최근 vitamin K2의 골다공증, 심혈관 질환, 염증 및 암 예방 효능이 밝혀짐에 따라 vitamin K2에 대한 관심이 높아지고 있다. Vitamin K2(meanquinone-7, MK-7)는 주로 대두 발효식품에 함유되어 있으나 아직까지 한국에서는 이에 대한 연구가 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 골강화 소재로 MK-7강화된 청국장을 개발하였으며, 개발된 청국장의 기능성을 규명하고자 vitamin K2함량이 강화된 청국장으로부터 분리한 MK-7 이 조골세포와 ...
최근 vitamin K2의 골다공증, 심혈관 질환, 염증 및 암 예방 효능이 밝혀짐에 따라 vitamin K2에 대한 관심이 높아지고 있다. Vitamin K2(meanquinone-7, MK-7)는 주로 대두 발효식품에 함유되어 있으나 아직까지 한국에서는 이에 대한 연구가 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 골강화 소재로 MK-7강화된 청국장을 개발하였으며, 개발된 청국장의 기능성을 규명하고자 vitamin K2함량이 강화된 청국장으로부터 분리한 MK-7 이 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 세포수준에서 연구하였으며 또한 전임상실험을 통하여 골다공증에 대한 예방 효과를 확인하고자 하였다. 1단계 연구에서는 MK-7 함량이 풍부한 청국장을 개발하기 위하여 MK-7 생산능이 높은 균주 Bacillus subtilis를 분리 • 동정 한 후 분리된 균주를 이용한 청국장의 발효조건을 최적화 하였다. 청국장 발효 시 MK-7의 생성에 대한 발효 시간, maltitiol 첨가 비율 및 균주 접종량을 요인변수로 하면서 중심합성계획에 의한 반응표면분석(response surface methodology, RSM)을 이용하여 청국장의 발효조건을 최적화 하였다. 반응표면분산 분석 결과, 발효 기간 (선형 및 2차 계수 p<0.01)과 maltitiol의 첨가 비율(2차 계수 p<0.01)이 청국장 내 MK-7의 생산에 미치는 요인변수로 확인되었다. 회귀식의 R2는 0.9564를 나타내어 실험모델식의 적합도가 매우 높고 효율적이며 실현 가능한 모델이었다. 최적의 발효시간(96시간), maltitiol 첨가량(7.51%), 균 접종량(3.69%)에서 발효된 청국장의 MK-7 함량은 51.73 μg/g으로 예측 값인 50.18 μg/g에 매우 근접하였으며, 이러한 결과들은 이 모델의 유효성과 타당성을 입증하였다. 또한 청국장을 100oC에서 60분 까지 끓였을 경우 MK-7 함량은 유의적으로 감소하지 않았다. 이러한 결과로부터, 본 실험에서 개발된 청국장은 vitamin K2 보충을 위한 기능성 식품 소재로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 2단계 연구에서는 청국장에서 분리 정제한 MK-7과 표준품 vitamin K1, MK-4가 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 분석하였다. Vitamin K1, MK-4 및 MK-7 각각의 처리에 따라 MC3T3-E1 조골세포주의 증식, 분화 및 기질 석회화에 대한 효과를 분석하였다. 그 결과 MC3T3-E1세포 증식, alkaline phosphatase (ALP) 활성, osteocalcin (OC) 합성, 기질 석회화 및 칼슘의 침착량은 모든 vitamin K 처리한 세포군에서 농도 의존적으로 증가되었다. Vitamin K처리 세포군 중 vitamin K1을 처리한 세포군의 칼슘 침착은 미약하게(45%) 촉진 하였으며 γ-carboxylation 억제제인 warfarin를 첨가한 경우 촉진효과는 소실되었다. 반면 MK-4과 MK-7을 처리한 세포군에서 각각 67%, 68%의 칼슘 침착 촉진효과를 나타내었으며 warfarin과 함께 첨가하였을 때 칼슘 침착 촉진효과가 감소되었으나 칼슘 침착양은 대조군보다 유의적으로 증가되였다. 이러한 결과로부터 vitamin K1과 vitamin K2(MK-4및 MK-7)가 조골세포의 석회화를 촉진하는 메커니즘이 다르게 작용하는 것으로 추정된다. 또한 osteoprotegerin (OPG)와 receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL)의 mRNA 비율은 대조구에 비하여 vitamin K1, MK-4 및 MK-7 처리군에서 각각 62%, 247% 및 329% 증가되었다. 이러한 결과들은 vitamin K군이 조골세포에서 OPG/RANKL의 비율을 조절하여 파골세포 형성을 억제하는 것으로 해석된다. 또한 vitamin K군이 RANKL-induced 파골세포 분화 및 골 흡수에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 MK-4와 MK-7 처리군에서 모두 독성 반응 없이 농도 의존적으로 골수 대식세포(BMMs)에서 RANKL로 인한 파골 세포 형성 억제 효과를 나타내었다. RANKL를 처리한 골수 대식세포에서 c-Fos, NFATc1, OSCAR 및 TRAP의 mRNA 발현은 NFATc1 단백질 발현 및 TRAP 활성과 유사하게 vitamin K2군으로 억제되었으며, MK-7 처리군보다 MK-4처리군이 억제효과가 유의적으로 더 높게 나타내었다. 대조적으로 같은 농도의 vitamin K1은 RANKL-induced 파골세포 형성 억제효과가 나타나지 않았으며 파골세포를 형성하는 주요 유전자의 발현 및 TRAP 활성을 유의적으로 증가시켰다. 흥미롭게도 vitamin K1, MK-4 및 MK-7 모두 파골세포의 재흡수를 농도 의존적으로 억제하였다. 이러한 결과는 RANKL-induced 파골세포 분화 억제에 vitamin K2의 side chain이 중요한 역할을 하고 있으며 파골세포 재흡수 억제 효과는 vitamin K의 naphthoquinone ring이 원인이 되는 것으로 추정된다. 따라서 이 결과들은 vitamin K1, MK-4 및 MK-7 모두 파골세포 재흡수 억제와 동시에 뼈 재생을 촉진하여 뼈의 건강을 향상시킬 수 있다는 증거를 제공한다. 3단계 연구에서는 골 소실 예방에 대한 MK-7과 MK-7 강화 청국장의 효과를 연구하기 위하여 난소를 절제한 암컷 쥐를 사용하여 동물실험을 수행하였다. 본 실험에서는 8개의 그룹, sham군; 난소절제 대조군; MK-7를 투여(2, 4, 및 8 μg/일)한 난소절제군; MK-7 강화 청국장을 투여(0.063, 0.125, 및 0.250 g/일)한 난소 절제군으로 나누어 실험하였다. 8주 동안 경구투여 한 후 몸무게, 골대사 지표, 골무기질 함량 (BMC), 골밀도 (BMD), 해면골 미세구조 및 골 조직학 특성을 측정한 결과 난소 절제군에 비해 고농도의 MK-7 (8 μg/일)을 복용한 쥐의 해면골소주 수 (p<0.05), 골무기질 함량과 골밀도는 유의적(p<0.01)으로 증가하였다. 또한 MK-7이 강화된 청국장을 투여한 그룹이 MK-7 단일 투여군 보다 골 무기질 함량, 골밀도 해면골소주 수 및 골 부피분율이 유의적 (p<0.05)으로 증가하였다. MK-7이 강화된 청국장의 억제 효과는 투여량에 의존적이었으며 최대 투여량 (0.250 g/일)을 투여한 그룹에서 골무기질 함량과 골밀도가 31.8%와 47.6%로 증가되었다(p<0.01). 이러한 동물실험 결과로부터 MK-7이 강화된 청국장은 골다공증 예방과 증세 개선측면에서 긍정적 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료되었다.
최근 vitamin K2의 골다공증, 심혈관 질환, 염증 및 암 예방 효능이 밝혀짐에 따라 vitamin K2에 대한 관심이 높아지고 있다. Vitamin K2(meanquinone-7, MK-7)는 주로 대두 발효식품에 함유되어 있으나 아직까지 한국에서는 이에 대한 연구가 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 골강화 소재로 MK-7강화된 청국장을 개발하였으며, 개발된 청국장의 기능성을 규명하고자 vitamin K2함량이 강화된 청국장으로부터 분리한 MK-7 이 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 세포수준에서 연구하였으며 또한 전임상실험을 통하여 골다공증에 대한 예방 효과를 확인하고자 하였다. 1단계 연구에서는 MK-7 함량이 풍부한 청국장을 개발하기 위하여 MK-7 생산능이 높은 균주 Bacillus subtilis를 분리 • 동정 한 후 분리된 균주를 이용한 청국장의 발효조건을 최적화 하였다. 청국장 발효 시 MK-7의 생성에 대한 발효 시간, maltitiol 첨가 비율 및 균주 접종량을 요인변수로 하면서 중심합성계획에 의한 반응표면분석(response surface methodology, RSM)을 이용하여 청국장의 발효조건을 최적화 하였다. 반응표면분산 분석 결과, 발효 기간 (선형 및 2차 계수 p<0.01)과 maltitiol의 첨가 비율(2차 계수 p<0.01)이 청국장 내 MK-7의 생산에 미치는 요인변수로 확인되었다. 회귀식의 R2는 0.9564를 나타내어 실험모델식의 적합도가 매우 높고 효율적이며 실현 가능한 모델이었다. 최적의 발효시간(96시간), maltitiol 첨가량(7.51%), 균 접종량(3.69%)에서 발효된 청국장의 MK-7 함량은 51.73 μg/g으로 예측 값인 50.18 μg/g에 매우 근접하였으며, 이러한 결과들은 이 모델의 유효성과 타당성을 입증하였다. 또한 청국장을 100oC에서 60분 까지 끓였을 경우 MK-7 함량은 유의적으로 감소하지 않았다. 이러한 결과로부터, 본 실험에서 개발된 청국장은 vitamin K2 보충을 위한 기능성 식품 소재로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 2단계 연구에서는 청국장에서 분리 정제한 MK-7과 표준품 vitamin K1, MK-4가 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 분석하였다. Vitamin K1, MK-4 및 MK-7 각각의 처리에 따라 MC3T3-E1 조골세포주의 증식, 분화 및 기질 석회화에 대한 효과를 분석하였다. 그 결과 MC3T3-E1세포 증식, alkaline phosphatase (ALP) 활성, osteocalcin (OC) 합성, 기질 석회화 및 칼슘의 침착량은 모든 vitamin K 처리한 세포군에서 농도 의존적으로 증가되었다. Vitamin K처리 세포군 중 vitamin K1을 처리한 세포군의 칼슘 침착은 미약하게(45%) 촉진 하였으며 γ-carboxylation 억제제인 warfarin를 첨가한 경우 촉진효과는 소실되었다. 반면 MK-4과 MK-7을 처리한 세포군에서 각각 67%, 68%의 칼슘 침착 촉진효과를 나타내었으며 warfarin과 함께 첨가하였을 때 칼슘 침착 촉진효과가 감소되었으나 칼슘 침착양은 대조군보다 유의적으로 증가되였다. 이러한 결과로부터 vitamin K1과 vitamin K2(MK-4및 MK-7)가 조골세포의 석회화를 촉진하는 메커니즘이 다르게 작용하는 것으로 추정된다. 또한 osteoprotegerin (OPG)와 receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL)의 mRNA 비율은 대조구에 비하여 vitamin K1, MK-4 및 MK-7 처리군에서 각각 62%, 247% 및 329% 증가되었다. 이러한 결과들은 vitamin K군이 조골세포에서 OPG/RANKL의 비율을 조절하여 파골세포 형성을 억제하는 것으로 해석된다. 또한 vitamin K군이 RANKL-induced 파골세포 분화 및 골 흡수에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 MK-4와 MK-7 처리군에서 모두 독성 반응 없이 농도 의존적으로 골수 대식세포(BMMs)에서 RANKL로 인한 파골 세포 형성 억제 효과를 나타내었다. RANKL를 처리한 골수 대식세포에서 c-Fos, NFATc1, OSCAR 및 TRAP의 mRNA 발현은 NFATc1 단백질 발현 및 TRAP 활성과 유사하게 vitamin K2군으로 억제되었으며, MK-7 처리군보다 MK-4처리군이 억제효과가 유의적으로 더 높게 나타내었다. 대조적으로 같은 농도의 vitamin K1은 RANKL-induced 파골세포 형성 억제효과가 나타나지 않았으며 파골세포를 형성하는 주요 유전자의 발현 및 TRAP 활성을 유의적으로 증가시켰다. 흥미롭게도 vitamin K1, MK-4 및 MK-7 모두 파골세포의 재흡수를 농도 의존적으로 억제하였다. 이러한 결과는 RANKL-induced 파골세포 분화 억제에 vitamin K2의 side chain이 중요한 역할을 하고 있으며 파골세포 재흡수 억제 효과는 vitamin K의 naphthoquinone ring이 원인이 되는 것으로 추정된다. 따라서 이 결과들은 vitamin K1, MK-4 및 MK-7 모두 파골세포 재흡수 억제와 동시에 뼈 재생을 촉진하여 뼈의 건강을 향상시킬 수 있다는 증거를 제공한다. 3단계 연구에서는 골 소실 예방에 대한 MK-7과 MK-7 강화 청국장의 효과를 연구하기 위하여 난소를 절제한 암컷 쥐를 사용하여 동물실험을 수행하였다. 본 실험에서는 8개의 그룹, sham군; 난소절제 대조군; MK-7를 투여(2, 4, 및 8 μg/일)한 난소절제군; MK-7 강화 청국장을 투여(0.063, 0.125, 및 0.250 g/일)한 난소 절제군으로 나누어 실험하였다. 8주 동안 경구투여 한 후 몸무게, 골대사 지표, 골무기질 함량 (BMC), 골밀도 (BMD), 해면골 미세구조 및 골 조직학 특성을 측정한 결과 난소 절제군에 비해 고농도의 MK-7 (8 μg/일)을 복용한 쥐의 해면골소주 수 (p<0.05), 골무기질 함량과 골밀도는 유의적(p<0.01)으로 증가하였다. 또한 MK-7이 강화된 청국장을 투여한 그룹이 MK-7 단일 투여군 보다 골 무기질 함량, 골밀도 해면골소주 수 및 골 부피분율이 유의적 (p<0.05)으로 증가하였다. MK-7이 강화된 청국장의 억제 효과는 투여량에 의존적이었으며 최대 투여량 (0.250 g/일)을 투여한 그룹에서 골무기질 함량과 골밀도가 31.8%와 47.6%로 증가되었다(p<0.01). 이러한 동물실험 결과로부터 MK-7이 강화된 청국장은 골다공증 예방과 증세 개선측면에서 긍정적 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료되었다.
주제어
#cheonggukjang vitamin K osteoblast osteoclast ovariectomized rats
학위논문 정보
저자
오위걸
학위수여기관
전북대학교 일반대학원
학위구분
국내박사
학과
생명공학과
발행연도
2014
총페이지
xvi, 189 p.
키워드
cheonggukjang vitamin K osteoblast osteoclast ovariectomized rats
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