′의 순서로 배열되어 있었다. 기존에 보고된 VHSV들과 유전체 염기서열을 비교해본 결과 VHSV 유전자형 IV에 속하는 분리주와 96% 이상의 유사도를 나타내었고 (JF00Ehi1, 99%; KJ2008, 99%; KRRV9822, 97%; MI03GL, 96%) 다른 분리주와는 86%의 유사도를 보였다. N protein의 서열을 이용한 계통분석을 실시한 결과 유전자형 IV에 속하는 것을 확인하였으며, 각 단백질별로 유사도를 분석한 결과에서는 L protein이 96% 이상 동일한 서열을 가지고 잘 보존되어 있었던 반면 NV protein의 경우 72~100%에 이르는 다양성을 나타내었다. 전체 유전체 분석을 통해 확보된 VHSV FYeosu05 분리주의 유전체 염기서열을 이용하여 각 유전자의 ORF를 클로닝하였고 각 유전자에 대해 한 쌍 또는 두 쌍 이상의 qRT-PCR primer들을 제작하였다. 클로닝한 ORF plasmid DNA들을 이용하여 각 primer들의 효율성을 검토해 본 결과 96% 이상의 높은 효율성을 나타내는 것을 확인하였다. 각 유전자별 primer들 중 기존에 널리 사용되고 있는 VHSV 검출 방법인 TCID50법, OIE 권고 PCR 방법등과 비교 검토하기 위해 N gene을 대상으로 하는 primer (qVN primer set: N_2_11F, N_2_160R)를 선택하여 비교 분석하였다. qVN primer는 96%의 primer 효율성을 나타내었으며 y=0.2928x + 10.4812, R2=0.9979의 회귀 분석결과를 나타내었다. FHM 세포주에 VHSV를 접종하여 시간대별로 샘플링 한 후 기존의 TCID50 값을 이용한 감염가 변화곡선과 정량적 검출 방법을 이용한 바이러스 유전체 copy 수를 비교해 본 결과, 바이러스 접종 6시간 후부터 급격하게 증가하여 3일째에 최대 감염가에 이르는 동일한 패턴의 결과를 나타내었다. 이 결과를 통해 본 연구에서 개발된 qRT-PCR을 이용한 정량적 검출 방법이 기존에 1주일 이상 소요되던 검출 방법을 하루 이내로 분석함으로써 보다 신속하고 민감도 높은 검출법이 될 수 있음을 확인하였다. 세포 수준에서 개발된 qRT-PCR 방법을 현장에 적용 가능한지 여부를 확인하고자 감염실험을 통해 VHSV에 감염된 넙치의 신장, 비장 조직으로 qRT-PCR 및 TCID50법을 이용한 감염가를 분석하였다. 총 300마리의 넙치를 150마리씩 두 수조에 나누어 105.8 TCID50/100ul/개체로 VHSV를 접종하고 한 수조에서는 폐사량을 확인하였고 다른 수조에서는 1, 3, 5, 7, 14, 28일에 각각 10마리씩 샘플링하여 조직 마쇄액을 이용한 감염가와 virus copy수를 분석하였다. VHSV 감염 후 6일째부터 VHS증상을 보이며 폐사가 일어나기 시작하였으며 22일째까지 총 63.8%로 누적폐사율을 나타냈으며 그 이후로는 폐사가 나타나지 않았다. 감염가의 경우 감염 후 1일째에 평균 102.6 TCID50/g을 나타내었고, 3일째, 5일째, 7일째에 급격하게 높아져 각각 106.5 TCID50/g, 105.3 TCID50/g, 106.3 TCID50/g을 보였으며 14일째에 103.5 TCID50/g로 감소되었다. 이와 비교하여 copy 수는 감염 후 1일째에 103.5 copy/g으로 나타났으며 감염가와 마찬가지로 3일째에 급격하게 증가하여 106.5 copy/g, 5일째에 105.3 copy/g, 7일째에 106.3 copy/g를 보였다. 14일째에는 103.5 copy/g를 나타내며 그 수가 감소함을 확인할 수 있었다. 두 결과값의 패턴은 매우 유사하게 나타나는 것으로 확인되었다. 이로써 in vitro상에서 개발되어진 정량적 검출 방법이 감염어 조직을 이용한 분석 결과에서도 비슷한 양상을 나타내며 적용이 가능함을 확인하였다.
넙치에서의 VHS 발병기작에 대한 연구를 위해 한가지 주목해왔던 현상은 넙치에서 발병하는 VHS 증상은 15℃ 사육할 경우에만 발병을 하게 되며 20℃에서 사육하게 되면 감염은 되나 발병이 되지 않는 현상이 있다. 본 연구에서는 비교 단백질체 분석을 통해 이 현상을 이해하고자 연구를 진행하였다. 단백질체 분석에 있어 중요한 요소는 분석에 필요한 샘플과 얻어진 peptide 분석결과를 해석할 수 있는 단백질 데이터베이스이다. 현재 NCBI GenBank 등록되어 있는 넙치의 단백질 서열 수는 1,000여개에 불과하여 단백질체 분석을 진행하여도 효과적인 결과를 도출할 수 가 없다. 이러한 문제점을 극복하고 효율적인 단백질 분석을 위해 넙치의 expressed sequence tag (EST)를 분석하여 자체적인 단백질 데이터베이스를 구축하고자 하였다. 넙치의 난(embryo), 뇌, 신장과 비장, 간, 개체전체(whole body)에서 cDNA library를 구축하여 총 31,104개의 EST sequence 분석을 진행하였다. 얻어진 염기서열들은 생물정보학 도구인 Pipeline for EST analysis service (PESTAS)를 이용하여 분석하였으며 3,515개의 contig와 6,632개의 singleton을 확보하였다. 이와같이 자체적으로 확보한 넙치의 EST 데이타베이스와 GenBank에 등록되어있는 넙치의 EST 데이터베이스를 통합하여 통합 EST 데이바테이스를 구축하였고 구축된 데이터베이스를 6개의 프레임으로 번역된 단백질 데이터베이스로 변환하여 단백질체 분석에 필요한 데이터베이스를 구축하였다. 다른 온도에서 사육된 넙치의 비장을 이용한 단백질체 분석결과 총 375개의 단백질이 동정되었다. VHSV를 접종하지 않고 20℃와 15℃에서 각각 사육한 넙치의 단백질체를 비교 분석한 결과 SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein (SH3BGRL), profiling (PFN), cyclophilins (PPIF), peroxiredoxin (PRDX) 그리고 14-3-3 (YWHA) 단백질들이 20℃에서 많이 발현되는 것을 확인하였고, hemoglobin subunit zeta (HBZ), keratin (KRT), moesin (MSN) 그리고 fibronectin (FN) 단백질들이 감소되어 발현되는 것을 확인하였다. HBZ, 14-3-3, heat shock protein 70, 90 단백질들은 사육온도와 VHSV감염에 대해 유의적인 차이를 나타내는 것을 관찰하였으며 이러한 단백질들을 대상으로 추후 실험을 통해 VHSV와 넙치의 상관관계를 이해할 수 있는 중요한 기본자료가 될 것으로 사료된다.
The genome of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) FYeosu05 isolated from olive flounder (Paralichthys olivaceus) in Yeosu, Korea was determined. Total genome size was 11,168 bp including all coding regions and intergenic sequences. The genome consisted of 6 open reading frames (ORFs) arranged ...
The genome of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) FYeosu05 isolated from olive flounder (Paralichthys olivaceus) in Yeosu, Korea was determined. Total genome size was 11,168 bp including all coding regions and intergenic sequences. The genome consisted of 6 open reading frames (ORFs) arranged in the order 3’-N-P-M-G-NV-L-5’, which is the same order found in other fish rhabdoviruses. It showed over 96 % of identity with Genogroup IV (99 % with JF00Ehil and KJ2008; 97 % with KRRV9822; 96 % with MI03GL) and 86 % with all other strains. Phylogenetic tree of the nucleoprotein (N) explicitly demonstrated the relationship of FYeosu05 with members of genotype IV. JF00Ehil, KJ2008, KRRV9822 and Makah strains were close to FYeosu05. RNA Polymerase (L) protein was highly conserved protein which had over 96 % identities while non-virion (NV) protein was most divergent protein that had from 72 to 100 % identities. TCID50 method or plaque assay are usually used to detect and quantify VHSV, which is one of the serious pathogen in olive flounder aquaculture farms in Korea. It is necessary to develop a rapid and accurate diagnostic method to detect the virus. However it takes at least 2 weeks to get result thus we applied new detection method, quantitative RT-PCR method, which is a rapid and sensitive tool. We developed a quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) method based on the VHSV nucleoprotein (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G), non-virion protein (NV), RNA-dependent RNA polymerase (L) gene sequence of a VHSV FYeosu05 isolate from Korea. Among them we selected N gene to compare previous detection methods. The qVN primer set (N_2_11F and N_2_160R) showed 96% primer efficiency (regression: y=-0.2928x + 10.4812, R2= 0.9979). The qRT-PCR method reduced detection time compared to that of TCID50 making it a very useful tool for VHSV diagnostics. The spleen and kidney of seventy fish (ten fish from 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28 days after infection) were analyzed by TCID50 and qRT-PCR method. The change of virus titer from TCID50 and viral copy number from qRT-PCR is very similar. This qRT-PCR can be very powerful tool when it use for lots of sample such as challenge test and field monitoring. There are not enough protein databases in olive flounder. Since proteomic analysis achieved base on the protein database, the accurate database is desirable for worthy searching consequence. Thus, we constructed cDNA library of olive flounder and analyzed its expressed sequence tags (ESTs). Analysis of ESTs is an efficient approach for gene discovery, expression profiling, and development of resources useful for functional genomics. Five cDNA libraries with embryo, brain, spleen plus kidney, liver and whole body was constructed and EST analysis was conducted. Analysed EST sequences were assembled by bioinformatics tool Pipeline for EST Analysis Service (PESTAS). Total 31,104 ESTs were assembled into 3,515 contigs and 6,632 singletons. All contigs and singletons were annotated by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) and incorporate it into database such as Microsoft Excel spread sheet and FASTA format db file. Since EST sequences were consisted with nucleotide sequence it is necessary to convert EST sequence into amino acid sequence to use it as a proteomic database. Thus, all EST sequences were translated with 6 frames using TransSeq program installed on Linux system. The proteomic response to rearing temperature in olive flounder infected with VHSV was analyzed using label-free protein quantitation coupled with LC？MSE tandem mass spectrometry. A total of 375 proteins from spleen were found to be differentially expressed between experimental groups based on the EST database. Among the differentially expressed proteins between 20℃ and 15℃ control group without virus infection, SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein (SH3BGRL), profiling (PFN), cyclophilins (PPIF), peroxiredoxin (PRDX) and 14-3-3 (YWHA) at 20℃ were significantly up-regulated then rearing at 15℃ while hemoglobin subunit zeta (HBZ), keratin (KRT), moesin (MSN) and fibronectin (FN) were down-regulated protein. HBZ, 14-3-3, heat shock protein 70 and 90 shows significant variation among the experimental group (20℃ control group and alive group after virus infection, 15℃ control group, alive group after virus infection and dead group after virus infection). We expect that our study offer new insight into the systemic response to viral infection of a major immune organ in teleost fish.
The genome of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) FYeosu05 isolated from olive flounder (Paralichthys olivaceus) in Yeosu, Korea was determined. Total genome size was 11,168 bp including all coding regions and intergenic sequences. The genome consisted of 6 open reading frames (ORFs) arranged in the order 3’-N-P-M-G-NV-L-5’, which is the same order found in other fish rhabdoviruses. It showed over 96 % of identity with Genogroup IV (99 % with JF00Ehil and KJ2008; 97 % with KRRV9822; 96 % with MI03GL) and 86 % with all other strains. Phylogenetic tree of the nucleoprotein (N) explicitly demonstrated the relationship of FYeosu05 with members of genotype IV. JF00Ehil, KJ2008, KRRV9822 and Makah strains were close to FYeosu05. RNA Polymerase (L) protein was highly conserved protein which had over 96 % identities while non-virion (NV) protein was most divergent protein that had from 72 to 100 % identities. TCID50 method or plaque assay are usually used to detect and quantify VHSV, which is one of the serious pathogen in olive flounder aquaculture farms in Korea. It is necessary to develop a rapid and accurate diagnostic method to detect the virus. However it takes at least 2 weeks to get result thus we applied new detection method, quantitative RT-PCR method, which is a rapid and sensitive tool. We developed a quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) method based on the VHSV nucleoprotein (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G), non-virion protein (NV), RNA-dependent RNA polymerase (L) gene sequence of a VHSV FYeosu05 isolate from Korea. Among them we selected N gene to compare previous detection methods. The qVN primer set (N_2_11F and N_2_160R) showed 96% primer efficiency (regression: y=-0.2928x + 10.4812, R2= 0.9979). The qRT-PCR method reduced detection time compared to that of TCID50 making it a very useful tool for VHSV diagnostics. The spleen and kidney of seventy fish (ten fish from 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28 days after infection) were analyzed by TCID50 and qRT-PCR method. The change of virus titer from TCID50 and viral copy number from qRT-PCR is very similar. This qRT-PCR can be very powerful tool when it use for lots of sample such as challenge test and field monitoring. There are not enough protein databases in olive flounder. Since proteomic analysis achieved base on the protein database, the accurate database is desirable for worthy searching consequence. Thus, we constructed cDNA library of olive flounder and analyzed its expressed sequence tags (ESTs). Analysis of ESTs is an efficient approach for gene discovery, expression profiling, and development of resources useful for functional genomics. Five cDNA libraries with embryo, brain, spleen plus kidney, liver and whole body was constructed and EST analysis was conducted. Analysed EST sequences were assembled by bioinformatics tool Pipeline for EST Analysis Service (PESTAS). Total 31,104 ESTs were assembled into 3,515 contigs and 6,632 singletons. All contigs and singletons were annotated by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) and incorporate it into database such as Microsoft Excel spread sheet and FASTA format db file. Since EST sequences were consisted with nucleotide sequence it is necessary to convert EST sequence into amino acid sequence to use it as a proteomic database. Thus, all EST sequences were translated with 6 frames using TransSeq program installed on Linux system. The proteomic response to rearing temperature in olive flounder infected with VHSV was analyzed using label-free protein quantitation coupled with LC？MSE tandem mass spectrometry. A total of 375 proteins from spleen were found to be differentially expressed between experimental groups based on the EST database. Among the differentially expressed proteins between 20℃ and 15℃ control group without virus infection, SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein (SH3BGRL), profiling (PFN), cyclophilins (PPIF), peroxiredoxin (PRDX) and 14-3-3 (YWHA) at 20℃ were significantly up-regulated then rearing at 15℃ while hemoglobin subunit zeta (HBZ), keratin (KRT), moesin (MSN) and fibronectin (FN) were down-regulated protein. HBZ, 14-3-3, heat shock protein 70 and 90 shows significant variation among the experimental group (20℃ control group and alive group after virus infection, 15℃ control group, alive group after virus infection and dead group after virus infection). We expect that our study offer new insight into the systemic response to viral infection of a major immune organ in teleost fish.
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