아프리카나 동남아시아 및 중남미 등 저개발 국가에서 발생하는 질병들을 소외질병으로 구분하는데, 약 10억명의 인구가 소외질병에 노출되어있고 매년 약 15만명이 사망하는 심각한 질환이다. 소외질환 중 기생충 질환인 수면병, 샤가스병, 리슈만편모충증은T. brucei T. cruzi, Leishmania에 의해 발병된다. 현재 사용되고 있는 치료제들은 효능이 현저히 떨어지거나, 세포 독성과 같은 부작용이 따르며, 몇몇의 지역에서 이미 치료제에 의한 내성에 의해 치료제 효능의 현격한 저하를 보인다. 따라서 소외질병의 신약 개발이 시급한 실정이다. 본 연구는 순/역화학 유전체학적 접근 방법을 통해 소외질병 치료에 효과적인 화합물을 발견하였다. 먼저 세포내 모델인 Leishmania, T. cruzi의 ...
아프리카나 동남아시아 및 중남미 등 저개발 국가에서 발생하는 질병들을 소외질병으로 구분하는데, 약 10억명의 인구가 소외질병에 노출되어있고 매년 약 15만명이 사망하는 심각한 질환이다. 소외질환 중 기생충 질환인 수면병, 샤가스병, 리슈만편모충증은T. brucei T. cruzi, Leishmania에 의해 발병된다. 현재 사용되고 있는 치료제들은 효능이 현저히 떨어지거나, 세포 독성과 같은 부작용이 따르며, 몇몇의 지역에서 이미 치료제에 의한 내성에 의해 치료제 효능의 현격한 저하를 보인다. 따라서 소외질병의 신약 개발이 시급한 실정이다. 본 연구는 순/역화학 유전체학적 접근 방법을 통해 소외질병 치료에 효과적인 화합물을 발견하였다. 먼저 세포내 모델인 Leishmania, T. cruzi의 바이오 이미징 기반 초고속 대용량 스크리닝 기술을 개발하였다. 초고속/대용량 에세이를 위해384 well 포멧화를 하였으며, 바이오 이미지 기반의 스크리닝을 위하여 자동화 공초점 현미경 시스템을 이용하였다. 세포내 Leishmania와 T. cruzi의 사멸을 확인하기 위해 DNA 염색을 이용하였고, 바이오 이미지 분석을 위한 알고리즘을 개발하여, 기생충의 사멸률을 측정할수 있게 하였다. 이 알고리즘 분석을 통하여, 얻을수 있는 정보는 세포의 기생충 감염율과, 생존 숙주세포의 개수, 생존 기생충 개수 등이며, 이를 통해 화합물의 기생충 사멸 정도 뿐만아니라 세포독성도 동시에 확인할수 있다. 또한 확립된 에세이의 유효성을 확인 하기 위해32개의 reference화합물의 효능 테스트를 하였고, 그 결과를 현재 소외질병 신약개발에 가장 일반적인 에세이의 결과와 비교분석을 통하여 개발된 에세이의 유효성을 확인하였다. 순화학 유전체학적 접근 방법을 통해서 T. brucei에 약 7.7nM의 유효값을 보이는 화합물을 선별하였으며, 세포독성 또한 보이지 않았다. 또한 질병감염 쥐모델에 선별화합물 3mg/kg로 4일 처리 했을때 100% 생존율을 보였다. 또한 복제 메카니즘 에세이를 실행했을때, 기생충의 핵에는 영향을 주지 않고, kinetoplast의 복제 메카니즘에 영향을 주는것으로 보아, kinetoplast의 복제메카니즘에 선별적 저해성을 보이는 것을 알수 있었다. 또한 에르고스테롤합성 대사 경로의 관련 유전자 중 하나인 FPPS의 발현을 억제하였으며, oxidative phosphorylation의 uncoupler로써 작용하였다. 또한 T. brucei 의 생존억제와 DNA ΔTm 수치와, T. brucei FPPS의 결합력 수치를 이용한 computational model을 통한 상관관계를 분석하였고, 이 두가지의 factor, 즉 복제메카니즘과, isoprenoid biosynthesis, 의 억제를 통해, T. brucei을 사멸에 이르게 하는것을 알수 있었다. 역화학 유전체학적 접근 방법을 통한 연구는 이전 보고된 연구를 통해 FPPS를 유효타겟으로 정하여 연구 진행하였다. FPPS를 억제하는 화합물을 선별하기 위해 타겟 기반 에세이를 개발하였고, 925개의prenyl synthase 타겟기반 라이브러리로 FPPS 억제테스트 하였다. 원만한 후속연구를 위해 같은 라이브러리를 세포기반T. brucei의 사멸테스트도 진행하였으며, 이 두 테스트에서 세포독성이 없는 약 52개의 화합물을 선별하였다. 이 중 가장 SI값이 높은 2개의 화합물을 선별하여 질병감염 쥐모델에 투여 결과, 약 16일의 생존율 증가를 보였다. 또한 발현된 TbFPPS의 구조연구를 통하여 lipophilic bisphosphonate과의 결합양상을 분석하였고, 등온적정형열량계 (isothermal titration calorimetry, ITC)를 통해 화합물과 단백질간의 결합력의 열량 분석하였다. 결론적으로, 순/역화학 유전체학적 접근 방법을 통한 신약개발을 통해 소외 질병의 작용하는 몇가지 화합물을 선별하였고, 선별화합물의 타겟에 대한 연구를 진행하였다. 또한 화합물의 후속연구 및 임상 가능성을 타진하기 위해 전임상 단계인 질병감염 모델에서의 효능도 확인 하였다. 결론적으로, 우리는 새로운 Leishmania, T. cruzi의 바이오 이미징 기반 고성능/초고속 (HCS/HTS) 대용량 스크리닝 기술을 개발하였고, 이 기술을 이용하여 기생충의 사멸 효과를 보이는 화합물을 발견하였다. 순/역학적 유전체학 접근법을 통하여, 선별한 화합물의 작용 메카니즘을 밝히고, kinetoplast나 FPPS 같은 새로운 타겟의 유효성을 확인 하였다. 마지막으로, 선별된 화합물의 질병감염 모델에서의 효능을 확인하여, 본 연구에 쓰인 접근법을 통해 얻어진 화합물의 소외질병의 신약화 가능성을 타진하였다.
아프리카나 동남아시아 및 중남미 등 저개발 국가에서 발생하는 질병들을 소외질병으로 구분하는데, 약 10억명의 인구가 소외질병에 노출되어있고 매년 약 15만명이 사망하는 심각한 질환이다. 소외질환 중 기생충 질환인 수면병, 샤가스병, 리슈만편모충증은T. brucei T. cruzi, Leishmania에 의해 발병된다. 현재 사용되고 있는 치료제들은 효능이 현저히 떨어지거나, 세포 독성과 같은 부작용이 따르며, 몇몇의 지역에서 이미 치료제에 의한 내성에 의해 치료제 효능의 현격한 저하를 보인다. 따라서 소외질병의 신약 개발이 시급한 실정이다. 본 연구는 순/역화학 유전체학적 접근 방법을 통해 소외질병 치료에 효과적인 화합물을 발견하였다. 먼저 세포내 모델인 Leishmania, T. cruzi의 바이오 이미징 기반 초고속 대용량 스크리닝 기술을 개발하였다. 초고속/대용량 에세이를 위해384 well 포멧화를 하였으며, 바이오 이미지 기반의 스크리닝을 위하여 자동화 공초점 현미경 시스템을 이용하였다. 세포내 Leishmania와 T. cruzi의 사멸을 확인하기 위해 DNA 염색을 이용하였고, 바이오 이미지 분석을 위한 알고리즘을 개발하여, 기생충의 사멸률을 측정할수 있게 하였다. 이 알고리즘 분석을 통하여, 얻을수 있는 정보는 세포의 기생충 감염율과, 생존 숙주세포의 개수, 생존 기생충 개수 등이며, 이를 통해 화합물의 기생충 사멸 정도 뿐만아니라 세포독성도 동시에 확인할수 있다. 또한 확립된 에세이의 유효성을 확인 하기 위해32개의 reference화합물의 효능 테스트를 하였고, 그 결과를 현재 소외질병 신약개발에 가장 일반적인 에세이의 결과와 비교분석을 통하여 개발된 에세이의 유효성을 확인하였다. 순화학 유전체학적 접근 방법을 통해서 T. brucei에 약 7.7nM의 유효값을 보이는 화합물을 선별하였으며, 세포독성 또한 보이지 않았다. 또한 질병감염 쥐모델에 선별화합물 3mg/kg로 4일 처리 했을때 100% 생존율을 보였다. 또한 복제 메카니즘 에세이를 실행했을때, 기생충의 핵에는 영향을 주지 않고, kinetoplast의 복제 메카니즘에 영향을 주는것으로 보아, kinetoplast의 복제메카니즘에 선별적 저해성을 보이는 것을 알수 있었다. 또한 에르고스테롤 합성 대사 경로의 관련 유전자 중 하나인 FPPS의 발현을 억제하였으며, oxidative phosphorylation의 uncoupler로써 작용하였다. 또한 T. brucei 의 생존억제와 DNA ΔTm 수치와, T. brucei FPPS의 결합력 수치를 이용한 computational model을 통한 상관관계를 분석하였고, 이 두가지의 factor, 즉 복제메카니즘과, isoprenoid biosynthesis, 의 억제를 통해, T. brucei을 사멸에 이르게 하는것을 알수 있었다. 역화학 유전체학적 접근 방법을 통한 연구는 이전 보고된 연구를 통해 FPPS를 유효타겟으로 정하여 연구 진행하였다. FPPS를 억제하는 화합물을 선별하기 위해 타겟 기반 에세이를 개발하였고, 925개의prenyl synthase 타겟기반 라이브러리로 FPPS 억제테스트 하였다. 원만한 후속연구를 위해 같은 라이브러리를 세포기반T. brucei의 사멸테스트도 진행하였으며, 이 두 테스트에서 세포독성이 없는 약 52개의 화합물을 선별하였다. 이 중 가장 SI값이 높은 2개의 화합물을 선별하여 질병감염 쥐모델에 투여 결과, 약 16일의 생존율 증가를 보였다. 또한 발현된 TbFPPS의 구조연구를 통하여 lipophilic bisphosphonate과의 결합양상을 분석하였고, 등온적정형열량계 (isothermal titration calorimetry, ITC)를 통해 화합물과 단백질간의 결합력의 열량 분석하였다. 결론적으로, 순/역화학 유전체학적 접근 방법을 통한 신약개발을 통해 소외 질병의 작용하는 몇가지 화합물을 선별하였고, 선별화합물의 타겟에 대한 연구를 진행하였다. 또한 화합물의 후속연구 및 임상 가능성을 타진하기 위해 전임상 단계인 질병감염 모델에서의 효능도 확인 하였다. 결론적으로, 우리는 새로운 Leishmania, T. cruzi의 바이오 이미징 기반 고성능/초고속 (HCS/HTS) 대용량 스크리닝 기술을 개발하였고, 이 기술을 이용하여 기생충의 사멸 효과를 보이는 화합물을 발견하였다. 순/역학적 유전체학 접근법을 통하여, 선별한 화합물의 작용 메카니즘을 밝히고, kinetoplast나 FPPS 같은 새로운 타겟의 유효성을 확인 하였다. 마지막으로, 선별된 화합물의 질병감염 모델에서의 효능을 확인하여, 본 연구에 쓰인 접근법을 통해 얻어진 화합물의 소외질병의 신약화 가능성을 타진하였다.
Neglected tropical diseases (NTDs) are a group of parasite and bacteria infections affecting over a billion people in under development countries. Among them, protozoan parasites such as Trypanosoma brucei (T. brucei), Trypanosoma cruzi (T. cruzi), and Leishmania donovani (L. donovani), are causativ...
Neglected tropical diseases (NTDs) are a group of parasite and bacteria infections affecting over a billion people in under development countries. Among them, protozoan parasites such as Trypanosoma brucei (T. brucei), Trypanosoma cruzi (T. cruzi), and Leishmania donovani (L. donovani), are causative agents for NTDs such as sleeping sickness, chargas disease, and leishmaniasis. Drugs available for the treatments for these NTDs are often inadequate, and are further limited by serious side effects, parasite resistance or high costs. Therefore, driven by this need for new drugs to treat NTDs infections, we have applied forward and reverse chemical genomics approach, to discover novel inhibitors and validate new drug targets for next generation NTD drug discovery. For the initial forward genomic approach, we developed a high-content, high-throughput image-based screening assay targeting the intracellular amastigote stage of different species of Leishmania and T. cruzi, which mimics the physiological infection in human. The in vitro infection protocol was adapted to a 384-well-plate format, enabling the acquisition of a large amount of readouts by automated confocal microscopy. The reading method was based on DNA staining and required the development of a customized algorithm to analyze the images, enabling the use of non-modified parasites. The automated analysis generated parameters for quantifying compound activity, including the infection ratio as well as the number of intracellular amastigote parasites. Our results yielded cytotoxicity information based on the number of host cells. Moreover, to validate the assay we developed, results of widely used colorimetric and image-based intracellular T. cruzi assay protocols were compared by testing 32 reference compounds. The two assays had a very poor correlation of R2 = 0.005 based on EC50 values. Further modifications were then made to the experimental procedures to demonstrate that the seeding scheme and incubation time of cells and compounds are critical for determining the potency and efficacy of compounds against T. cruzi. Through this development of novel assay platform, we were able to resolve and overcome the limitations of pre-existing cell-based assays for Trypanosoma parasites. Next, as a part of the forward chemical genomic approach, we screened a set of diamidine compounds against T. brucei cell growth and found the most active compound to be biphenyldiamidine with an EC50 of 7.7 nM. There was low toxicity observed against two human cell lines (HepG2 & HEK239T) with a CC50 > 100 μM. A promising in vivo efficacy was also observed in a T. brucei infected mouse model with 100% survival at 3 mg/kg by intraperitoneal (i.p.) injection. Our most potent lead blocked the replication of kinetoplast DNA (k-DNA), but not nuclear DNA, in the parasite. Some compounds also inhibited T. brucei farnesyl diphosphate synthase (TbFPPS), and some were uncouplers of oxidative phosphorylation. Furthermore, we developed a computational model for T. brucei cell growth inhibition (R2 = 0.76) using DNA ΔTm values for inhibitor binding combined with TbFPPS IC50 values. Overall, our results suggest the possibility of developing multitarget drug leads against T. brucei that act by inhibiting both k-DNA replication as well as isoprenoid biosynthesis. For a reverse chemical genomic approach, we have attempted to reposition osteoporosis drugs, bisphosphonates, to use as inhibitors for T. brucei infection, we first developed an assay targeting TbFPPS and screened a library of 925 potential prenyl synthase inhibitors containing a series of bisphosphonate. We also simultaneously tested this library against T. brucei to select inhibitors that are both active at cellular and enzyme level. Interestingly, the most potent compounds were lipophilic analogs of the bone-resorption drug, zoledronate, some of which had sub-micromolar to low micromolar activity against the bloodstream form of T. brucei with selectivity indices of up to ~300. We further evaluated the effects of two inhibitors (37, 51) on survival and parasitemia in a T. brucei mouse model of infection and found that survival increased by up to 16 days. Next, we determined the binding mode of three lipophilic bisphosphonates to TbFPPS using crystallography, and also evaluated the thermodynamics of bindings using isothermal titration calorimetry (ITC). In conclusion, we have developmed novel high content assay for Trypanosoma and Leishmania infection and identified inhibitors against the parasites. Through forward and reverse chemical genomics approach, we have also elucidated the mechanism of action of identified inhibitors and validated novel drug targets such as kinetoplast and FPPS of the parasites. Lastely, identified inhibitors were tested in mouse model for proof of concept study to open up new opportunity for NTDs drug discovery.
Neglected tropical diseases (NTDs) are a group of parasite and bacteria infections affecting over a billion people in under development countries. Among them, protozoan parasites such as Trypanosoma brucei (T. brucei), Trypanosoma cruzi (T. cruzi), and Leishmania donovani (L. donovani), are causative agents for NTDs such as sleeping sickness, chargas disease, and leishmaniasis. Drugs available for the treatments for these NTDs are often inadequate, and are further limited by serious side effects, parasite resistance or high costs. Therefore, driven by this need for new drugs to treat NTDs infections, we have applied forward and reverse chemical genomics approach, to discover novel inhibitors and validate new drug targets for next generation NTD drug discovery. For the initial forward genomic approach, we developed a high-content, high-throughput image-based screening assay targeting the intracellular amastigote stage of different species of Leishmania and T. cruzi, which mimics the physiological infection in human. The in vitro infection protocol was adapted to a 384-well-plate format, enabling the acquisition of a large amount of readouts by automated confocal microscopy. The reading method was based on DNA staining and required the development of a customized algorithm to analyze the images, enabling the use of non-modified parasites. The automated analysis generated parameters for quantifying compound activity, including the infection ratio as well as the number of intracellular amastigote parasites. Our results yielded cytotoxicity information based on the number of host cells. Moreover, to validate the assay we developed, results of widely used colorimetric and image-based intracellular T. cruzi assay protocols were compared by testing 32 reference compounds. The two assays had a very poor correlation of R2 = 0.005 based on EC50 values. Further modifications were then made to the experimental procedures to demonstrate that the seeding scheme and incubation time of cells and compounds are critical for determining the potency and efficacy of compounds against T. cruzi. Through this development of novel assay platform, we were able to resolve and overcome the limitations of pre-existing cell-based assays for Trypanosoma parasites. Next, as a part of the forward chemical genomic approach, we screened a set of diamidine compounds against T. brucei cell growth and found the most active compound to be biphenyldiamidine with an EC50 of 7.7 nM. There was low toxicity observed against two human cell lines (HepG2 & HEK239T) with a CC50 > 100 μM. A promising in vivo efficacy was also observed in a T. brucei infected mouse model with 100% survival at 3 mg/kg by intraperitoneal (i.p.) injection. Our most potent lead blocked the replication of kinetoplast DNA (k-DNA), but not nuclear DNA, in the parasite. Some compounds also inhibited T. brucei farnesyl diphosphate synthase (TbFPPS), and some were uncouplers of oxidative phosphorylation. Furthermore, we developed a computational model for T. brucei cell growth inhibition (R2 = 0.76) using DNA ΔTm values for inhibitor binding combined with TbFPPS IC50 values. Overall, our results suggest the possibility of developing multitarget drug leads against T. brucei that act by inhibiting both k-DNA replication as well as isoprenoid biosynthesis. For a reverse chemical genomic approach, we have attempted to reposition osteoporosis drugs, bisphosphonates, to use as inhibitors for T. brucei infection, we first developed an assay targeting TbFPPS and screened a library of 925 potential prenyl synthase inhibitors containing a series of bisphosphonate. We also simultaneously tested this library against T. brucei to select inhibitors that are both active at cellular and enzyme level. Interestingly, the most potent compounds were lipophilic analogs of the bone-resorption drug, zoledronate, some of which had sub-micromolar to low micromolar activity against the bloodstream form of T. brucei with selectivity indices of up to ~300. We further evaluated the effects of two inhibitors (37, 51) on survival and parasitemia in a T. brucei mouse model of infection and found that survival increased by up to 16 days. Next, we determined the binding mode of three lipophilic bisphosphonates to TbFPPS using crystallography, and also evaluated the thermodynamics of bindings using isothermal titration calorimetry (ITC). In conclusion, we have developmed novel high content assay for Trypanosoma and Leishmania infection and identified inhibitors against the parasites. Through forward and reverse chemical genomics approach, we have also elucidated the mechanism of action of identified inhibitors and validated novel drug targets such as kinetoplast and FPPS of the parasites. Lastely, identified inhibitors were tested in mouse model for proof of concept study to open up new opportunity for NTDs drug discovery.
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