Bacillus subtilis C14-2 균주가 생산하는 혈전분해효소의 발효최적화, 분리 정제 및 특성분석 Optimization of Fermentation, Separation and Characterization of Thrombolytic Enzyme Produced by Bacillus subtilis C14-2 Strain원문보기
청국장으로부터 혈전분해 활성이 우수한 균주를 선별·동정하였으며, 이를 B. subtilis C14-2로 명명하였다. 최적 배양 조건은 탄소원 1% lactose, 질소원 1% yeast extract로 투입하였으며, 무기염의 투입은 제외하였다. seed 배지에서 12시간, 50 L 발효 12시간, 1000 L 발효 4시간, 배양온도 37℃로 실시하였으며, 1톤 발효 후 얻은 발효액 350 L에서 배양액만 얻어 ...
청국장으로부터 혈전분해 활성이 우수한 균주를 선별·동정하였으며, 이를 B. subtilis C14-2로 명명하였다. 최적 배양 조건은 탄소원 1% lactose, 질소원 1% yeast extract로 투입하였으며, 무기염의 투입은 제외하였다. seed 배지에서 12시간, 50 L 발효 12시간, 1000 L 발효 4시간, 배양온도 37℃로 실시하였으며, 1톤 발효 후 얻은 발효액 350 L에서 배양액만 얻어 동결건조 실시 후 최종 5 kg의 건조물을 얻었다. 혈전분해효소를 분리 및 정제한 결과, 20.71 배의 정제도와 0.9 %의 수율을 나타냈으며, 혈전분해효소의 분자량은 SDS-PAGE에 기초하여 약 23.5 kDa이었다. 정제한 혈전분해 효소단백질의 N- 말단 아미노산 서열은 AQSVPYGISQIKAPALHSQGY로 분석되었다. C14-2에 의한 피브린 분해 활성은 플라스민(plasmin)보다 더 강했으며, 피브리노겐의 Aβ 및 Bβ 사슬을 가수 분해하였으나, γ 사슬을 절단하지는 않았다. 혈전분해효소의 최적 반응 온도 및 pH는 35∼50℃, pH 5-7 에서 활성을 보였으며, 40℃와 pH 6에서 최대 활성을 보였다. 온도 및 pH 안정성은 각각 35℃, pH 5.5-8에서 안정한 것을 확인하였다. 무기염에 대한 영향은 Ca2+ 와 Mg2+을 첨가하였을 때 활성이 증가되었으며, 저해제는 EDTA와 PMSF에 의해 활성이 강하게 억제되어 혈전분해효소가 serine metalloprotease임을 나타내었다. 또한, 유기용매와 계면활성제에 의한 영향은 2.5%(v/v)에서 각각 아세톤과 triton x-100, tween 20에 의해 활성이 저해되었으며, 5-10%(v/v)의 높은 농도에서는 모두 활성이 저해됨을 확인할 수 있었다.
청국장으로부터 혈전분해 활성이 우수한 균주를 선별·동정하였으며, 이를 B. subtilis C14-2로 명명하였다. 최적 배양 조건은 탄소원 1% lactose, 질소원 1% yeast extract로 투입하였으며, 무기염의 투입은 제외하였다. seed 배지에서 12시간, 50 L 발효 12시간, 1000 L 발효 4시간, 배양온도 37℃로 실시하였으며, 1톤 발효 후 얻은 발효액 350 L에서 배양액만 얻어 동결건조 실시 후 최종 5 kg의 건조물을 얻었다. 혈전분해효소를 분리 및 정제한 결과, 20.71 배의 정제도와 0.9 %의 수율을 나타냈으며, 혈전분해효소의 분자량은 SDS-PAGE에 기초하여 약 23.5 kDa이었다. 정제한 혈전분해 효소단백질의 N- 말단 아미노산 서열은 AQSVPYGISQIKAPALHSQGY로 분석되었다. C14-2에 의한 피브린 분해 활성은 플라스민(plasmin)보다 더 강했으며, 피브리노겐의 Aβ 및 Bβ 사슬을 가수 분해하였으나, γ 사슬을 절단하지는 않았다. 혈전분해효소의 최적 반응 온도 및 pH는 35∼50℃, pH 5-7 에서 활성을 보였으며, 40℃와 pH 6에서 최대 활성을 보였다. 온도 및 pH 안정성은 각각 35℃, pH 5.5-8에서 안정한 것을 확인하였다. 무기염에 대한 영향은 Ca2+ 와 Mg2+을 첨가하였을 때 활성이 증가되었으며, 저해제는 EDTA와 PMSF에 의해 활성이 강하게 억제되어 혈전분해효소가 serine metalloprotease임을 나타내었다. 또한, 유기용매와 계면활성제에 의한 영향은 2.5%(v/v)에서 각각 아세톤과 triton x-100, tween 20에 의해 활성이 저해되었으며, 5-10%(v/v)의 높은 농도에서는 모두 활성이 저해됨을 확인할 수 있었다.
A strain with excellent thrombolytic activity was selected and identified from the chungkukjang and named B. subtilis C14-2. Optimal culture conditions were 1% lactose carbon source, 1% yeast extract, and inorganic salts were excluded. The fermentation broth was fermented at 350 L for 1h, fermented ...
A strain with excellent thrombolytic activity was selected and identified from the chungkukjang and named B. subtilis C14-2. Optimal culture conditions were 1% lactose carbon source, 1% yeast extract, and inorganic salts were excluded. The fermentation broth was fermented at 350 L for 1h, fermented for 12hrs, 50 L fermentation for 12hrs, and fermented at 1000 L for 4hrs. Separation and purification of thrombolytic enzyme showed 20.71 fold purification and yield of 0.9%. The molecular weight of thrombolytic enzyme was about 23.5 kDa based on SDS-PAGE. The N-terminal amino acid sequence of the purified thrombolytic protein was analyzed as AQSVPYGISQIKAPALHSQGY. The fibrin degrading activity by C14-2 was stronger than that of plasmin and hydrolyzed the Aβ and Bβ chains of fibrinogen, but not the γ chain. The optimal reaction temperature and pH of thrombolytic enzyme were 35~50℃, pH 5-7, and maximum activity at 40℃ and pH 6. The temperature and pH stability were stable at 35℃ and pH 5.5-8, respectively. The activity of inorganic salt was increased when Ca2+ and Mg2+ were added, and the inhibitor was strongly inhibited by EDTA and PMSF, indicating that thrombolytic enzyme was serine metalloprotease. In addition, the effect of organic solvent and surfactant was inhibited by acetone, triton x-100, and tween 20 at 2.5%(v/v), respectively. At high concentrations of 5-10%(v/v) it was confirmed that the activity was inhibited.
A strain with excellent thrombolytic activity was selected and identified from the chungkukjang and named B. subtilis C14-2. Optimal culture conditions were 1% lactose carbon source, 1% yeast extract, and inorganic salts were excluded. The fermentation broth was fermented at 350 L for 1h, fermented for 12hrs, 50 L fermentation for 12hrs, and fermented at 1000 L for 4hrs. Separation and purification of thrombolytic enzyme showed 20.71 fold purification and yield of 0.9%. The molecular weight of thrombolytic enzyme was about 23.5 kDa based on SDS-PAGE. The N-terminal amino acid sequence of the purified thrombolytic protein was analyzed as AQSVPYGISQIKAPALHSQGY. The fibrin degrading activity by C14-2 was stronger than that of plasmin and hydrolyzed the Aβ and Bβ chains of fibrinogen, but not the γ chain. The optimal reaction temperature and pH of thrombolytic enzyme were 35~50℃, pH 5-7, and maximum activity at 40℃ and pH 6. The temperature and pH stability were stable at 35℃ and pH 5.5-8, respectively. The activity of inorganic salt was increased when Ca2+ and Mg2+ were added, and the inhibitor was strongly inhibited by EDTA and PMSF, indicating that thrombolytic enzyme was serine metalloprotease. In addition, the effect of organic solvent and surfactant was inhibited by acetone, triton x-100, and tween 20 at 2.5%(v/v), respectively. At high concentrations of 5-10%(v/v) it was confirmed that the activity was inhibited.
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