미생물 세포를 이용하여 다양한 원재료로부터 생산되는 바이오 에탄올은 최근 몇십년간 큰 관심을 받아왔다. 그러나 기존 당화 및 발효 공정은 경제성과 친환경적 측면에서의 바이오 에탄올 생산을 제한하는 장애물과 종종 직면하고 있다. 동시당화발효(SSF)는 이러한 문제를 해결하기 위한 다양한 시도 중의 하나이다. 그러나 동시당화발효는 당화와 발효 공정의 최적온도가 다르다는 점이 장애물로 작용한다. 당화효소의 최적온도 (45–50 °C) 는 발효와 미생물 성장 (25–35 °C) 에는 매우 높은 온도이다. 최근 발전으로 인해 이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 무세포 발효시스템이 제안되고 있다. 무세포 발효는 높은 온도에서의 세포의 성장과 생존능력을 제한하는 부분을 우회할 수 있는 특징을 가지고 있기 때문이다. 이번 연구는 기존의 발효 시스템의 모든 한계점을 극복하는 무세포 효소에 기반한 발효시스템의 개발을 목표로 하였다. 나아가 이러한 시스템은 변수가 통제된 조건에서의 장기적이고 지속적인 바이오에탄올 생산을 가능하게 할 수 있다.
초기에 맥주발효 폐효모액 (WBFB) 으로부터의 바이오 에탄올 생산은 동시당화발효를 통해 높은 온도에서 진행되었다. 추가적인 효소, 미생물 세포 혹은 탄수화물 없이 맥주발효 폐효모액만을 유일한 원재료로 이용하여 동시당화발효를 통한 효율적인 바이오 에탄올 생산을 하는 ‘한 용기에서의 연속적인 회분식 공정’이 새롭게 개발되었다. 25–67oC 와50 rpm 조건인 첫번째 단계에서 맥주발효 폐효모액 상등액을 이용한 회분식 바이오 에탄올 생산이 수행되었고, 뒤이어 67oC 조건인 두번째 단계에서 기존의 배양액에 3%의 맥주발효 폐효모액의 고체 잔류물이 추가되어 수행되었다. 현미경을 통한 연구로 높은 온도 (67oC) 에서 ...
미생물 세포를 이용하여 다양한 원재료로부터 생산되는 바이오 에탄올은 최근 몇십년간 큰 관심을 받아왔다. 그러나 기존 당화 및 발효 공정은 경제성과 친환경적 측면에서의 바이오 에탄올 생산을 제한하는 장애물과 종종 직면하고 있다. 동시당화발효(SSF)는 이러한 문제를 해결하기 위한 다양한 시도 중의 하나이다. 그러나 동시당화발효는 당화와 발효 공정의 최적온도가 다르다는 점이 장애물로 작용한다. 당화효소의 최적온도 (45–50 °C) 는 발효와 미생물 성장 (25–35 °C) 에는 매우 높은 온도이다. 최근 발전으로 인해 이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 무세포 발효시스템이 제안되고 있다. 무세포 발효는 높은 온도에서의 세포의 성장과 생존능력을 제한하는 부분을 우회할 수 있는 특징을 가지고 있기 때문이다. 이번 연구는 기존의 발효 시스템의 모든 한계점을 극복하는 무세포 효소에 기반한 발효시스템의 개발을 목표로 하였다. 나아가 이러한 시스템은 변수가 통제된 조건에서의 장기적이고 지속적인 바이오에탄올 생산을 가능하게 할 수 있다.
초기에 맥주발효 폐효모액 (WBFB) 으로부터의 바이오 에탄올 생산은 동시당화발효를 통해 높은 온도에서 진행되었다. 추가적인 효소, 미생물 세포 혹은 탄수화물 없이 맥주발효 폐효모액만을 유일한 원재료로 이용하여 동시당화발효를 통한 효율적인 바이오 에탄올 생산을 하는 ‘한 용기에서의 연속적인 회분식 공정’이 새롭게 개발되었다. 25–67oC 와50 rpm 조건인 첫번째 단계에서 맥주발효 폐효모액 상등액을 이용한 회분식 바이오 에탄올 생산이 수행되었고, 뒤이어 67oC 조건인 두번째 단계에서 기존의 배양액에 3%의 맥주발효 폐효모액의 고체 잔류물이 추가되어 수행되었다. 현미경을 통한 연구로 높은 온도 (67oC) 에서 효모 세포 벽의 분해가 일어났고 그 결과로 주변 배지로의 세포 물질 분비가 일어났음이 밝혀졌다. 생존 효모의 부재에도 높은 온도에서 효율적인 바이오 에탄올 생산이 가능하다는 것은 큰 발견이었다. 세포를 분해하도록 배지에 추가된 내인성가수분해 효소가 바이오 에탄올 생산 공정에 연관이 있을 것이라는 점을 추측해내었다. 이러한 일반적이지 않은 현상을 이해하기 위해, 이러한 효소가 존재하는지 맥주발효 폐효모액 특성을 조사하는 것이 매우 중요하였다.
다양한 맥아유래 가수분해 효소와 효모유래 당분해 및 발효 효소가 맥주발효 폐효모액에 존재한다는 사실이 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 와 LC-MS/MS Q-TOF 를 통해 확인되었다. 세포벽 가수분해 효소, 당 가수분해 효소, 단백질 분해 효소, 지질 가수분해 효소, 폴리페놀과 싸이올 가수분해 효소를 포함한 맥주 제조 과정에서 분비된 맥아 유래 가수분해 효소들이 맥주발효 폐효모액에 활성화된 형태로 발견되었다. 맥주발효 폐효모액으로부터 얻은 효소 추출물은 연속적인 정제단계를 통해 부분적으로 정제되었고 기질로 카복시메틸 셀룰로오스를 이용한 각 정제 단계마다 다양한 조건 하에서 가수분해 효소 활성이 측정되었다. 당화효소는 상등액과 희석된 침전물에서보다 원래 상태의 맥주발효 폐효모에서 상대적으로 훨씬 활성화되어 있는 것으로 밝혀졌다. 맥주발효 폐효모액의 맥아 유래 가수분해 효소와 효모 유래 당분해 및 발효 효소의 존재는 생존 세포가 없는 바이오 에탄올 생산하는데 관여하는 것으로 예측되었다. 하지만 발견한 사실을 확인하기 위해 몇 가지 추가 실험이 확실히 필요하였다.
높은 온도에서의 바이오 에탄올 생산에 관여하는 맥주발효 폐효모액의 무세포 효소 시스템의 존재와 활성도를 확인하기 위해, 정제된 단세포 기반 무세포 효소 시스템이 bead beating을 통해 효모 배양액으로부터 개발되었다. 효모 당분해 및 발효 효소 양쪽 모두 시스템에 존재한다는 것이 SDS-PAGE 와 LC-MS/MS Q-TOF 분석을 통해 입증되었다. 정량검사는 충분한 양의 보조인자ATP (1.8 mM) 와NADH (0.11 mM) 가 발효과정을 시작하기 위해 필요하다는 사실을 입증하였다. 기질로써 포도당의 존재 하에, 무세포 효소 시스템은 30°C 에서 60°C까지의 넓은 온도 범위와 매우 구체적인 범위인 6.0 에서 7.0. 사이의 pH 범위에서 바이오 에탄올 생산 평가가 이루어졌다. 비교 연구를 통해 기존 시스템에서 바이오 에탄올 생산을 실패했던 온도인 40°C에서 최고 (3.83 g/L) 에 도달하며 무세포 시스템의 효과가 증대되었음을 밝혀내었다. 높은 온도에서 단일 효모 세포 기반한 효소 시스템을 이용하여 성공적으로 바이오 에탄올 생산을 함으로 인해 맥주발효 폐효모액을 이용한 높은 온도에서의 바이오 에탄올 생산을 보증해주었고 동시당화발효를 통한 효율적인 바이오에탄올 생산을 위한 새로운 방법의 개발을 이끌었다.
무세포 발효 시스템을 통한 소규모 바이오 에탄올의 성공적인 생산 이후에, 무세포 효소 개발에 필요한 탄소원, 가수분해 효소, 미생물 세포의 공급원으로써 맥주발효 폐효모액을 이용한 바이오 에탄올 생산을 위한 무세포 발효 시스템의 규모확대 시도가 이루어졌다. 무세포 효소 시스템은 초음파 분쇄를 통한 맥주발효 폐효모액에 포함된 효모세포를 파쇄함으로 개발되었다. 세 가지 각각 다른 수준의 (30%, 40% and 50 %) 초음파 분쇄 정도 사이에서, 80% 충격계수, 500 kJ/L 에너지, 10oC 온도에서 효율적인 효모 세포 파쇄에는 초음파 분쇄 정도가 50% 수준이 효율적임을 알아내었다. 무세포 발효를 통해 얻은 최종 바이오 에탄올은 특수 발효조에서 40oC, 100 rpm에서 12시간 발효 후에 140.3 g/L이었다.
맥주발효 폐효모액은 맥아 유래 가수분해 효소, 영양분, 효모 배양액이 풍부한 공급원이고, 외인성 효소, 기질 혹은 미생물 세포없이 높은 온도에서 바이오 에탄올 생산을 가능케 하는 큰 잠재력을 가지고 있다고 결론지을 수 있다. 단일 효모 세포기반 무세포 효소 시스템의 개발을 통해 높은 온도에서 대규모 바이오 에탄올 생산을 위한 효율적인 시스템이 될 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 시스템은 기존의 발효와 연관된 문제점을 효율적으로 극복할 수 있다. 우리는 단일 세포기반에서 개발된 현 시스템이 바이오 연료와 바이오 제품의 장래 연구에 새로운 차원을 가져올 것으로 기대한다.
미생물 세포를 이용하여 다양한 원재료로부터 생산되는 바이오 에탄올은 최근 몇십년간 큰 관심을 받아왔다. 그러나 기존 당화 및 발효 공정은 경제성과 친환경적 측면에서의 바이오 에탄올 생산을 제한하는 장애물과 종종 직면하고 있다. 동시당화발효(SSF)는 이러한 문제를 해결하기 위한 다양한 시도 중의 하나이다. 그러나 동시당화발효는 당화와 발효 공정의 최적온도가 다르다는 점이 장애물로 작용한다. 당화효소의 최적온도 (45–50 °C) 는 발효와 미생물 성장 (25–35 °C) 에는 매우 높은 온도이다. 최근 발전으로 인해 이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 무세포 발효시스템이 제안되고 있다. 무세포 발효는 높은 온도에서의 세포의 성장과 생존능력을 제한하는 부분을 우회할 수 있는 특징을 가지고 있기 때문이다. 이번 연구는 기존의 발효 시스템의 모든 한계점을 극복하는 무세포 효소에 기반한 발효시스템의 개발을 목표로 하였다. 나아가 이러한 시스템은 변수가 통제된 조건에서의 장기적이고 지속적인 바이오에탄올 생산을 가능하게 할 수 있다.
초기에 맥주발효 폐효모액 (WBFB) 으로부터의 바이오 에탄올 생산은 동시당화발효를 통해 높은 온도에서 진행되었다. 추가적인 효소, 미생물 세포 혹은 탄수화물 없이 맥주발효 폐효모액만을 유일한 원재료로 이용하여 동시당화발효를 통한 효율적인 바이오 에탄올 생산을 하는 ‘한 용기에서의 연속적인 회분식 공정’이 새롭게 개발되었다. 25–67oC 와50 rpm 조건인 첫번째 단계에서 맥주발효 폐효모액 상등액을 이용한 회분식 바이오 에탄올 생산이 수행되었고, 뒤이어 67oC 조건인 두번째 단계에서 기존의 배양액에 3%의 맥주발효 폐효모액의 고체 잔류물이 추가되어 수행되었다. 현미경을 통한 연구로 높은 온도 (67oC) 에서 효모 세포 벽의 분해가 일어났고 그 결과로 주변 배지로의 세포 물질 분비가 일어났음이 밝혀졌다. 생존 효모의 부재에도 높은 온도에서 효율적인 바이오 에탄올 생산이 가능하다는 것은 큰 발견이었다. 세포를 분해하도록 배지에 추가된 내인성 가수분해 효소가 바이오 에탄올 생산 공정에 연관이 있을 것이라는 점을 추측해내었다. 이러한 일반적이지 않은 현상을 이해하기 위해, 이러한 효소가 존재하는지 맥주발효 폐효모액 특성을 조사하는 것이 매우 중요하였다.
다양한 맥아유래 가수분해 효소와 효모유래 당분해 및 발효 효소가 맥주발효 폐효모액에 존재한다는 사실이 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 와 LC-MS/MS Q-TOF 를 통해 확인되었다. 세포벽 가수분해 효소, 당 가수분해 효소, 단백질 분해 효소, 지질 가수분해 효소, 폴리페놀과 싸이올 가수분해 효소를 포함한 맥주 제조 과정에서 분비된 맥아 유래 가수분해 효소들이 맥주발효 폐효모액에 활성화된 형태로 발견되었다. 맥주발효 폐효모액으로부터 얻은 효소 추출물은 연속적인 정제단계를 통해 부분적으로 정제되었고 기질로 카복시메틸 셀룰로오스를 이용한 각 정제 단계마다 다양한 조건 하에서 가수분해 효소 활성이 측정되었다. 당화효소는 상등액과 희석된 침전물에서보다 원래 상태의 맥주발효 폐효모에서 상대적으로 훨씬 활성화되어 있는 것으로 밝혀졌다. 맥주발효 폐효모액의 맥아 유래 가수분해 효소와 효모 유래 당분해 및 발효 효소의 존재는 생존 세포가 없는 바이오 에탄올 생산하는데 관여하는 것으로 예측되었다. 하지만 발견한 사실을 확인하기 위해 몇 가지 추가 실험이 확실히 필요하였다.
높은 온도에서의 바이오 에탄올 생산에 관여하는 맥주발효 폐효모액의 무세포 효소 시스템의 존재와 활성도를 확인하기 위해, 정제된 단세포 기반 무세포 효소 시스템이 bead beating을 통해 효모 배양액으로부터 개발되었다. 효모 당분해 및 발효 효소 양쪽 모두 시스템에 존재한다는 것이 SDS-PAGE 와 LC-MS/MS Q-TOF 분석을 통해 입증되었다. 정량검사는 충분한 양의 보조인자 ATP (1.8 mM) 와NADH (0.11 mM) 가 발효과정을 시작하기 위해 필요하다는 사실을 입증하였다. 기질로써 포도당의 존재 하에, 무세포 효소 시스템은 30°C 에서 60°C까지의 넓은 온도 범위와 매우 구체적인 범위인 6.0 에서 7.0. 사이의 pH 범위에서 바이오 에탄올 생산 평가가 이루어졌다. 비교 연구를 통해 기존 시스템에서 바이오 에탄올 생산을 실패했던 온도인 40°C에서 최고 (3.83 g/L) 에 도달하며 무세포 시스템의 효과가 증대되었음을 밝혀내었다. 높은 온도에서 단일 효모 세포 기반한 효소 시스템을 이용하여 성공적으로 바이오 에탄올 생산을 함으로 인해 맥주발효 폐효모액을 이용한 높은 온도에서의 바이오 에탄올 생산을 보증해주었고 동시당화발효를 통한 효율적인 바이오에탄올 생산을 위한 새로운 방법의 개발을 이끌었다.
무세포 발효 시스템을 통한 소규모 바이오 에탄올의 성공적인 생산 이후에, 무세포 효소 개발에 필요한 탄소원, 가수분해 효소, 미생물 세포의 공급원으로써 맥주발효 폐효모액을 이용한 바이오 에탄올 생산을 위한 무세포 발효 시스템의 규모확대 시도가 이루어졌다. 무세포 효소 시스템은 초음파 분쇄를 통한 맥주발효 폐효모액에 포함된 효모세포를 파쇄함으로 개발되었다. 세 가지 각각 다른 수준의 (30%, 40% and 50 %) 초음파 분쇄 정도 사이에서, 80% 충격계수, 500 kJ/L 에너지, 10oC 온도에서 효율적인 효모 세포 파쇄에는 초음파 분쇄 정도가 50% 수준이 효율적임을 알아내었다. 무세포 발효를 통해 얻은 최종 바이오 에탄올은 특수 발효조에서 40oC, 100 rpm에서 12시간 발효 후에 140.3 g/L이었다.
맥주발효 폐효모액은 맥아 유래 가수분해 효소, 영양분, 효모 배양액이 풍부한 공급원이고, 외인성 효소, 기질 혹은 미생물 세포없이 높은 온도에서 바이오 에탄올 생산을 가능케 하는 큰 잠재력을 가지고 있다고 결론지을 수 있다. 단일 효모 세포기반 무세포 효소 시스템의 개발을 통해 높은 온도에서 대규모 바이오 에탄올 생산을 위한 효율적인 시스템이 될 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 시스템은 기존의 발효와 연관된 문제점을 효율적으로 극복할 수 있다. 우리는 단일 세포기반에서 개발된 현 시스템이 바이오 연료와 바이오 제품의 장래 연구에 새로운 차원을 가져올 것으로 기대한다.
Different malt hydrolyzing enzymes and yeast glycolytic and fermentation enzymes in the waste from beer fermentation broth (WBFB) were identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and LC-MS/MS Q-TOF. Hydrolyzing enzymes from malt secreted during brewing, includin...
Different malt hydrolyzing enzymes and yeast glycolytic and fermentation enzymes in the waste from beer fermentation broth (WBFB) were identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and LC-MS/MS Q-TOF. Hydrolyzing enzymes from malt secreted during brewing, including cell wall-hydrolyzing, saccharide-hydrolyzing, protein-degrading, lipid-hydrolyzing, and polyphenol and thiol-hydrolyzing enzymes, are expected to exist in an active form in WBFB. The enzyme extract obtained from WBFB was partially purified through a series of purification steps and their hydrolyzing enzyme activity was then measured under various conditions at each purification step using carboxymethyl cellulose as a substrate. Saccharification enzymes were found relatively more active in the original WBFB than supernatant and diluted sediments The best hydrolyzing activities of partially purified enzymes were found at pH 4.5 and 50 °C in a citrate buffer system. As the temperature increased gradually from 25 to 70 °C, yeast cells in the chemically defined medium with enzyme extract lost their cell wall and viability earlier than those without enzyme extract. The presence of hydrolyzing enzymes from malt in WBFB is expected to play a role in bioethanol production using simultaneous saccharification and fermentation without the need for additional enzymes, nutrients, or microbial cells via a cell-free enzyme system.
A new ‘one-pot consecutive batch strategy’ was developed for efficient bio-ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation (SSF) using WBFB without additional enzymes, microbial cells, or carbohydrates. Bio-ethanol production was conducted in batches using WBFB supernatant in the first phase at 25–67◦C and 50 rpm, followed by the addition of 3% WBFB solid residue to the existing culture broth in the second phase at 67◦C. The ethanol production increased from 50 to 102.5 g/L when bare supernatant was used in the first phase, and then to 219 g ethanol/L in the second phase. The amount of ethanol obtained using this strategy was almost equal to that obtained using the original WBFB containing 25% solid residue at 33◦C, and more than double that obtained when bare supernatant was used. Microscopic and gel electrophoresis studies revealed yeast cell wall degradation and secretion of cellular material into the surrounding medium. Scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) supported the existence of enzymes in WBFB involved in bioethanol production at elevated temperatures.
Yeast cell-free enzyme system containing intact fermentation assembly and capable of bio-ethanol production at elevated temperature in the absence of live cells was developed to cope with limitation associated with SSF. The presence of both yeast glycolytic and fermentation enzymes in the system was verified by SDS-PAGE and LC-MS/MS Q-TOF analysis. Quantitative measurement verified sufficient quantities of co-factors ATP (1.8 mM) and NADH (0.11 mM) to initiate the fermentation process. Bio-ethanol was produced at a broad temperature range of 30°C to 60°C, but was highly specific to a pH range of 6.0 to 7.0. The final bio-ethanol production at 30°C, 40°C, 50°C and 60°C was 3.37 g/L, 3.83 g/L, 1.94 g/L and 1.60 g/L, respectively, when 1% glucose solution was used. Bio-ethanol yield increased significantly with increasing cell-free enzymes concentrations. A comparative study revealed better results for the conventional fermentation system (4.46 g/L) at 30°C than the cell-free system (3.37 g/L); however, the efficacy of the cell-free system increased with temperature, reaching a maximum (3.83 g/L) at 40°C, at which point the conventional system failed to produce bio-ethanol. The successful bio-ethanol production using a single yeast cell based enzyme system at higher temperature will lead to the development of novel strategies for efficient bio-ethanol production through SSF.
After successful production of bioethanol through cell-free fermentation system at lower volume, an attempt was made to scale-up the cell-free fermentation system for bioethanol production using original WBFB function as sources of carbon sources, hydrolyzing enzymes, and microbial cell required for cell-free enzyme system development. Considering certain limitations such as viscosity of the WBFB, denaturation of enzymes etc. ultrasonication was employed instead of bead beating for the yeast cell lysis. Among the three different amplitudes (30%, 40% and 50 %) of ultrasonicator, 50% were found effective for yeast cell lysis at 80% of duty cycle, 500 kJ/L energy, and 10oC temperature. The final bioethanol obtained through cell-free fermentation was found 140.3 g/L after 12 h of fermentation carried out at 40oC and 100 rpm in a specialized fermenter.
Different malt hydrolyzing enzymes and yeast glycolytic and fermentation enzymes in the waste from beer fermentation broth (WBFB) were identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and LC-MS/MS Q-TOF. Hydrolyzing enzymes from malt secreted during brewing, including cell wall-hydrolyzing, saccharide-hydrolyzing, protein-degrading, lipid-hydrolyzing, and polyphenol and thiol-hydrolyzing enzymes, are expected to exist in an active form in WBFB. The enzyme extract obtained from WBFB was partially purified through a series of purification steps and their hydrolyzing enzyme activity was then measured under various conditions at each purification step using carboxymethyl cellulose as a substrate. Saccharification enzymes were found relatively more active in the original WBFB than supernatant and diluted sediments The best hydrolyzing activities of partially purified enzymes were found at pH 4.5 and 50 °C in a citrate buffer system. As the temperature increased gradually from 25 to 70 °C, yeast cells in the chemically defined medium with enzyme extract lost their cell wall and viability earlier than those without enzyme extract. The presence of hydrolyzing enzymes from malt in WBFB is expected to play a role in bioethanol production using simultaneous saccharification and fermentation without the need for additional enzymes, nutrients, or microbial cells via a cell-free enzyme system.
A new ‘one-pot consecutive batch strategy’ was developed for efficient bio-ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation (SSF) using WBFB without additional enzymes, microbial cells, or carbohydrates. Bio-ethanol production was conducted in batches using WBFB supernatant in the first phase at 25–67◦C and 50 rpm, followed by the addition of 3% WBFB solid residue to the existing culture broth in the second phase at 67◦C. The ethanol production increased from 50 to 102.5 g/L when bare supernatant was used in the first phase, and then to 219 g ethanol/L in the second phase. The amount of ethanol obtained using this strategy was almost equal to that obtained using the original WBFB containing 25% solid residue at 33◦C, and more than double that obtained when bare supernatant was used. Microscopic and gel electrophoresis studies revealed yeast cell wall degradation and secretion of cellular material into the surrounding medium. Scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) supported the existence of enzymes in WBFB involved in bioethanol production at elevated temperatures.
Yeast cell-free enzyme system containing intact fermentation assembly and capable of bio-ethanol production at elevated temperature in the absence of live cells was developed to cope with limitation associated with SSF. The presence of both yeast glycolytic and fermentation enzymes in the system was verified by SDS-PAGE and LC-MS/MS Q-TOF analysis. Quantitative measurement verified sufficient quantities of co-factors ATP (1.8 mM) and NADH (0.11 mM) to initiate the fermentation process. Bio-ethanol was produced at a broad temperature range of 30°C to 60°C, but was highly specific to a pH range of 6.0 to 7.0. The final bio-ethanol production at 30°C, 40°C, 50°C and 60°C was 3.37 g/L, 3.83 g/L, 1.94 g/L and 1.60 g/L, respectively, when 1% glucose solution was used. Bio-ethanol yield increased significantly with increasing cell-free enzymes concentrations. A comparative study revealed better results for the conventional fermentation system (4.46 g/L) at 30°C than the cell-free system (3.37 g/L); however, the efficacy of the cell-free system increased with temperature, reaching a maximum (3.83 g/L) at 40°C, at which point the conventional system failed to produce bio-ethanol. The successful bio-ethanol production using a single yeast cell based enzyme system at higher temperature will lead to the development of novel strategies for efficient bio-ethanol production through SSF.
After successful production of bioethanol through cell-free fermentation system at lower volume, an attempt was made to scale-up the cell-free fermentation system for bioethanol production using original WBFB function as sources of carbon sources, hydrolyzing enzymes, and microbial cell required for cell-free enzyme system development. Considering certain limitations such as viscosity of the WBFB, denaturation of enzymes etc. ultrasonication was employed instead of bead beating for the yeast cell lysis. Among the three different amplitudes (30%, 40% and 50 %) of ultrasonicator, 50% were found effective for yeast cell lysis at 80% of duty cycle, 500 kJ/L energy, and 10oC temperature. The final bioethanol obtained through cell-free fermentation was found 140.3 g/L after 12 h of fermentation carried out at 40oC and 100 rpm in a specialized fermenter.
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