바이오 의약품 생산을 위한 세포주 개발에서 우선적인 고려사항은 숙주세포 선정 및 발현벡터 제작이다. Chinese hamster ovary(CHO) 세포는 당화를 효과적으로 진행하고 생산공정개발이 용이하여 널리 이용되는 숙주세포이다. 생산 세포주 확립을 위해서는 세포 내 도입된 유전자가 높은 생산성(productivity)과 안정성(stability)을 유지해야 한다. 그러나 CHO 세포와 같은 ...
바이오 의약품 생산을 위한 세포주 개발에서 우선적인 고려사항은 숙주세포 선정 및 발현벡터 제작이다. Chinese hamster ovary(CHO) 세포는 당화를 효과적으로 진행하고 생산공정개발이 용이하여 널리 이용되는 숙주세포이다. 생산 세포주 확립을 위해서는 세포 내 도입된 유전자가 높은 생산성(productivity)과 안정성(stability)을 유지해야 한다. 그러나 CHO 세포와 같은 동물세포 내 발현벡터 도입은 염색질에 무작위적 삽입으로 인해 발생하는 위치 효과의 영향을 받게 된다. 또한 유전자 증폭 기술을 이용하여 해당 유전자의 수를 증가시킬 경우 다양한 특성을 지닌 세포들이 생성된다. 이러한 세포주 제작 단계에서 발생하는 문제점을 극복하기 위해 발현벡터의 제작(vector engineering) 및 세포 선별 기술이 발달했다. 발현벡터의 구성은 일차적으로 목적 단백질의 생산량과 연관이 있고, 세포 내 염색질에 도입되는 방식이나 도입된 위치적 영향에 대한 조절을 가능하게 한다. 또한 세포 선별 및 유전자 증폭 방식까지 결정하므로 세포주 개발에 직간접적인 영향력을 지닌다. 본 연구에서는 발현벡터 엔지니어링에 초점을 맞추어 CHO 세포에서의 재조합 단백질 생산성 및 세포주 개발의 효율을 증진시키고자 하였다. Gene regulatory element는 도입된 유전자를 위치 효과에 의한 영향에서 보호하고 발현을 증진시키는 요소로 이용된다. CHO 세포에서 신규 조절인자 획득을 위해 게놈 라이브러리를 구성하고 스크리닝을 통해 E77 인자를 획득하였다. E77을 포함한 벡터를 세포에 도입한 결과 대조군에 비해 green fluorescent protein(GFP) 발현이 2배 가량, 항체 발현이 5배 가량 증진하였으며 도입된 유전자의 안정성도 향상시켰다. CHO 세포 유래 신규 조절인자는 기존 인자와 같이 안정적인 고생산성 세포주 개발에 이용 가능할 것으로 예상된다. Dihydrofolate reductase(DHFR)/methotrexate(MTX) 유전자 증폭 시스템은 단위세포 당 생산량을 증진시키는 방법으로, DHFR 유전자가 결여된 CHO-DG44, CHO-DXB11을 숙주세포로 이용한다. 이 시스템을 DHFR 유전자를 보유한 CHO-K1 세포에서 이용하기 위해 세포 내 DHFR 유전자의 3′-untranslated region(UTR)을 억제하는 short hairpin RNA(shRNA)를 제작하고 이를 erythropoietin(EPO) 및 DHFR 발현벡터에 도입하여 벡터를 구축하였다. shRNA가 포함된 벡터를 도입한 안정적 세포군에서 유전자 증폭이 진행될수록 EPO의 비생산량(qEPO, specific productivity)이 크게 증가하였다. 500 nM MTX 처리 후 생성된 세포군의 qEPO는 대조군 대비 2.5배 증가했고 이는 DHFR의 mRNA 발현 및 유전자 카피 수와 연관이 있음을 확인하였다. 유전자 증폭을 위한 선별 마커의 3′-UTR를 타겟으로 하는 shRNA의 벡터 내 도입은 다른 종류의 세포 및 유전자 증폭 시스템에도 이용 가능할 것으로 예상된다. 선별된 세포군의 expression heterogeneity는 발현벡터 도입 방식에 따라 달라진다. 선별 마커는 벡터 내에서 목적 단백질과 개별적인 promoter나 internal ribosome entry site(IRES)에 의해 발현되는데, 선별 마커의 발현 방식 차이가 무작위적 삽입에서 expression heterogeneity에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다. 개별 프로모터에 의한 선별 마커 발현은 다양한 발현 양상을 보였으나, IRES에 의한 선별 마커 발현은 일정한 발현 양상을 나타냈다. 이는 목적 유전자를 발현하는 세포의 비율에 의한 것이며 전체 세포군의 단백질 발현량이 transcription level과 높은 상관관계가 있음을 확인하였다. IRES 기반의 선별 마커 발현 벡터는 무작위적 삽입 방식을 통한 안정적 세포군에서 특정 요소의 비교 연구에 이용 가능할 것으로 예상된다.
바이오 의약품 생산을 위한 세포주 개발에서 우선적인 고려사항은 숙주세포 선정 및 발현벡터 제작이다. Chinese hamster ovary(CHO) 세포는 당화를 효과적으로 진행하고 생산공정개발이 용이하여 널리 이용되는 숙주세포이다. 생산 세포주 확립을 위해서는 세포 내 도입된 유전자가 높은 생산성(productivity)과 안정성(stability)을 유지해야 한다. 그러나 CHO 세포와 같은 동물세포 내 발현벡터 도입은 염색질에 무작위적 삽입으로 인해 발생하는 위치 효과의 영향을 받게 된다. 또한 유전자 증폭 기술을 이용하여 해당 유전자의 수를 증가시킬 경우 다양한 특성을 지닌 세포들이 생성된다. 이러한 세포주 제작 단계에서 발생하는 문제점을 극복하기 위해 발현벡터의 제작(vector engineering) 및 세포 선별 기술이 발달했다. 발현벡터의 구성은 일차적으로 목적 단백질의 생산량과 연관이 있고, 세포 내 염색질에 도입되는 방식이나 도입된 위치적 영향에 대한 조절을 가능하게 한다. 또한 세포 선별 및 유전자 증폭 방식까지 결정하므로 세포주 개발에 직간접적인 영향력을 지닌다. 본 연구에서는 발현벡터 엔지니어링에 초점을 맞추어 CHO 세포에서의 재조합 단백질 생산성 및 세포주 개발의 효율을 증진시키고자 하였다. Gene regulatory element는 도입된 유전자를 위치 효과에 의한 영향에서 보호하고 발현을 증진시키는 요소로 이용된다. CHO 세포에서 신규 조절인자 획득을 위해 게놈 라이브러리를 구성하고 스크리닝을 통해 E77 인자를 획득하였다. E77을 포함한 벡터를 세포에 도입한 결과 대조군에 비해 green fluorescent protein(GFP) 발현이 2배 가량, 항체 발현이 5배 가량 증진하였으며 도입된 유전자의 안정성도 향상시켰다. CHO 세포 유래 신규 조절인자는 기존 인자와 같이 안정적인 고생산성 세포주 개발에 이용 가능할 것으로 예상된다. Dihydrofolate reductase(DHFR)/methotrexate(MTX) 유전자 증폭 시스템은 단위세포 당 생산량을 증진시키는 방법으로, DHFR 유전자가 결여된 CHO-DG44, CHO-DXB11을 숙주세포로 이용한다. 이 시스템을 DHFR 유전자를 보유한 CHO-K1 세포에서 이용하기 위해 세포 내 DHFR 유전자의 3′-untranslated region(UTR)을 억제하는 short hairpin RNA(shRNA)를 제작하고 이를 erythropoietin(EPO) 및 DHFR 발현벡터에 도입하여 벡터를 구축하였다. shRNA가 포함된 벡터를 도입한 안정적 세포군에서 유전자 증폭이 진행될수록 EPO의 비생산량(qEPO, specific productivity)이 크게 증가하였다. 500 nM MTX 처리 후 생성된 세포군의 qEPO는 대조군 대비 2.5배 증가했고 이는 DHFR의 mRNA 발현 및 유전자 카피 수와 연관이 있음을 확인하였다. 유전자 증폭을 위한 선별 마커의 3′-UTR를 타겟으로 하는 shRNA의 벡터 내 도입은 다른 종류의 세포 및 유전자 증폭 시스템에도 이용 가능할 것으로 예상된다. 선별된 세포군의 expression heterogeneity는 발현벡터 도입 방식에 따라 달라진다. 선별 마커는 벡터 내에서 목적 단백질과 개별적인 promoter나 internal ribosome entry site(IRES)에 의해 발현되는데, 선별 마커의 발현 방식 차이가 무작위적 삽입에서 expression heterogeneity에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다. 개별 프로모터에 의한 선별 마커 발현은 다양한 발현 양상을 보였으나, IRES에 의한 선별 마커 발현은 일정한 발현 양상을 나타냈다. 이는 목적 유전자를 발현하는 세포의 비율에 의한 것이며 전체 세포군의 단백질 발현량이 transcription level과 높은 상관관계가 있음을 확인하였다. IRES 기반의 선별 마커 발현 벡터는 무작위적 삽입 방식을 통한 안정적 세포군에서 특정 요소의 비교 연구에 이용 가능할 것으로 예상된다.
Background: Vector engineering is the first step to develop cell lines for production of recombinant therapeutic proteins. In this study, elements of mammalian expression vector were investigated to improve cellular productivity and transgene stability in Chinese hamster ovary (CHO) cells. Methods: ...
Background: Vector engineering is the first step to develop cell lines for production of recombinant therapeutic proteins. In this study, elements of mammalian expression vector were investigated to improve cellular productivity and transgene stability in Chinese hamster ovary (CHO) cells. Methods: A genomic DNA library was constructed in green fluorescent protein (GFP) and screened to identify novel DNA regulatory element from CHO cells. Short hairpin RNA (shRNA) targeting the 3′-untranslated region of endogenous dihydrofolate reductase (DHFR) gene was contained in a plasmid vector, which express erythropoietin (EPO) and DHFR, and introduced into wild-type CHO cells. Stable cell pools expressing GFP were generated by transfection of a dual promoter vector or a bicistronic vector. Results: A novel regulatory DNA element (E77) was isolated and identified from CHO-K1 genomic DNA. E77-containing expression vector increased GFP and antibody expression levels in CHO cells and maintained the transgene stability upon removal of selection pressure. An expression vector including shRNA enhanced the transgene amplification rate and specific EPO productivity in wild-type CHO cells. Methods of expressing the selection marker gene affected expression heterogeneity in stable polyclonal cell populations. Unlike a dual promoter vector, a bicistronic vector generated only GFP-positive cells. Conclusion: Three vector engineering methodologies were investigated to improve the productivity, transgene stability, and expression homogeneity in stable CHO cells. These approaches may be applied to develop stable mammalian cell lines for biopharmaceutical production.
Background: Vector engineering is the first step to develop cell lines for production of recombinant therapeutic proteins. In this study, elements of mammalian expression vector were investigated to improve cellular productivity and transgene stability in Chinese hamster ovary (CHO) cells. Methods: A genomic DNA library was constructed in green fluorescent protein (GFP) and screened to identify novel DNA regulatory element from CHO cells. Short hairpin RNA (shRNA) targeting the 3′-untranslated region of endogenous dihydrofolate reductase (DHFR) gene was contained in a plasmid vector, which express erythropoietin (EPO) and DHFR, and introduced into wild-type CHO cells. Stable cell pools expressing GFP were generated by transfection of a dual promoter vector or a bicistronic vector. Results: A novel regulatory DNA element (E77) was isolated and identified from CHO-K1 genomic DNA. E77-containing expression vector increased GFP and antibody expression levels in CHO cells and maintained the transgene stability upon removal of selection pressure. An expression vector including shRNA enhanced the transgene amplification rate and specific EPO productivity in wild-type CHO cells. Methods of expressing the selection marker gene affected expression heterogeneity in stable polyclonal cell populations. Unlike a dual promoter vector, a bicistronic vector generated only GFP-positive cells. Conclusion: Three vector engineering methodologies were investigated to improve the productivity, transgene stability, and expression homogeneity in stable CHO cells. These approaches may be applied to develop stable mammalian cell lines for biopharmaceutical production.
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