본 연구에서는 카로티노이드 또는 케토형 카로티노이드의 함량이 증가된 감자를 개발하기 위한 대사공학기술을 확립하여 사막화 또는 조건불리지역에서 재배가 가능한 형질전환 감자 계통을 육성하기 위한 모본을 개발하고자 하였다. 기존에 형질전환기술이 확립되어 있는 국내육성종인 조원품종을 대조구로 하여 중국에서 가장 많이 재배되고 있는 대서 품종을 대상으로 형질전환 효율을 증가시키고, 케토형 카로티노이드와 카로티노이드의 생합성대사에 관련된 유전자들의 과발현으로 ...
본 연구에서는 카로티노이드 또는 케토형 카로티노이드의 함량이 증가된 감자를 개발하기 위한 대사공학기술을 확립하여 사막화 또는 조건불리지역에서 재배가 가능한 형질전환 감자 계통을 육성하기 위한 모본을 개발하고자 하였다. 기존에 형질전환기술이 확립되어 있는 국내육성종인 조원품종을 대조구로 하여 중국에서 가장 많이 재배되고 있는 대서 품종을 대상으로 형질전환 효율을 증가시키고, 케토형 카로티노이드와 카로티노이드의 생합성대사에 관련된 유전자들의 과발현으로 항산화능이 증가된 감자계통을 개발하기위하여 수행한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 조원은 sucrose를 탄소원으로 하는 M3 media에 계속 배양한 경우에 잎은 10.1%, 줄기는 8.9%의 최종 형질전환 효율을 보였으며, 4주 배양 후 glucose를 탄소원으로 하는 배지에 옮긴 경우, 잎에서는 18.4%, 줄기에서는 16.3%로 형질전환 효율이 증가하였다. 그러나 본 연구의 최종 목적인 대서품종에 대한 형질전환 효율은 극히 저조한 형질전환 효율을 나타내었다. 2. 본 연구를 통하여 조사한 결과, 대서품종은 조원과 달리 오랫동안 기내에서 유지 보존된 식물체로부터 채취한 절편조직으로부터는 형질전환효율이 극히 저조한 사실을 알았다. 따라서 기내에서 오랫동안 유지한 식물체로부터 micro-tuber를 생산한 후 필요할 때마다 이들 micro-tuber로부터 생산한 신선한 신초(fresh explant)를 대상으로 형질전환을 수행한 결과 약 4.3%까지 형질전환효율을 증진 시킬 수 있었다. 3. 한편, 케토형 카로티노이드의 함량을 증진시키기 위하여 기존에 형질전환 기술이 확립된 조원을 대조구로 하고, 육색이 노란색을 띄는 하령과 골든벨리 계통을 대상으로 Haematococcus pulvialis에서 분리한 CrtO 유전자를 저장뿌리용 당유도성 (ibAGP1), 저장뿌리 특이 (ibMADS) 및 전신발현용 35S 프로모터를 사용하고, phytoene과 베타카로틴의 함량을 높이기 위해 Psy와 CrtI 유전자를 동시에 과 발현시킬 수 있는 다중발현 벡터 시스템 (PAC)을 각각 또는 CrtO와 PAC운반체를 동시에 도입시키기 위한 co-transformation기술로 형질전환시킨 결과, 각 품종별로 ibAGP1과 ibMADS 프로모터를 사용한 운반체에서 다수의 형질전환체들을 확보할 수 있었다. 그러나 특이하게도 CaMV35S를 사용한 운반체가 도입된 개체는 확보할 수 없었다. 4. RT-PCR기술을 이용하여 형질전환식물체의 카로티노이드 생합성관련 유전자의 발현도를 조사한 결과, CrtO 또는 PAC운반체를 각각 도입한 것과 co-transformation으로 동시에 도입한 형질전환체들로부터 CrtO와 PAC에 대한 mRNA가 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다. 그러나 이들 유전자의 과 발현에 의하여 카로티노이드 생합성 관련 유전자들의 전사수준에 현저한 증감을 보이는 경향은 보이지 않았다. 5. 최종 산물인 케토형 카로티노이드의 조성을 분석하여 본 결과, 총 44종의 조원감자 형질전환체 중 ibAGP1+tp+CrtO 운반체가 도입된 형질전환체 7개체 (2, 8, 9, 14, 16, 22, 24), ibAGP1+tp+CrtO 운반체와 ibAGP1+PAC 운반체가 co-transformation으로 동시에 도입한 형질전환체 4종(7, 8, 11, 15), ibMADS+tp+ CrtO 운반체와 ibMADS+PAC 운반체를 co-transformation으로 동시에 도입한 형질전환식물체 3종(1, 4, 5)에서 자연환경에서 자라는 식물에서는 합성되지 못하는 astaxanthin이 축적되었음을 확인하였으나, 그 함량의 수준이 아주 미비하여 육색의 색도가 변할 정도는 아니어서 함량을 높이기 위한 추가 연구가 더 필요한 것으로 조사되었다. 6. 그러나 속살이 노란색으로 나타나 기존의 카로티노이드 함량이 조원보다 높게 조사되었던 하령과 골든밸리에 각각의 운반체들을 도입한 형질전환체로부터는 케토형 카로티노이드인 astaxanthin을 비롯한 adonirubin, echinenone 등이 검출되지 않았다. 7. CrtO 유전자와 PAC유전자가 동시에 도입된 것으로 확인된 형질전환 조원계통을 다수 확보하였음에도 불구하고 최종산물인 케토형카로티노이드 함량이 낮은 이유는 케토형카로티노이드의 전구물질인 β-carotene 등의 함량이 높지 않은 것이 주 원인으로 사료되었다. 따라서, 먼저 β-carotene을 포한한 카로티노이드의 함량을 증진 시키기 위하여 고구마에서 분리한 IbOr 유전자를 삽입한 SOR 및 POR 발현백터를 이용하여 형질전환을 수행하여 확보한 후보형질전환 계통에 대하여 각각 PCR 및 RT-PCR로 확인한 결과 SOR (SWAP2-IbOr)발현 벡터 23계통, POR(Patatin-IbOr)발현 벡터 63계통을 확보할 수 있었으며, genomic southern blot hybridization 기술을 이용하여 이들 식물체에 도입된 유전자의 copy 수를 조사한 결과 다수의 one copy가 도입된 식물체를 확인할 수 있었다. 또한 단일 카피로 내재하고 있는 것으로 알려진 urease유전자를 대조구로 하여 qRT-PCR실험을 수행한 결과 형질전환 감자 식물체내에 도입된 유전자의 카피수를 확인할 수 있는 간단한 기술을 확립하였다. 8. 형질전환식물체를 대상으로 카로티노이드 조성을 분석한 결과, 카로티노이드 함량이 최고 2.7배까지 증가하였으며, 모본으로 사용한 비형질전환체에 존재하든 기존의 카로티노이드가 증가한 것을 확인하였다. 9. DPPH를 이용한 라디칼 소거능의 측정, DAB 염색법, MV처리 등에 의한
본 연구에서는 카로티노이드 또는 케토형 카로티노이드의 함량이 증가된 감자를 개발하기 위한 대사공학기술을 확립하여 사막화 또는 조건불리지역에서 재배가 가능한 형질전환 감자 계통을 육성하기 위한 모본을 개발하고자 하였다. 기존에 형질전환기술이 확립되어 있는 국내육성종인 조원품종을 대조구로 하여 중국에서 가장 많이 재배되고 있는 대서 품종을 대상으로 형질전환 효율을 증가시키고, 케토형 카로티노이드와 카로티노이드의 생합성대사에 관련된 유전자들의 과발현으로 항산화능이 증가된 감자계통을 개발하기위하여 수행한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 조원은 sucrose를 탄소원으로 하는 M3 media에 계속 배양한 경우에 잎은 10.1%, 줄기는 8.9%의 최종 형질전환 효율을 보였으며, 4주 배양 후 glucose를 탄소원으로 하는 배지에 옮긴 경우, 잎에서는 18.4%, 줄기에서는 16.3%로 형질전환 효율이 증가하였다. 그러나 본 연구의 최종 목적인 대서품종에 대한 형질전환 효율은 극히 저조한 형질전환 효율을 나타내었다. 2. 본 연구를 통하여 조사한 결과, 대서품종은 조원과 달리 오랫동안 기내에서 유지 보존된 식물체로부터 채취한 절편조직으로부터는 형질전환효율이 극히 저조한 사실을 알았다. 따라서 기내에서 오랫동안 유지한 식물체로부터 micro-tuber를 생산한 후 필요할 때마다 이들 micro-tuber로부터 생산한 신선한 신초(fresh explant)를 대상으로 형질전환을 수행한 결과 약 4.3%까지 형질전환효율을 증진 시킬 수 있었다. 3. 한편, 케토형 카로티노이드의 함량을 증진시키기 위하여 기존에 형질전환 기술이 확립된 조원을 대조구로 하고, 육색이 노란색을 띄는 하령과 골든벨리 계통을 대상으로 Haematococcus pulvialis에서 분리한 CrtO 유전자를 저장뿌리용 당유도성 (ibAGP1), 저장뿌리 특이 (ibMADS) 및 전신발현용 35S 프로모터를 사용하고, phytoene과 베타카로틴의 함량을 높이기 위해 Psy와 CrtI 유전자를 동시에 과 발현시킬 수 있는 다중발현 벡터 시스템 (PAC)을 각각 또는 CrtO와 PAC운반체를 동시에 도입시키기 위한 co-transformation기술로 형질전환시킨 결과, 각 품종별로 ibAGP1과 ibMADS 프로모터를 사용한 운반체에서 다수의 형질전환체들을 확보할 수 있었다. 그러나 특이하게도 CaMV35S를 사용한 운반체가 도입된 개체는 확보할 수 없었다. 4. RT-PCR기술을 이용하여 형질전환식물체의 카로티노이드 생합성관련 유전자의 발현도를 조사한 결과, CrtO 또는 PAC운반체를 각각 도입한 것과 co-transformation으로 동시에 도입한 형질전환체들로부터 CrtO와 PAC에 대한 mRNA가 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다. 그러나 이들 유전자의 과 발현에 의하여 카로티노이드 생합성 관련 유전자들의 전사수준에 현저한 증감을 보이는 경향은 보이지 않았다. 5. 최종 산물인 케토형 카로티노이드의 조성을 분석하여 본 결과, 총 44종의 조원감자 형질전환체 중 ibAGP1+tp+CrtO 운반체가 도입된 형질전환체 7개체 (2, 8, 9, 14, 16, 22, 24), ibAGP1+tp+CrtO 운반체와 ibAGP1+PAC 운반체가 co-transformation으로 동시에 도입한 형질전환체 4종(7, 8, 11, 15), ibMADS+tp+ CrtO 운반체와 ibMADS+PAC 운반체를 co-transformation으로 동시에 도입한 형질전환식물체 3종(1, 4, 5)에서 자연환경에서 자라는 식물에서는 합성되지 못하는 astaxanthin이 축적되었음을 확인하였으나, 그 함량의 수준이 아주 미비하여 육색의 색도가 변할 정도는 아니어서 함량을 높이기 위한 추가 연구가 더 필요한 것으로 조사되었다. 6. 그러나 속살이 노란색으로 나타나 기존의 카로티노이드 함량이 조원보다 높게 조사되었던 하령과 골든밸리에 각각의 운반체들을 도입한 형질전환체로부터는 케토형 카로티노이드인 astaxanthin을 비롯한 adonirubin, echinenone 등이 검출되지 않았다. 7. CrtO 유전자와 PAC유전자가 동시에 도입된 것으로 확인된 형질전환 조원계통을 다수 확보하였음에도 불구하고 최종산물인 케토형카로티노이드 함량이 낮은 이유는 케토형카로티노이드의 전구물질인 β-carotene 등의 함량이 높지 않은 것이 주 원인으로 사료되었다. 따라서, 먼저 β-carotene을 포한한 카로티노이드의 함량을 증진 시키기 위하여 고구마에서 분리한 IbOr 유전자를 삽입한 SOR 및 POR 발현백터를 이용하여 형질전환을 수행하여 확보한 후보형질전환 계통에 대하여 각각 PCR 및 RT-PCR로 확인한 결과 SOR (SWAP2-IbOr)발현 벡터 23계통, POR(Patatin-IbOr)발현 벡터 63계통을 확보할 수 있었으며, genomic southern blot hybridization 기술을 이용하여 이들 식물체에 도입된 유전자의 copy 수를 조사한 결과 다수의 one copy가 도입된 식물체를 확인할 수 있었다. 또한 단일 카피로 내재하고 있는 것으로 알려진 urease유전자를 대조구로 하여 qRT-PCR실험을 수행한 결과 형질전환 감자 식물체내에 도입된 유전자의 카피수를 확인할 수 있는 간단한 기술을 확립하였다. 8. 형질전환식물체를 대상으로 카로티노이드 조성을 분석한 결과, 카로티노이드 함량이 최고 2.7배까지 증가하였으며, 모본으로 사용한 비형질전환체에 존재하든 기존의 카로티노이드가 증가한 것을 확인하였다. 9. DPPH를 이용한 라디칼 소거능의 측정, DAB 염색법, MV처리 등에 의한
As an attempt to develop cash crops to cope with climate change at the arid regions in China, several transgenic lines accumulating carotenoids or keto-carotenoids were obtained through metabolic engineering technologies. To this end, the efficient transformation method was initially established usi...
As an attempt to develop cash crops to cope with climate change at the arid regions in China, several transgenic lines accumulating carotenoids or keto-carotenoids were obtained through metabolic engineering technologies. To this end, the efficient transformation method was initially established using one of the most popular cultivar, Solanum tuberosum L. cv. Atlantic and as a control, Jowon cultivar, of which highly efficient transformation method had been already available. For the metabolic engineering to increase the content of carotenoids or keto-carotenoids, genes involved in the carotenoid biosynthetic pathway were introduced into several other potato cultivars including Haryoung and Golden Valley under the strong promoters. The results on the characterization of those transgenic potato lines are summarized as follows : 1. The media containing glucose as a carbon source showed an increased transformation efficiency up to 16.3 to 18.4% on Jowon cultivar, but no such positive effect was examined on Atlantic cultivar. 2. It was found that a long period of in vitro culture could be a critical factor on the low transformation rate for a specific potato genotype, Solanum tuberosum L. cv. Atlantic when phosphinothricin (PPT) was used as a selective marker. Therefore, micro-tubers were obtained from Atlantic cultivar maintained in vitro, and replanted on the fresh media to get a fresh explant of the newly produced plants. As a result, the transformation efficiency was increased up to 4.3% suggesting that the Atlantic cultivar was highly vulnerable on the long period of in vitro culture. However, Jowon cultivar was not so much influenced by the period of in vitro culture with high transformation rate (higher than 10.0%). 3. To accumulate keto-carotenoids in potato, three different promoters, ibAGP (sucrose-inducible), storage root specific promoter (ibMADS) and CaMV35S promoter were hired to express the CrtO gene isolated from Haematococcus pulvialis and PAC (Psy+CrtI). The two genes were linked using a multiple gene expression system, 2A peptide. Initially, three different potato cultivars, Jowon, Haryoung and Golden Valley were used to introduce CrtO and PAC vector constructs. Several transformants were selected when screened by PCR with only one construct or co-transformants bearing both CrtO and PAC construct. However, very low frequency was examined for the construct of CaMV35S promoter compared with the other two promoters. 4. RT-PCR was used to examine the expression patterns of carotenogenesis-related genes including target genes, CrtO and PAC. As a result, the transcripts for CrtO and PAC were examined in all putative transformants and co-transformants. However, it was not found that the over-expression of those two gene constructs caused any significant effect on the expression level of carotenogenesis-related genes. 5. The compositional analysis for the keto-carotenoids indicated that astaxanthin was accumulated by the over-expression of CrtO gene, although the level was not very high in several transformants with Jowon cultivar. The transformants were 7 lines for ibAGP1+tp+CrtO, 4 lines for co-transformants bearing both ibAGP1+tp+CrtO and iBAGP1+PAC, 3 lines for co-transformants bearing both ibMADS+tp+CrtO and ibMADS+PAC. 6. Unfortunately, keto-carotenoids such as astaxanthin, adonirubin and echinenone were not detected at all in Haryoung and Golden Valley transgenic cultivars. These results were unexpected ones since the flesh-color of those two cultivars were more bright yellow and it was assumed to contain more amount of carotenoids than Jowon. 7. Although active transcription of CrtO and PAC genes were identified in those transgenic lines, it was found that no significant level of keto-carotenoids were accumulated. This finding was assumed to have resulted from a low level of precursors such as β-carotene for the conversion of keto-carotenoids. Therefore, IbOr gene isolated from sweetpotato was introduced to over-express by using SWPA2 promoter, a strong inducible promoter upon treatment with various environmental stresses and tuber-specific promoter, Patatin. Several transgenic lines were obtained for both constructs, 23 lines for SOR (SWAP2::IbOr) and 63 lines for POR (Patatin::IbOr), and their introduction in the genome and transcription was confirmed. Furthermore, by the genomic southern blot hybridization, transgenic lines containing only a single copy of recombinant T-DNA construct were also able to be identified. It was further confirmed by qRT-PCR based on the Urease gene as a control. 8. In consistent with previous study in sweet potato calli, the level of total carotenoid was elevated up to 2.7-fold (38.1 µg g-1DW) compared to nontransgenic control, Atlantic cultivar. However, the composition of carotenoid was not influenced by the overexpression of IbOr gene. The contents of the only pre-existing carotenoids in the non-transgenic control including violaxanthin, lutien and β-carotene were elevated. 9. The increased levels of carotenoid content in the leaf or tuber tissue of transgenic lines were correlated with the enhanced tolerance activity against salt- or MV-mediated oxidative stresses and DPPH radical-scavenging activity. In conclusion, our preliminary results confirmed that IbOr gene was able to accumulate carotenoids including violaxanthin, lutien and β-carotene, which were precursor compounds for the conversion of keto-carotenoids. This result suggests that co-transformation of IbOr and CrtO may produce more keto-carotenoids since it was found that in potato, the PAC construct, a multiple expression system with 2A peptide designed for the production of phytoene synthase and phytoene desaturase did not properly work. In addition, further studies with transgenic Atlantic cultivar bearing IbOr gene are definitely necessary. These include studies on agricultural characteristics, field tests, and more strong promoters for the mass producti
As an attempt to develop cash crops to cope with climate change at the arid regions in China, several transgenic lines accumulating carotenoids or keto-carotenoids were obtained through metabolic engineering technologies. To this end, the efficient transformation method was initially established using one of the most popular cultivar, Solanum tuberosum L. cv. Atlantic and as a control, Jowon cultivar, of which highly efficient transformation method had been already available. For the metabolic engineering to increase the content of carotenoids or keto-carotenoids, genes involved in the carotenoid biosynthetic pathway were introduced into several other potato cultivars including Haryoung and Golden Valley under the strong promoters. The results on the characterization of those transgenic potato lines are summarized as follows : 1. The media containing glucose as a carbon source showed an increased transformation efficiency up to 16.3 to 18.4% on Jowon cultivar, but no such positive effect was examined on Atlantic cultivar. 2. It was found that a long period of in vitro culture could be a critical factor on the low transformation rate for a specific potato genotype, Solanum tuberosum L. cv. Atlantic when phosphinothricin (PPT) was used as a selective marker. Therefore, micro-tubers were obtained from Atlantic cultivar maintained in vitro, and replanted on the fresh media to get a fresh explant of the newly produced plants. As a result, the transformation efficiency was increased up to 4.3% suggesting that the Atlantic cultivar was highly vulnerable on the long period of in vitro culture. However, Jowon cultivar was not so much influenced by the period of in vitro culture with high transformation rate (higher than 10.0%). 3. To accumulate keto-carotenoids in potato, three different promoters, ibAGP (sucrose-inducible), storage root specific promoter (ibMADS) and CaMV35S promoter were hired to express the CrtO gene isolated from Haematococcus pulvialis and PAC (Psy+CrtI). The two genes were linked using a multiple gene expression system, 2A peptide. Initially, three different potato cultivars, Jowon, Haryoung and Golden Valley were used to introduce CrtO and PAC vector constructs. Several transformants were selected when screened by PCR with only one construct or co-transformants bearing both CrtO and PAC construct. However, very low frequency was examined for the construct of CaMV35S promoter compared with the other two promoters. 4. RT-PCR was used to examine the expression patterns of carotenogenesis-related genes including target genes, CrtO and PAC. As a result, the transcripts for CrtO and PAC were examined in all putative transformants and co-transformants. However, it was not found that the over-expression of those two gene constructs caused any significant effect on the expression level of carotenogenesis-related genes. 5. The compositional analysis for the keto-carotenoids indicated that astaxanthin was accumulated by the over-expression of CrtO gene, although the level was not very high in several transformants with Jowon cultivar. The transformants were 7 lines for ibAGP1+tp+CrtO, 4 lines for co-transformants bearing both ibAGP1+tp+CrtO and iBAGP1+PAC, 3 lines for co-transformants bearing both ibMADS+tp+CrtO and ibMADS+PAC. 6. Unfortunately, keto-carotenoids such as astaxanthin, adonirubin and echinenone were not detected at all in Haryoung and Golden Valley transgenic cultivars. These results were unexpected ones since the flesh-color of those two cultivars were more bright yellow and it was assumed to contain more amount of carotenoids than Jowon. 7. Although active transcription of CrtO and PAC genes were identified in those transgenic lines, it was found that no significant level of keto-carotenoids were accumulated. This finding was assumed to have resulted from a low level of precursors such as β-carotene for the conversion of keto-carotenoids. Therefore, IbOr gene isolated from sweetpotato was introduced to over-express by using SWPA2 promoter, a strong inducible promoter upon treatment with various environmental stresses and tuber-specific promoter, Patatin. Several transgenic lines were obtained for both constructs, 23 lines for SOR (SWAP2::IbOr) and 63 lines for POR (Patatin::IbOr), and their introduction in the genome and transcription was confirmed. Furthermore, by the genomic southern blot hybridization, transgenic lines containing only a single copy of recombinant T-DNA construct were also able to be identified. It was further confirmed by qRT-PCR based on the Urease gene as a control. 8. In consistent with previous study in sweet potato calli, the level of total carotenoid was elevated up to 2.7-fold (38.1 µg g-1DW) compared to nontransgenic control, Atlantic cultivar. However, the composition of carotenoid was not influenced by the overexpression of IbOr gene. The contents of the only pre-existing carotenoids in the non-transgenic control including violaxanthin, lutien and β-carotene were elevated. 9. The increased levels of carotenoid content in the leaf or tuber tissue of transgenic lines were correlated with the enhanced tolerance activity against salt- or MV-mediated oxidative stresses and DPPH radical-scavenging activity. In conclusion, our preliminary results confirmed that IbOr gene was able to accumulate carotenoids including violaxanthin, lutien and β-carotene, which were precursor compounds for the conversion of keto-carotenoids. This result suggests that co-transformation of IbOr and CrtO may produce more keto-carotenoids since it was found that in potato, the PAC construct, a multiple expression system with 2A peptide designed for the production of phytoene synthase and phytoene desaturase did not properly work. In addition, further studies with transgenic Atlantic cultivar bearing IbOr gene are definitely necessary. These include studies on agricultural characteristics, field tests, and more strong promoters for the mass producti
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.