새로운 bla 검출방법을 이용하여 분리한 ADC-68의 분자적, 생화학적 및 구조적 특성 Molecular, Biochemical, and Structural Characterization of ADC-68 Isolated Using a Novel bla Detection Method원문보기
전 세계적으로 나타나는 여러 다른 클래스 (클래스 A, B, C, D) 베타락탐메이즈로 인해 다재내성세균감염이 큰 위협을 가하고 있다. 베타락탐메이즈 유전자의 빠른 검출 방법은 항생제 내성유전자의 전파를 억제할 수 있으며, 감염질병 관리를 가능하게 할 수 있다. 하지만, 개발 된 내성유전자 검출방법들은 제한적으로 베타락탐메이즈 유전자만을 검출 가능하며, 임상에서 검출되는 모든 베타락탐메이즈 유전자를 할 수 검출 할 수 없다. 이러한, 제한적인 방법을 극복하기 위하여 새로운 54 ...
전 세계적으로 나타나는 여러 다른 클래스 (클래스 A, B, C, D) 베타락탐메이즈로 인해 다재내성세균감염이 큰 위협을 가하고 있다. 베타락탐메이즈 유전자의 빠른 검출 방법은 항생제 내성유전자의 전파를 억제할 수 있으며, 감염질병 관리를 가능하게 할 수 있다. 하지만, 개발 된 내성유전자 검출방법들은 제한적으로 베타락탐메이즈 유전자만을 검출 가능하며, 임상에서 검출되는 모든 베타락탐메이즈 유전자를 할 수 검출 할 수 없다. 이러한, 제한적인 방법을 극복하기 위하여 새로운 54 프라이머를 이용하여 신속하고 정확한 검출방법을 개발, 최적화를 진행하였다. 새로운 베타락탐메이즈 검출 방법 (LARGE-SCALEblaFinder)을 이용하여, 이전에 연구되어진 대조균주들을 사용하여 확인 하였다. 또한, 임상에서 분리되어 진 미확인 된 내성균주를 사용하여 항생제 내성유전자를 확인하였다. 172 종의 대조 균주와 403종의 임상균주에서 완벽한 민감도와 특이성을 확인 하였고, LARGE-SCALEblaFinder이용하여 모든 임상 균주에서 베타락탐메이즈 유전자를 검출 되었다. 특히, 대조균주들 중 이전 연구에서 나오지 않은 24 종의 새로운 베타락탐메이즈 유전자를 검출 하였다. 이 결과, 새롭게 개발되어진 방법 (LARGE-SCALEblaFinder) 을 이용하여 내성균주내에 존재하는 대부분의 베타락탐메이즈 유전자를 검출 가능 하다는 것을 확인 하였다. LARGE-SCALEblaFinder를 이용하여 항생제 내성 균주내에 존재하는 베타락탐메이즈 유전자를 모니터링과 베타락템메이즈 전파를 확인 하는 중요한 방법으로 사용가능 할 것으로 사료된다. LARGE-SCALEblaFinder를 이용하여 클래스 C 베타락탐메이즈인 새로운 Acinetobacter-derived cephlosporinase (ADC-68)을 카바페넴 내성 균주인 Acinetobacter baumannii D015로부터 검출 하였다. ADC-68유전자는 Southern blot 과 draft genome sequencing분석을 통하여 chromosome 상에 존재하는 것을 확인 하였다. A. baumannii D015와 ADC-68의 MIC (minimal inhibition concentration)와 kinetic 측정을 여러 항생제를 이용하여 진행한 결과, penicillin, narrow- 그리고 extended-sepctrum cephalosporin, carbapenem 항생제를 가수분해하는 것을 확인 하였다. 1.8 Å 의 ADC-68 단백질 구조를 풀었다. ADC-68단백질 구조와 ADC-1 (non-carbapenemase)의 단백질 구조 분석 결과, catalytic serin (S66) 근처에 R1 subsite와 R2 subsite를 구성하는 Ω-루프와 C-루프에 차이점을 확인하였다. ADC-68 에 안정 된 C-루프에 의하여 R2 subsite 가open conformation을 형성하고, 이 영향으로 R2 side-chain이 큰 carbapenem 항생제가 용이하게 R2 subsite에 들어갈 수 있게 하였다. 또한, R2-루프에 wide-open conformation인해 ADC-68 이 extended-spectrum cephalosporin 항생제가 들어감으로써 가수분해 할 수 있었으며, ADC-68은 임상에서 중요한 항생제 (extended-sepctrum cephalosporin, carbapenem)에 내성을 보이는 것을 확인 하였다. 이런 결과, ADC-68은 클래스 C 베타락탐메이즈 중 처음으로 chromosome상에 존재하며, extended-sepctrum cephalosporin 과carbapenem 항생제에 내성을 보이는 것을 확인 하였다.
전 세계적으로 나타나는 여러 다른 클래스 (클래스 A, B, C, D) 베타락탐메이즈로 인해 다재내성세균감염이 큰 위협을 가하고 있다. 베타락탐메이즈 유전자의 빠른 검출 방법은 항생제 내성유전자의 전파를 억제할 수 있으며, 감염질병 관리를 가능하게 할 수 있다. 하지만, 개발 된 내성유전자 검출방법들은 제한적으로 베타락탐메이즈 유전자만을 검출 가능하며, 임상에서 검출되는 모든 베타락탐메이즈 유전자를 할 수 검출 할 수 없다. 이러한, 제한적인 방법을 극복하기 위하여 새로운 54 프라이머를 이용하여 신속하고 정확한 검출방법을 개발, 최적화를 진행하였다. 새로운 베타락탐메이즈 검출 방법 (LARGE-SCALEblaFinder)을 이용하여, 이전에 연구되어진 대조균주들을 사용하여 확인 하였다. 또한, 임상에서 분리되어 진 미확인 된 내성균주를 사용하여 항생제 내성유전자를 확인하였다. 172 종의 대조 균주와 403종의 임상균주에서 완벽한 민감도와 특이성을 확인 하였고, LARGE-SCALEblaFinder이용하여 모든 임상 균주에서 베타락탐메이즈 유전자를 검출 되었다. 특히, 대조균주들 중 이전 연구에서 나오지 않은 24 종의 새로운 베타락탐메이즈 유전자를 검출 하였다. 이 결과, 새롭게 개발되어진 방법 (LARGE-SCALEblaFinder) 을 이용하여 내성균주내에 존재하는 대부분의 베타락탐메이즈 유전자를 검출 가능 하다는 것을 확인 하였다. LARGE-SCALEblaFinder를 이용하여 항생제 내성 균주내에 존재하는 베타락탐메이즈 유전자를 모니터링과 베타락템메이즈 전파를 확인 하는 중요한 방법으로 사용가능 할 것으로 사료된다. LARGE-SCALEblaFinder를 이용하여 클래스 C 베타락탐메이즈인 새로운 Acinetobacter-derived cephlosporinase (ADC-68)을 카바페넴 내성 균주인 Acinetobacter baumannii D015로부터 검출 하였다. ADC-68유전자는 Southern blot 과 draft genome sequencing분석을 통하여 chromosome 상에 존재하는 것을 확인 하였다. A. baumannii D015와 ADC-68의 MIC (minimal inhibition concentration)와 kinetic 측정을 여러 항생제를 이용하여 진행한 결과, penicillin, narrow- 그리고 extended-sepctrum cephalosporin, carbapenem 항생제를 가수분해하는 것을 확인 하였다. 1.8 Å 의 ADC-68 단백질 구조를 풀었다. ADC-68단백질 구조와 ADC-1 (non-carbapenemase)의 단백질 구조 분석 결과, catalytic serin (S66) 근처에 R1 subsite와 R2 subsite를 구성하는 Ω-루프와 C-루프에 차이점을 확인하였다. ADC-68 에 안정 된 C-루프에 의하여 R2 subsite 가open conformation을 형성하고, 이 영향으로 R2 side-chain이 큰 carbapenem 항생제가 용이하게 R2 subsite에 들어갈 수 있게 하였다. 또한, R2-루프에 wide-open conformation인해 ADC-68 이 extended-spectrum cephalosporin 항생제가 들어감으로써 가수분해 할 수 있었으며, ADC-68은 임상에서 중요한 항생제 (extended-sepctrum cephalosporin, carbapenem)에 내성을 보이는 것을 확인 하였다. 이런 결과, ADC-68은 클래스 C 베타락탐메이즈 중 처음으로 chromosome상에 존재하며, extended-sepctrum cephalosporin 과carbapenem 항생제에 내성을 보이는 것을 확인 하였다.
Worldwide outbreaks of multidrug-resistant bacterial infections have become more frequent owing to the emergence of several different classes of β-lactamases. Fast detection of β-lactamase (bla) genes allow improved surveillance studies and infection control measures, which can minimize the spread o...
Worldwide outbreaks of multidrug-resistant bacterial infections have become more frequent owing to the emergence of several different classes of β-lactamases. Fast detection of β-lactamase (bla) genes allow improved surveillance studies and infection control measures, which can minimize the spread of antibiotic resistance. Although several molecular diagnostic methods have been developed to detect some (limited) bla gene types, these methods have significant limitations, such as their failure to detect almost all clinically available bla genes. I developed a fast and accurate molecular method to overcome these limitations using 54 primer pairs, which are designed through elaborate optimization processes. To verify the ability of this large-scale bla detection method (LARGE-SCALEblaFinder), assays were performed on previously-reported bacterial control isolates (or strains). To confirm the applicability of the LARGE-SCALEblaFinder, assays were performed on unreported clinical isolates. With perfect specificity and sensitivity in 172 control isolates (or strains) and 403 clinical isolates, the LARGE-SCALEblaFinder could detect almost all clinically available bla genes. Notably, the LARGE-SCALEblaFinder detected 24 additional unreported bla genes in the isolates (or strains) that were previously studied, suggesting that previous methods detecting only limited types of bla genes can miss unexpected bla genes existing in pathogenic bacteria and this method have the ability to detect almost all bla genes existing in a clinical isolate. The large-scale bla detection ability of LARGE-SCALEblaFinder enables prompt application of the detection of almost all bla genes in bacterial pathogens. The widespread use of the LARGE-SCALEblaFinder in the future will provide an important aid for monitoring the emergence and dissemination of bla genes and minimizing the spread of resistant bacteria. Using the LARGE-SCALEblaFinder approach, a new type of an Acinetobacter-derived cephlosporinase (ADC-68), which bolong to class C β-lactamase, was isolated from the carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii D015. The blaADC-68 gene, which encodes ADC-68, was confirmed to exist on the chromosome via Southern blot analysis and draft genome sequencing. The catalytic kinetics of β-lactams and their MICs (minimum inhibitory concentrations) for A. baumannii D015 and purified ADC-68 (a carbapenemase obtained from this strain) were assessed; this strain was resistant to penicillins, narrow- and extended-spectrum cephalosporins, and carbapenems and ADC-68 could hydrolyze these antibiotics. The crystal structure of ADC-68 was determined at a resolution of 1.8 Å. The structure of ADC-68 was compared with that of ADC-1 (a non-carbapenemase); the differences were in the central part of the Ω-loop and the C-loop constituting the edge of the R1 and R2 subsites, which are closed to the catalytic serine residue S66. The ADC-68 C-loop stabilized the open conformation for the upper R2 subsite and could permit the access of carbapenems with big R2 side-chains. Furthermore, a wide-open conformation of the R2-loop allowed ADC-68 to bind and to hydrolyze extended-spectrum cephalosporins. Therefore, ADC-68 had enhanced catalytic efficiency against these clinically important β-lactams (extended-spectrum cephalosporins and carbapenems). ADC-68 is the first reported chromosomal class C β-lactamase possessing class C extended-spectrum β-lactamase and carbapenemase activities.
Worldwide outbreaks of multidrug-resistant bacterial infections have become more frequent owing to the emergence of several different classes of β-lactamases. Fast detection of β-lactamase (bla) genes allow improved surveillance studies and infection control measures, which can minimize the spread of antibiotic resistance. Although several molecular diagnostic methods have been developed to detect some (limited) bla gene types, these methods have significant limitations, such as their failure to detect almost all clinically available bla genes. I developed a fast and accurate molecular method to overcome these limitations using 54 primer pairs, which are designed through elaborate optimization processes. To verify the ability of this large-scale bla detection method (LARGE-SCALEblaFinder), assays were performed on previously-reported bacterial control isolates (or strains). To confirm the applicability of the LARGE-SCALEblaFinder, assays were performed on unreported clinical isolates. With perfect specificity and sensitivity in 172 control isolates (or strains) and 403 clinical isolates, the LARGE-SCALEblaFinder could detect almost all clinically available bla genes. Notably, the LARGE-SCALEblaFinder detected 24 additional unreported bla genes in the isolates (or strains) that were previously studied, suggesting that previous methods detecting only limited types of bla genes can miss unexpected bla genes existing in pathogenic bacteria and this method have the ability to detect almost all bla genes existing in a clinical isolate. The large-scale bla detection ability of LARGE-SCALEblaFinder enables prompt application of the detection of almost all bla genes in bacterial pathogens. The widespread use of the LARGE-SCALEblaFinder in the future will provide an important aid for monitoring the emergence and dissemination of bla genes and minimizing the spread of resistant bacteria. Using the LARGE-SCALEblaFinder approach, a new type of an Acinetobacter-derived cephlosporinase (ADC-68), which bolong to class C β-lactamase, was isolated from the carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii D015. The blaADC-68 gene, which encodes ADC-68, was confirmed to exist on the chromosome via Southern blot analysis and draft genome sequencing. The catalytic kinetics of β-lactams and their MICs (minimum inhibitory concentrations) for A. baumannii D015 and purified ADC-68 (a carbapenemase obtained from this strain) were assessed; this strain was resistant to penicillins, narrow- and extended-spectrum cephalosporins, and carbapenems and ADC-68 could hydrolyze these antibiotics. The crystal structure of ADC-68 was determined at a resolution of 1.8 Å. The structure of ADC-68 was compared with that of ADC-1 (a non-carbapenemase); the differences were in the central part of the Ω-loop and the C-loop constituting the edge of the R1 and R2 subsites, which are closed to the catalytic serine residue S66. The ADC-68 C-loop stabilized the open conformation for the upper R2 subsite and could permit the access of carbapenems with big R2 side-chains. Furthermore, a wide-open conformation of the R2-loop allowed ADC-68 to bind and to hydrolyze extended-spectrum cephalosporins. Therefore, ADC-68 had enhanced catalytic efficiency against these clinically important β-lactams (extended-spectrum cephalosporins and carbapenems). ADC-68 is the first reported chromosomal class C β-lactamase possessing class C extended-spectrum β-lactamase and carbapenemase activities.
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